猪CD40Ldimer融合蛋白及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪CD40Ldimer融合蛋白及其编码基因，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明所述的所述的猪CD40Ldimer融合蛋白利用Pichiapastoris高效的外源蛋白表达、易于大规模培养、培养基价格低廉、易纯化并能够对表达的蛋白进行转录后修饰等优点，以Pichiapastoris表达重组可溶性猪CD40Ldimer，为其作为疫苗佐剂的研究提供充足的原材料。
【专利说明】猪CD40Ldimer融合蛋白及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪⑶40Ldimer融合蛋白及其编码基因。
【背景技术】
[0002]⑶40配体(⑶40LXD154)，属于TNF家族的一员，是一个II型跨膜糖蛋白，主要表达在活化的⑶4+ T细胞、一小部分⑶8+ T细胞和血小板上。⑶40L可能以异源二聚体复合物的形式表达，并被金属蛋白酶从跨膜蛋白上分离下来。可溶性CD40L像细胞因子一样与⑶40结合后传递生物信号。⑶40和⑶40L的相互作用可以激活抗原呈递细胞和T细胞，转化抗体亚型，并促进生发中心形成。此外，它们能够活化细胞毒性T细胞，降低免疫抑制，调节肿瘤细胞的生存并将与肿瘤相关性抗原呈递给免疫系统。
[0003]⑶40-⑶40L的相互作用在获得性免疫中的重要作用表明，⑶40L有可能作为一个潜在的疫苗佐剂来提高疫苗的免疫效果。将CD40L作为疫苗佐剂应考虑其生产成本和生产水平，但从组织提取和化学合成的方法获得CD40L的成本高且产量低，不能满足其作为疫苗佐剂的需求。
【发明内容】
[0004]本发明为了解决从组织提取和化学合成的方法获得CD40L的成本高且产量低，不能满足其作为疫苗佐剂的需求的问题，提供了一种猪CD40L融合蛋白及其编码基因。 [0005]本发明是通过以下技术方案实现的:猪⑶40Ldimer融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0006]所述猪⑶40Ldimer融合蛋白的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]本发明所述融合蛋白的编码基因是由猪⑶40Ldimer的cDNA序列、6个组氨酸cDNA序列和限制性内切酶Xho I和EcoR I位点的cDNA序列以及符合酵母表达偏好性的基因序列组成。
[0008]本发明所述猪⑶40Ldimer融合蛋白的制备过程如下:
表达载体的构建:人工合成CD40Ldimer的基因序列作为第一部分，以合成的⑶40Ldimer基因序列为PCR模板，通过PCR扩增获得第二部分基因序列，将第一步和第二部分连接后再与表达质粒pwPICZalpha进行连接，通过双酶切检测和筛选含有⑶40Ldimer基因序列的表达载体；
酵母表达系统的构建:使用限制性内切酶线性化重组表达质粒，通过电转化的方法，将⑶40Ldimer的基因序列整合到酵母的基因组中。将转化后的菌体悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30°C培养3-4d ;挑取6个单菌落，进行小剂量的诱导表达，SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；
重组蛋白的纯化和结合能力的检测:挑选阳性克隆菌落进行大剂量的诱导表达，表达上清采用ProteinPure N1-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Westernblot检测纯化的重组蛋白。利用BCA测定浓度，计算⑶40Ldimer的产量；通过ELISA检测重组⑶40Ldimer的结合能力，证明其构象的正确性。
[0009]本发明所述的所述的猪OMOLdimer融合蛋白利用Pichiapastoris高效的外源蛋白表达、易于大规模培养、培养基价格低廉、易纯化并能够对表达的蛋白进行转录后修饰等优点，以Pichiapastoris表达重组可溶性猪⑶40Ldimer,为其作为疫苗佐剂的研究提供充足的原材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1 是 ProteinPure N1-NTA 树脂纯化 CD40Ldimer 的 SDS-PAGE 电泳图。
[0011]图2是强阳离子交换树脂纯化⑶40Ldimer的SDS-PAGE电泳图。
[0012]图3 是重组 CD40Ldimer 的 Western blot 分析图。
[0013]图4是重组CD40Ldimer的ELISA分析图。
【具体实施方式】
[0014]1、所用试剂及其配制
(I)LB (Luria-Bertani)液体培养基:取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC15g，溶解于800mLddH20 中，IOM NaOH 调节 pH 至 7.0，定容至 1000mL,高压灭菌(121°C，1.034 X IO5Pa) 20min,4°C保存。
[0015](2) LB (Luria-Bertani)固体培养基:按每 10OOmT, ddH20 加 15g 琼脂粉，向 LB 液体培养基中加入琼脂粉，高压灭菌，4°C保存。
[0016](3)贮备液:
IOXYNB (13.4%，含硫酸铵而不含氨基酸):将34g YNB和100g硫酸铵热溶于1000mLddH20中，过滤除菌，4°C保存。
[0017]500 X生物素(0.02%):20mg生物素溶于IOOmL ddH20中，过滤除菌，4°C保存。
[0018]IOX葡萄糖(20%):200g葡萄糖溶于1000mL ddH20中，高压灭菌,4°C保存。
[0019]IOX甲醇(5%甲醇):5mL甲醇与95mL ddH20混匀，过滤除菌，4°C保存。
[0020]IOX甘油(10%甘油MOOmL甘油与900mL ddH20混匀，过滤除菌或高压灭菌，室温保存。
[0021]IM 磷酸氢二钾缓冲液，pH=7.0:132mL IM K2HPO4 与 868mL IM KH2PO4 混合，高压灭菌，室温保存。
[0022]10 X酸水解酪素(10%酸水解酪素):100g酸水解酪素溶于1000mL ddH20中，高压灭菌，4°C保存。
[0023](4) YPD培养基(1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖):IOg酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH20中，加入20g琼脂制YB)板，高压灭菌，再加IOOmL IOX葡萄
糖，4°C保存备用。
[0024](5) YPG 培养基(1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%甘油):IOg酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH20中，高压灭菌，再加IOOmL IOX甘油，4°C保存备用。
[0025](6) BMMYC 培养基(1.34%ΥΝΒ、4Χ 10、生物素、0.5% 甲醇、1.0% 酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%酸水解酪素):10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于600mL ddH20中，高压灭菌，冷却至室温，加IOOmL IM磷酸氢二钾缓冲液，pH=7.0UOOmL 10XYNB、2mL 500X生物素、IOOmLIOX甲醇、IOOmL IOX酸水解酪素混匀，4°C保存。
[0026](7)缓冲液:Buffer I (50 mM 磷酸钠，0.3 M 氯化钠，10 mM 咪唑和 10 mM pH 8.0Tris-HCl )； Buffer II (50 mM 磷酸钠，0.3 M 氯化钠，500mM 咪唑和 10 mM pH 8.0 Tris-HCl )；Buffer 111(20 mM Tris-HCl pH 8.0, I mM EDTA, 5% 甘油);Buffer IV (20 mM Tris-HCl pH 8.0，ImM EDTA, 5% 甘油，100 mM 硼砂)；Buffer V (20 mM Tris-HCl pH 8.0, ImM EDTA, 5% 甘油，200mM硼砂)。
[0027]2、CD40Ldimer基因序列的优化和获得
根据NCBI登陆的猪CD40Ldimer基因序列(GeneID:397231)和酵母菌密码子偏好性，对CD40L的基因序列进行优化，在序列的5’和3’端引入XhoI和BamHI两个酶切位点，优化后的Q340L基因序列由Invitrogen公司合成。合成的QMOLdimer基因序列经XhoI和BamHI双酶切后，使用胶回收试剂盒对目的片段进行回收，将回收的片段作为连接的第一部分。
[0028]以携带II酶切位点的 P40LBgl (5，CCG CTC GAG AGA TCT^r GGT GGT GGTTCT ATG CAC AAG GGT GAC CAA GAC 3’)和携带&oRI 酶切位点的 P40LEco (5，CCG GAA TTCTTAGTG GTGGTGGTGGTGGTGCkk CTT CAA CAA ACC GAA AGA AGT 3’)为引物，合成的 CD40Ldimer基因序列为模板进行PCR扩增，为了便于后期的纯化，在C端引入6个组氨酸(6XHis tag)经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用胶回收试剂盒回收目的片段，将PCR产物进行通01和
双酶切后克隆到pwPICZalpha中，之后对上述构建好的载体进行汝./ II和&oRI双酶切，使用胶回收试剂盒对目的片段进行回收，将回收的片段作为连接的第二部分。 [0029]3、表达载体的构建
在无菌Eppendorf管中分别加入第一部分和第二部分基因片段各7 μ LJyUXoI和双酶切的质粒，2 yL Τ4连接酶，2 μ L连接酶缓冲液，混匀，4°C连接12h ;将10 μ L连接产物加入到90 μ L感受态大肠杆菌Τ0Ρ10中，混匀，42°C热激90s转化，加入400 μ L LB液体培养基，37°C振荡培养lh，将菌液涂布在Zeocin抗性的LB固体培养基上，37°C培养过夜。从转化的平板上挑取6个菌落接种到含Zeocin的5mL LB液体培养基中，37°C过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒。
[0030]用Xho I和EcoR I对连接产物进行双酶切鉴定，验证基因片段正确插入，该重组质粒命名为 pwPICZalpha-CD40Ldimer。
[0031]4、融合蛋白的表达 I)小剂量诱导表达
利用限制性内切酶Sac I将5-10 μ g重组质粒pwPICZalpha_0)40Ldimer进行线性化，采用PCR产物纯化试剂盒回收线性化的pwPICZalpha-⑶40Ldimer，加入到90 μ L感受态毕赤酵母Χ-33中，混匀，冰浴5min后电击转化，加入ImL山梨醇后，30°C放置2h，将菌液涂布在Zeocin抗性的YPD固体培养基上，30°C培养3_4d。从转化的平板上挑取6个菌落接种到含Zeocin的5mL YPD液体培养基中，30°C 250rpm培养24h，3500rpm离心，弃上清后加入5mL YPG液体培养基，300C 250rpm培养24h，3500rpm离心弃掉上清，加入2mL BMMYC液体培养基，270C 225rpm培养48h，每隔12h补充一次甲醇，使甲醇浓度维持在0.5%。3500rpm离心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。[0032]2)大剂量诱导表达
挑取一个阳性菌落接种到YPD液体培养基中，30°C 250rpm培养24h作为种子培养液，取13mL种子培养液接种到250mL YPD液体培养基中，30°C 250rpm培养24h，30°C 250rpm培养24h，3500rpm离心，弃上清后加入250mL YPG液体培养基，30°C 250rpm培养24h，3500rpm离心弃掉上清，加入125mL BMMYC液体培养基，27°C 225rpm培养48h，每隔12h补充一次甲醇，使甲醇浓度维持在0.5%。3500rpm离心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。
[0033]5、融合蛋白的纯化
I)ProteinPure N1-NTA 树脂纯化
在诱导表达的上清液中加入终浓度为50mM磷酸钠，0.3M氯化钠，IOmM咪唑和IOmM pH
8.0 Tris-HCl，用 0.45 μ m 滤器过滤。取 IOmL ProteinPure N1-NTA 树脂装入 XK16/20 层析柱中，柱子装好后与恒流泵相连，用10倍体积的Buffer I平衡柱子，平衡好后上样，上样结束后用8倍体积的Buffer I冲洗柱子，再用8倍体积的Buffer II洗脱目的蛋白并收集到8个不同的管中，整个过程的流速为5mL/min。用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析，图1中的SDS-PAGE结果显示，目的蛋白集中在Buffer II的2号和3号管中。将含有目的蛋白的Buffer II混合，装入3.5kDa透析袋中，在4°C条件下用含有20mM Tris-HCl pH 8.0, ImM EDTApH8.0, 5%甘油的透析液透析8h，每隔4h换一次透析液。
[0034]2)强阳离子交换树脂纯化
取IOmL强阳离子交换树脂装入》(16/20层析柱中，柱子装好后与恒流泵连接，用10倍体积的Buffer III平衡柱子，将透析好的样品上样，上样结束后用8倍体积的Buffer III冲洗柱子，再分别用8倍体积的Buffer IV和Buffer V洗脱目的蛋白，并将洗脱液收集到8个不同的管中，整个过程的流速为5mL/min。用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析，由图2可知目的蛋白集中在Buffer IV的I和2管中，将含有目的蛋白的Buffer IV混合，采用超滤浓缩的方法对目的蛋白进行浓缩，然后装入3.5kDa的透析袋中，在4°C条件下用含有5%甘油的PBS透析8 h，每隔4 h换一次PBS。用BCA试剂盒测定目的蛋白浓度，蛋白浓度为0.9mg/mL,IL培养液产量约为14mg，说明该蛋白基因在毕赤酵母中得到高效表达。利用抗His标签抗体对该蛋白进行western blot分析，由图3结果确证其为所要表达的蛋白。
[0035]4、ELISA 分析
将重组的⑶40Ldimer蛋白加入到96孔聚苯乙烯酶标板中4°C孵育过夜，弃上清液，加入100 μ L2% BSA室温下封闭2h。之后加入100 μ L不同浓度的⑶40L多克隆抗体(2.5 μ g/mL, 2 μ g/mL, I μ g/mL, 0.5 μ g/mL, 0.25 μ g/mL, 0.125 μ g/mL),室温下孵育 l_2h,用 PBS洗3次，加入100 μ L 二抗，室温下孵育0.5-lh，用PBS洗3次，加入100 μ L TMB室温下避光孵育10-30min，加入100 μ LI N HCl终止反应，用酶标仪测定450nm的OD值。由图4结果可知重组⑶40Ldimer蛋白能够与⑶40L抗体结合,证明重组⑶40Ldimer蛋白的构象正确。
【权利要求】
1.猪⑶40Ldimer融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.权利要求1所述猪CD40Ldimer融合蛋白的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO:1 所示。
【文档编号】C07K19/00GK104004099SQ201410262607
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】李宏全, 王志瑞, 范阔海, 温慧之, 原慧 申请人:山西农业大学