TabZIP60蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种TabZIP60蛋白及其编码基因与应用，本发明公开的TabZIP60蛋白及其编码基因可以提高植物的抗逆性以及对ABA的敏感性。本发明公开的一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ?ID?No.2所示的蛋白；(2)将SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的TabZIP60蛋白及其编码基因在提高植物抗旱、抗盐和抗冻害性方面具有重要作用。
【专利说明】TabZIP60蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及新的蛋白及其编码基因与应用；特别是涉及一种TabZIP60蛋白及其编码基因与应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]由于植物自身生长特点，从种子发育到植株死亡的整个生命过程中，无时无刻不受到干旱、低温和盐等非生物逆境的胁迫。为了在残酷的自然环境中生存下来，植物通过长期的进化，形成了一系列有效的防御机制。包括细胞水平、生理生化和分子水平的机制。植物首先感受逆境信号，通过体内信号传递过程，最后诱导功能蛋白和调苄基因表达，使植物产生抗逆性。
[0003]近年来，气候异常，水资源奇缺，可用耕地减少，盐碱地增多，这些不利因素严重威胁国家粮食安全。小麦是我国主要的粮食作物，培育高产抗逆的小麦品种是保证国家粮食安全的重要措施，抗逆相关基因的挖掘是抗逆分子育种的基石。转录因子在植物抗逆中扮演了非常重要的角色，作为反式作用因子，与逆境相关基因的顺式作用元件结合，激活其下游抗逆基因表达。使植物产生抗逆性。bZIP是植物中普遍存在的一类转录因子家族，它几乎参与调控植物的所有生命现象，如抗逆。在拟南芥和水稻中抗逆相关的bZIP转录因子的功能研究相对比较深入。由于小麦基因组的复杂性，使其整体研究水平比较滞后。小麦的bZIP转录因子抗逆功能研究相对较少。筛选抗逆相关的bZIP转录因子基因，为小麦抗逆分子育种提供候选基因具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种TabZIP60蛋白及其编码基因与应用，本发明提供的TabZIP60蛋白及其编码基因可以提高植物的抗逆性以及对ABA的敏感性。
[0005]本发明提供一种蛋白，为如下⑴或⑵所示:
[0006](I)SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0007](2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0008]所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0009]上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种:
[0010]I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0011]2) SEQ ID N0.9中自5’末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子；
[0012]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0013]4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0014]含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0015]一种制备转TabZIP60基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:将上述任一所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性和/或脱落酸敏感性增强。
[0016]上述方法中，所述编码基因是通过重组农杆菌导入的，所述重组农杆菌是将含有所述编码基因的重组质粒导入农杆菌得到的；
[0017]所述重组质粒是将SEQ ID N0.9所示的DNA分子或SEQ ID N0.9中自5’末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子通过BP反应重组到入门载体上，得到入门质粒；再将入门质粒与目标载体通过LR反应，最终得到目的重组质粒；
[0018]所述入门载体具体为pD0NR?/Zeo,该载体具体购自invitrogen公司，产品目录号为 12535-035 ；
[0019]所述目标载体具体为pEarleyGatelOO,该载体具体购自invitrogen公司；
[0020]所述目标载体pEarleyGatelOO 在文献 “Unver T, Turktas M, Budak H.1n plantaevidence for the involvement of a ubiquitin conjugating enzyme (UBC E2_clade)innegative regulat1n of disease resistance.Plant Mol B1l Rep.2013，31:323-334.，，中公开过；
[0021]所述农杆菌具体为农杆菌GV3101_pMP90,该菌在文献“Era A, Tominaga M, EbineK,Awai C，Saito C，Ishizaki K, Yamato K, Kohchi T, Makano A, Ueda Τ.Applicat1n oflifeact F—actin dynamics in Arabidopsis thaliana and the liverwort, MarchantiaPolymorpha.Plant Cell Phys1l.2009，50:1041-1048.” 中公开过。
[0022]上述任一所述的方法中，所述植物为拟南芥。
[0023]上述任一所述的方法中，所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性。
[0024]上述的蛋白、上述任一所述的编码基因在提高植物抗逆性和/或脱落酸敏感性中的应用也属于本发明的保护范围。
[0025]上述应用中，所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性；
[0026]所述植物为拟南芥。
[0027]本发明提供的TabZIP60蛋白及其编码基因在提高植物抗旱、抗盐和抗冻害性方面具有重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为低温胁迫下小麦TabZIP60基因的相对表达量。
[0029]图2为盐胁迫下小麦TabZIP60基因的相对表达量。
[0030]图3为PEG胁迫下小麦TabZIP60基因的相对表达量。
[0031]图4为ABA处理下小麦TabZIP60基因的相对表达量。
[0032]图5为低温胁迫下拟南芥的表型。
[0033]图6为盐胁迫下拟南芥的表型。
[0034]图7为干旱胁迫下拟南芥的表型。
[0035]图8为ABA处理下拟南芥的表型。
【具体实施方式】
[0036]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]KOD-Plus高保真酶购自Τ0Υ0Β0公司，产品目录号为K0D-201。
[0039]入门载体pD0NRTM/Zeo购自invitrogen公司，产品目录号为12535-035。
[0040]BP Clonase? II Enzyme Mix 购自 invitrogen 公司，产品目录号为 11789-013。
[0041]目标载体 pEarleyGatelOO 在文献 “Unver T, Turktas M, Budak H.1n plantaevidence for the involvement of a ubiquitin conjugating enzyme (UBC E2_clade)innegative regulat1n of disease resistance.Plant Mol B1l Rep.2013，31:323-334.，，中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0042]LR Clonase? II Enzyme Mix 购自 invitrogen 公司，产品目录号为 11791-019。
[0043]GV3101_pMP90 在文献“ Era A，Tominaga Mj Ebine K, Awai C，Saito C，IshizakiK，Yamato K，K ohchi TjMakano A,Ueda T.Applicat1n of lifeact F-actin dynamicsin Arabidopsis thaliana and the liverwort, Marchantia Polymorpha.Plant CellPhys1l.2009, 50:1041-1048.”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0044]拟南芥(Arabidopsisthaliana) (Columbia-0 亚型)在文献“ZhangL C，Zhao G Y, Xia C，Jia J Z, Liu X.and Kong X Y.A wheat R2R3-MYBgene, TaMYB30_B, improves drought stress tolerance in transgenic Arabidopsis.JExp Bot, 2012, 63:5873-5885.”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0045]中国春小麦(ChineseSpring Wheat)在文献 “Guo Z A, Song Y X, Zhou R H, RenZ L, Jia J Z.Discovery, evalut1n and distribut1n of haplotypes of the wheatPad-D I gene.New phytologist.2010, 185, 841-851.”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0046]实施例1、TabZIP60蛋白及其编码基因的发现
[0047]为了研究小麦bZIP基因在植物抗逆方面的功能，通过生物信息学的方法，从本实验室已经测序的30000条非冗余的小麦全长cDNA序列中筛选出22个编码小麦bZIP蛋白的基因。通过半定量PCR的方法，对该22个小麦bZIP基因在逆境条件下的表达模式进行研究，筛选出受逆境诱导表达的TabZIP60基因。
[0048]TabZIP60 基因全长 cDNA 为 1741bp，序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0049]其开放阅读框如SEQ ID N0.1中自5’末端起第382-1467位核苷酸所示，TabZIP60蛋白由361个氨基酸残基组成，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0050]实施例2、TabZIP60基因在不同逆境胁迫下的转录水平表达模式
[0051]一、TabZIP60基因在低温胁迫下的表达模式
[0052]对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于4°C处理，分别在处理前(Oh)、处理后1、3、
6、12、24和48小时提取小麦幼苗叶子组织的RNA，反转录成cDNA,以其cDNA为模板，进行实时定量PCR分析，得到TabZIP60基因的相对表达量，内参是小麦Tubulin基因。TabZIP60基因所采用引物如下:
[0053]上游引物1:5’ -CACCGATGCCGTATGTTTT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0054]下游引物2:5’-TGCCACCTCAGTCTCCAAT-3’ (SEQ ID N0.4)
[0055]结果如图1所示。
[0056]图1表明，TabZIP60基因响应低温胁迫诱导。
[0057]二、TabZIP60基因在盐胁迫下的表达模式
[0058]对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于250mM NaCl水溶液中进行处理，分别在处理前(Oh)、处理后1、3、6、12、24和48小时提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成cDNA,以其cDNA为模板，以上游引物I和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TabZIP60基因的相对表达量，内参是小麦Tubulin基因。
[0059]结果如图2所示。
[0060]图2表明，TabZIP60基因响应盐胁迫诱导。
[0061]三、TabZIP60基因在干旱胁迫下的表达模式
[0062]对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于16.lg/100ml的PEG6000水溶液中进行处理，分别在处理前(Oh)、处理后1、3、6、12、24和48小时提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成cDNA，以其cDNA为模板，以上游引物I和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TabZIP60基因的相对表达量，内参是小麦Tubulin基因。
[0063]结果如图3所示。
[0064]图3表明，TabZIP60基因响应干旱胁迫诱导。
[0065]四、TabZIP60基因在ABA胁迫下的表达模式
[0066]对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于200 μ M ABA水溶液中进行处理，分别在处理前(Oh)、处理后1、3、6、12、24和48小时提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成cDNA,以其cDNA为模板，以上游引物I和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TabZIP60基因的相对表达量，内参是小麦Tubulin基因。
[0067]结果如图4所示。
[0068]图4表明，TabZIP60基因响应ABA诱导表达。
[0069]实施例3、转TabZIP60基因植株的获得和耐逆性鉴定
[0070]一、利用Gateway技术构建过表达载体,步骤如下:
[0071]UattB引物设计
[0072]上游引物3:5’-GCATGGATTTTCCGGGAGGG-3’ (SEQ ID N0.5)
[0073]下游引物4:5，-TTACCAAGGGCCCGTCAGCG-3’ (SEQ ID N0.6)
[0074]2、根据Gateway技术构建表达载体的需要，在上游引物3和下游引物4的5’端分别加入attBl和attB2重组位点(下划线标注attBl和attB2重组位点)，分别得到上游引物5和下游引物6。
[0075]上游引物5:5 ’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGATTTTCCGGGAGGG-3，
[0076](SEQ ID N0.7)
[0077]下游引物6:5 ’ -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACCAAGGGCCCGTCAGCG-3，
[0078](SEQ ID N0.8)
[0079]3、以中国春小麦的cDNA为模板，用上游引物5和下游引物6进行PCR扩增，得到attB PCR产物，如SEQ ID N0.9所示，为保证PCR过程的保真性，使用KOD-Plus高保真酶进行PCR反应，PCR反应体系和反应程序如下:
[0080]
【权利要求】
1.一种蛋白，为如下⑴或⑵所示: (1)SEQID N0.2所示的蛋白； (2)将SEQID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下中至少一种: 1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子； 2)SEQ ID N0.9中自5’末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子; 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种制备转TabZIP60基因植物的方法，包括如下步骤:将权利要求2或3所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性和/或脱落酸敏感性增强。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述编码基因是通过重组农杆菌导入的，所述重组农杆菌是将含有所述编码基因的重组质粒导入农杆菌得到的； 所述重组质粒是将SEQ ID N0.9所示的DNA分子或SEQ ID N0.9中自5’末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子通过BP反应重组到入门载体上，得到入门质粒；再将入门质粒与目标载体通过LR反应,最终得到目的重组质粒； 所述入门载体具体为pDONR?/Zeo,该载体具体购自invitrogen公司，产品目录号为12535-035 ； 所述目标载体具体为pEarleyGatelOO,该载体具体购自invitrogen公司。 所述农杆菌具体为农杆菌GV3101-pMP90。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述植物为拟南芥。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于:所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性。
9.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在提高植物抗逆性和/或脱落酸敏感性中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性； 所述植物为拟南芥。
【文档编号】C07K14/415GK104072595SQ201410314554
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】孔秀英, 张丽娜, 张立超, 赵光耀, 夏川, 刘骥, 贾继增 申请人:中国农业科学院作物科学研究所