1.一种双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的表达基因,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在制备Tn抗原、T抗原或糖肽中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤如下:
将转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶与糖基供体、糖基受体溶液混合,配制成pH 5.0~6.0的反应体系,反应体系中,糖基供体反应浓度为5~10mM,糖基受体反应浓度为200~300mM,在45~55℃条件下,反应10~120min,终止反应,纯化,制得Tn和T抗原以及相应糖肽;
所述糖基供体为对硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖或对硝基苯-N-乙酰氨基-α-D-半乳糖-β1,3-D-半乳糖;
所述糖基受体为丝氨酸、苏氨酸或短肽。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的反应浓度为0.1~0.9U/ml。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶,制备方法如下:
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),制得重组大肠杆菌;
(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经扩大培养,再经过诱导培养后,收集细胞,细胞破碎、纯化,制得转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)JCM1217的基因组DNA为模板,经PCR扩增获得,PCR引物核苷酸序列如下所示:
引物F:5’-CGCGCATATGATGGAATTCACCGTATCCGGCACTA-3’
引物R::5’-ATATAAGCTTGTGATGCGGGCAGTCGGTGATG-3’
PCR体系如下,总体积100μL:
10×PCR buffer 10μL,2.5mmol/LdNTP 8μL、20μmol/L引物F 2μL、20μmol/L引物R 2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μLTaKaRaLATaq酶1μL,超纯水76μL;
PCR扩增程序如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸2分钟,反应30个循环;72℃延伸10分钟;
根据本发明进一步优选的,所述步骤(2)中,扩大培养条件为:37℃、150~180r/min培养至OD600为0.4~0.6。
8.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩大培养基为LB培养液,配制方法如下:
蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl7g/L、pH 7.0,121℃灭菌20分钟;
优选的,所述扩大培养基还包括浓度为40~60μg/mL的氨苄霉素。
9.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,诱导培养为在扩大培养后,向培养液中加入IPTG,使培养液中IPTG的浓度为0.1~0.5mM,在16~25℃、100r/min继续过夜培养。
10.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制,pH为6.0;
优选的,所述纯化采用HPLC进行纯化。