总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：
雪莲花又名雪莲，菊科风毛菊属。是民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。一般分布于海拔2400米至4000米以下的高山流石滩上。早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)(S.involucrata Kar.et Kir.)和水母雪莲(S.medusa Maxim)。新疆天山雪莲主要分布在新疆天山、昆仑山、阿尔泰山和帕米尔高原，属国家渐危三级植物。而水母雪莲(Saussurea medusa Maxim.)是藏药“雪莲”药材的原植物，分布在我国青海、甘肃、西藏等地，是藏药中的名贵药材。雪莲中含黄酮、生物碱、内酯、甾醇、挥发油、多糖等多种成分，其有效成分主要为黄酮类化合物。黄酮类化合物的药理作用包括抗癌、抗肿瘤，抗心脑血管疾病，镇咳祛痰，抗炎、镇痛作用，免疫调节作用，雌性激素样作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗辐射。如用来治疗偏瘫的雪莲通脉丸、雪莲注射液和治疗脑动脉硬化与缺血性中风的雪莲通脉口服液，都是以黄酮类化合物含量为质量标准的。雪莲黄酮药理作用显著，如水母雪莲黄酮成分对中枢神经系统有抑制作用；以黄酮类化合物为有效成分的雪莲注射液治疗偏头痛效果显著。
黄酮类化合物的生物合成是通过苯丙烷类生物合成途径实现的。是由1分子4-香豆酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下产生查耳酮(苯基苯乙烯酮)开始的，查耳酮合酶是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成的第一个最关键酶。


发明内容
本发明的目的是提供总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的总黄酮合成相关蛋白，是一种查耳酮异构酶，命名为chi，该酶是如下a)或b)的蛋白 a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与总黄酮合成相关的由a)衍生的蛋白质。
其中，序列表中序列2由232个氨基酸残基组成。
为了使a)中的chi便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列 上述b)中的chi可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的chi的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第39-738所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
chi蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述的基因具体可是如下1)或2)或3)或4)的基因 1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子； 2)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第39-738位的DNA分子 3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述总黄酮合成相关蛋白的DNA分子； 4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述总黄酮合成相关蛋白的DNA分子。
所述步骤4)中的基因，与1)或2的基因最好有95％以上的同源性。
序列表中的序列1由831个碱基组成，自5′末端第39-738位为编码区，编码序列表中序列2的蛋白质。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
扩增上述chi基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述chi基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有chi基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的chi基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
使用chi基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的chi基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
本发明的另一个目的是提供一种培育总黄酮含量提高的雪莲的方法。
本发明所提供的培育总黄酮含量提高的雪莲的方法，是将所述chi基因导入新疆天山雪莲中，获得总黄酮含量提高的雪莲。
本发明还提供了一种生产总黄酮的方法。
本发明所提供的生产总黄酮的方法，是通过对上述方法获得的总黄酮含量提高的雪莲的毛状根根系进行诱导产生不定芽，得到新疆天山雪莲再生苗，培养所述雪莲再生苗生产总黄酮。
本发明构建了水母雪莲cDNA文库，并利用此文库通过简并引物筛选到水母雪莲chi基因，利用特异引物通过PCR克隆了chi基因，并构建了含有chi基因的重组表达载体，获得了转chi基因的新疆雪莲。转chi基因的新疆雪莲的总黄酮和芹菜素含量的测定结果表明，转chi基因的新疆雪莲与转空载体的新疆雪莲相比，总黄酮和芹菜素含量有明显的提高，说明chi蛋白是一种黄酮类物质合成相关蛋白。将所述chi基因导入雪莲中，可以获得总黄酮含量升高的雪莲；可以利用总黄酮含量升高的雪莲的毛状根根系进行诱导，产生不定芽，获得再生苗，培养再生苗生产总黄酮。本发明的总黄酮合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要价值。



图1为转基因新疆雪莲再生苗的PCR检测 图2为不同类型新疆雪莲再生苗的芹菜素和总黄酮含量 图3为新疆雪莲再生苗的HPLC图谱 (a)在紫外337nm处芹菜素标准品谱图；(b)转chi基因毛状根再生苗图谱。

具体实施例方式 实施例1、雪莲查耳酮异构酶基因(chi)的克隆 1.雪莲cDNA文库的构建 建库所用水母雪莲1-15天愈伤组织红色系，通过如下方法诱导用水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)的茎与叶片作外植体，在含有0.2mg/L苄氨基嘌呤、2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，pH值5.8的MS培养基上诱导出愈伤组织，并在含有2mg/L萘乙酸、0.5mg/L苄氨基嘌呤和30g/L蔗糖的MS培养基中，25±1℃，16h光照/8h黑暗下培养、继代扩繁。
分别称取培养1-14天的红色系愈伤组织各50mg，共计700mg混合样品于研钵中，用TRIZOL Reagent(购自GIBCO公司)提取总RNA。取1~3μl总RNA样品，用SMART cDNA Library Construction Kit(Catlog#K1051-1)(CLONTEC)自带的CDSIII酶切位点的PolyT引物合成第一链cDNA.采用LD PCR(long distance PCR)扩增用cDNA第一链以获得双链cDNA。
加入蛋白酶K消化去除cDNA中的Taq酶，再用Sfi I酶切cDNA，然后用CHROMASPIN-400对cDNA进行大小分离。收集大小＞500bp的cDNA，将收集到的cDNA与λTripIEx2 Vector(Promega)连接，连接好的DNA由包装蛋白Packagene Lambda DNAPackaging System(购自Promega公司)包装后，加入明胶使终浓度为0.01％，DMSO终浓度为7％，可以在-70℃下保存1年滴度不变。将文库分成20个亚文库，避免反复冻溶，每个亚文库来自于在原始文库扩增时不同培养皿的回收物，其组成可能不同，可保存，这样就完成了雪莲噬菌体文库构建。
2.从雪莲cDNA文库筛选雪莲查耳酮合成酶基因chi cDNA 根据GenBank中已发表的chi基因保守的氨基酸序列用软件DNAMAN4.0(美国Lynnon Biosoft公司)设计合成上下游部分简并引物 CP15′-GGAGG(C/T)GC(A/C)GG(G/T)G(A/T)AGAG-3′ CP25-GTGAAGAGAATAGA(G/T)G(A/C)(A/G)CCIGG-3′ 每个亚文库取1μL为模板，以CP1、CP2为引物，25μL反应体系，先于95℃加热10min裂解噬菌体，加入PCR扩增混合物，进行降落PCR扩增。扩增程序如下94℃变性5min，随之94℃ 1min，65退火1min，以后每进行一个循环退火温度比上一循环下降0.5℃，直至退火温度为50℃；最后72℃延伸1min，进行30循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，15循环；72℃延伸5min。1.6％琼脂糖电泳检测，确定阳性池。选取信号最强的阳性池，作10倍梯度稀释到106倍，每个梯度稀释物取1μL为模板，按同样程序进行PCR检测，确定在下一级筛选时本级阳性池的最大稀释倍数N(能够检测到阳性信号的极限稀释倍数)。将选中的初级阳性池按其最大稀释倍数N稀释，取1μL稀释物感染大肠杆菌并铺制10个9cm LB平板，培养并回收洗脱物。从平板上挑取生长并分离良好的单噬菌斑，置于缓冲液中，涡旋震荡，稍离心，于4℃冰箱过夜。取3μL洗脱物为模板，PCR程序扩增检测，获得阳性单克隆。
选取PCR检测阳性单克隆，送上海生物工程公司测序。测序结果表明该片段为368bp，推测的氨基酸序列与翠菊的CHI有90％的同源性，表明该片段为水母雪莲chi的部分特异片段。
3.PCR法克隆雪莲查耳酮合成酶基因chi全长cDNA 根据获得的特异片段用软件DNAMAN4.0设计一对引物 CP35′-GGAGGCGCAGGTGTGAGAG-3′ CP45′-GTGAAGAGAATAGAGGAGCCTGG-3′ 取2μL步骤1中提取的总RNA，20μL反应混合体系中在M-MLV反转录酶(购自Promega公司)作用下合成第一链cDNA，以此第一链cDNA为模板，以上述CP3，CP4为引物进行PCR扩增94℃变性5min，随之以94℃1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行30循环；72℃延伸10min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化800bp左右的的DNA片段，将该片段克隆到pTripIEX2载体中，获得pTripIEX2-chi载体，测序，测序结果表明该片段为831bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，在GenBank中比较分析，确认所克隆的片段为chi全长cDNA，序列表中序列1自5′末端第39-738位为编码序列，编码序列表中序列3的蛋白，序列3由为232个氨基酸残基组成，分子量为24000kDa。将含有完整chi全长cDNA序列质粒的大肠杆菌保存于-20℃中。
4.chi全长cDNA的鉴定 采用BLAST同源性分析，通过比较得知，chi全长cDNA序列与翠菊(Callistephus chinensis Z6798)中的chi基因的同源性最高，达到78％。蛋白质序列与翠菊(Callistephus chinensis CAA91921)的chi氨基酸序列同源性最高，达到79％。
5.转chi基因新疆雪莲毛状根的获得 1)pCAMBIA1301-chi表达载体的构建 以pTripIEX2-chi质粒为模板，用引物CP5和CP6扩增chi基因全长，引物CP5和CP6的两端分别引入Sac I-BamH I的识别位点，引物CP5和CP6的序列如下 5’-CTTCGAGCTCCTCCGACTGAATAACAATGG-3’； 5’-GCATGGATCCTGGGCACACAGATGATTT-3’。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化699bp的DNA片段，用Sac I和BamH I酶切该片段，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的片段与经同样双酶切的pRTL2载体连接，得到重组质粒pRTL2-chi。将pRTL2-chi载体Pst I酶切，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化2236bp的DNA片段，将该片段和经Pst I酶切的pCAMBIA1301载体连接，获得重组表达载体pCAMBIA1301-chi。
2)转chi基因新疆雪莲毛状根的获得 将重组表达载体pCAMBIA1301-chi和载体pCAMBIA1301分别转入发根农杆菌R1601中，获得重组菌R1601-chi和R1601-c。
重组菌R1601-chi和R1601-c分别与新疆雪莲的根段共培养，直到外植体周围出现明显菌斑。用灭菌的蒸馏水清洗外植体，去除菌体后，转接于附加500mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基上，于25℃暗培养，除菌并诱导发根。待毛状根长至2-3cm时，切下转接于附加500mg/L头孢噻肟钠的MS液体培养基中，39℃振荡(100rpm)除菌48h。切取除菌完全的3-4cm长的根尖，转接于无激素MS液体培养基中，25℃、110rpm弱光培养。外植体上每条经发根农杆菌侵染后，独立诱导出的毛状根单独转接入MS液体培养基，建立独立的转化根系，继代3次后，进行扩繁，用于高产发根根系的筛选。
同时以R1601-c转化根段产生的毛状根系作为对照。
实施例2、黄酮类物质的生产 转水母雪莲chi基因的新疆雪莲的毛状根体系生长在1/2MS无激素液体培养基的三角瓶中，弱光培养，每18天继代一次，摇床转速为110r/min。
分别切取5cm根尖接种于含GA3 1.5mg/L的1/2MS液体培养基上，每瓶接种15条根尖，每一处理5瓶，诱导不定芽的形成。将长至3-5cm的生长健壮的三个不同根系的不定芽切下，转移至附加BA1.0mg/L、NAA0.1mg/L的MS固体培养基上培养。同时选择R1601-c的毛状根根系按上述条件培养作为对照。
由毛状根诱导出的转chi基因新疆雪莲再生苗和对照苗接种在附加0.5mg/LIAA的1/2MS培养基，诱导生根。待试管苗生根良好，株高至5cm左右时，将生根试管苗的培养瓶封口膜打开，组培室内放置3-4d。移栽时用镊子将苗取出，用自来水轻轻洗净残留在根部的培养基，移栽于装有经过消毒处理的有机土和蛭石等体积混合的花盆中，浇足水。开始时用塑料薄膜袋保湿3-4d，然后再转入温室中培养。
来自同一新疆雪莲转chi基因毛状根根系的再生苗为一个株系。选取三个株系(C17、C27和C46)的再生苗进行分子鉴定。具体方法如下 转chi基因新疆雪莲再生苗生长三周后，提取转chi基因毛状根根系的再生苗的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR鉴定 上游引物5′CCC ACT ATC CTT CG 3′； 下游引物5′GCA TGA GAG CTC TGG GCA CAC AGA TGA TTT 3′。
PCR反应程序94℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
PCR检测结果如图1所示。
图1中，C由发根农杆菌R1601-c诱导的毛状根的再生植株； C17、C27和C46由发根农杆菌R1601-chii诱导的转基因毛状根的再生植株； ApCAMBIA1301-chi质粒；MDNA标记。
新疆雪莲转chi基因毛状根根系的再生苗中扩增出400bp左右的特异片段的再生苗为阳性的转chi基因毛状根根系的再生苗。
选取阳性的C17、C27和C46三个新疆雪莲转chi基因毛状根根系的再生苗各5株和阳性的R1601-c的毛状根根系的再生苗5株，分别测定它们的总黄酮和芹菜素含量，实验重复三次。
总黄酮和芹菜素含量测定方法如下 总黄酮含量通过比色方法测定，称取50mg烘干后的新疆雪莲毛状根培养物，在研钵中充分研磨，将研磨后的粉末放入一个干净的1.5mL离心管中，加入1mL70％(体积百分数)乙醇，50℃水浴24小时，室温下5000r/min离心10min，准确吸取上清液，并将其转移至一个新的1.5mL离心管中，吸取10uL浸提液，将其置于一个新的1.5mL离心管中，加入30uL 5g/100ml NaNO2混匀，室温放置6min，再加入30ul 10g/100ml AlCl3混匀，室温放置6min，最后加入400uL 5g/100mlNaOH混匀，室温放置15min，用重蒸水补齐至1mL混匀，于510nm处测定OD值。，以芦丁(Rutinum，C27H30O18·3H2O)的含量进行换算。
芦丁标准品与其吸光度的直线方程c＝0.08089A-0.0005324(其中，c表示总黄酮的浓度，单位是mg/ml；A为光的吸收变量)，相关系数r＝0.9991。测定波长510nm，仪器型号Beckman Coulter的DU640可见-紫外分光光度计。
芹菜素的含量通过高效液相色谱法测定，称取50mg烘干后的新疆雪莲毛状根培养物，在研钵中充分研磨，将研磨后的粉末放入一个干净的1.5mL离心管中，加入1mL 70％(体积百分数)乙醇，50℃水浴24小时，以芹菜素为标准品，用高效液相色谱仪测定一系列浓度标准芹菜素溶液，根据峰面积制作标准曲线，芹菜素浓度在0-90ug/mL范围内呈良好的线性关系。
芹菜素标准品浓度与峰面积的直线方程c＝28.242A-24.079(其中c表示芹菜素的浓度，单位是μg/m L；A表示峰面积)，r＝0.9981，测定波长337nm。仪器型号Agilent 1100系统(Agilent，USA)，反相色谱柱Zorbax 300SB-C18(250×4.5mm，4μm)，有光电二级管检测器进行全波长扫描(190nm-400nm)。上样体积为5uL，流动相为0.1g/100ml磷酸缓冲液甲醇水溶液梯度洗脱，5-20％(体积百分数)洗脱5min，20-30％(体积百分数)洗脱7min，30-45％(体积百分数)洗脱20min，45-70％(体积百分数)洗脱15min，最后用100％(体积百分数)甲醇冲洗10min，流速为1.0mL/min。峰的纯度、鉴定和整合用芹菜素标准品在Agilent Chemstations软件A.10.02上分析进行，检测波长为337nm。
总黄酮和芹菜素含量的实验结果表明，与对照R1601-c毛状根的再生植株(图2，control-1)和未转基因的正常诱导组培苗(图2，control-2)相比，阳性的C17、C27和C46三个新疆雪莲转chi基因毛状根根系的再生苗的芹菜素和总黄酮含量都有显著提高，其中株系C46芹菜素和总黄酮含量分别为1.86mg/g干重和37.3mg/g干重，分别为Control-1的12倍和2.4倍，Control-2的4倍和1.6倍。图3显示了芹菜素标准样品及毛状根再生苗的HPLC图。
上述实验结果说明，与转空载体的毛状根的再生苗相比，转chi基因毛状根根系的再生苗中其有效物质的含量有显著的提高，因此，以毛状根为中间载体，将黄酮代谢途径中的有效基因导入到新疆雪莲中，然后再生成高产黄酮转基因苗，进行人工栽培，将是解决雪莲野生资源短缺的有效途径。
序列表
<110>中国科学院植物研究所
<120>总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用
<130>CGGNARW81375
<160>2
<210>1
<211>831
<212>DNA
<213>凤毛菊属水母雪莲(S.medusa Maxim)
<400>1
gaacacaact gttcttcgtg tttctccgac tgaataacaa tggctccgcc gccctcctcc 60
accagcatcc aggtcgaatc catcgttttt ccaccatccg tcaagcctcc cggcgcaacc120
accactttgt tcctaggagg cgcaggtgtg agaggtatgg aaattcaagg taacttcgtg180
aagtttacgg ggattggtgt gtacttggag gataaagcca ttccgtcact cgccgttaag240
tggaagggca aaaccgctgc tgagttgacg gattccgttc agttctacag ggacatcgtt300
actggaccct ttgaaaaatt tagtcaggtg acaatgatac tacccttaac cggtaagcaa360
tactctgaaa aagtgtctga aatgtgtatt ggggtttgga aagcacaagg gacctacaca420
gatgcagata ctgcaactat tgaaaagttt cttgaggttt ttaaggatga gaacttttta480
ccaggctcct ctattctctt cacaacatcg cctactggat cattaacgat cagcttctcg540
aaagatggta acatacctga agctgctact gttgtgttag agaacagaaa attggcacaa600
acagtaatcg agtcagtgat cggggagcat ggtgtttctc cagaagcaaa acaaagtttg660
gcatcaagac tgtcagattt catgacacaa tttgatgaga aagcaactgc aaatgttgaa720
agccaaattg gtttgtaaat gggtaattga agagaataaa atgcaaaatc atctgtgtgc780
ccatatggca tgcgaaattt ctacccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 831
<210>1
<211>232
<212>PRT
<213>凤毛菊属水母雪莲(S.medusa Maxim)
<400>2
Met Ala Pro Pro Pro Ser Ser Thr Ser Ile Gln Val Glu Ser Ile Val
1 5 10 15
Phe Pro Pro Ser Val Lys Pro Pro Gly Ala Thr Thr Thr Leu Phe Leu
20 25 30
Gly Gly Ala Gly Val Arg Gly Met Glu Ile Gln Gly Asn Phe Val Lys
35 40 45
Phe Thr Gly Ile Gly Val Tyr Leu Glu Asp Lys Ala Ile Pro Ser Leu
50 55 60
Ala Val Lys Trp Lys Gly Lys Thr Ala Ala Glu Leu Thr Asp Ser Val
65 70 75 80
Gln Phe Tyr Arg Asp Ile Val Thr Gly Pro Phe Glu Lys Phe Ser Gln
85 90 95
Val Thr Met Ile Leu Pro Leu Thr Gly Lys Gln Tyr Ser Glu Lys Val
100 105 110
Ser Glu Met Cys Ile Gly Val Trp Lys Ala Gln Gly Thr Tyr Thr Asp
115 120 125
Ala Asp Thr Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu Glu Val Phe Lys Asp Glu
130 135 140
Asn Phe Leu Pro Gly Ser Ser Ile Leu Phe Thr Thr Ser Pro Thr Gly
145 150 155 160
Ser Leu Thr Ile Ser Phe Ser Lys Asp Gly Asn Ile Pro Glu Ala Ala
165 170 175
Thr Val Val Leu Glu Asn Arg Lys Leu Ala Gln Thr Val Ile Glu Ser
180 185 190
Val Ile Gly Glu His Gly Val Ser Pro Glu Ala Lys Gln Ser Leu Ala
195 200 205
Ser Arg Leu Ser Asp Phe Met Thr Gln Phe Asp Glu Lys Ala Thr Ala
210 215 220
Asn Val Glu Ser Gln Ile Gly Leu
22 5230
权利要求
1、一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与总黄酮合成相关的由a)衍生的蛋白质。
2、权利要求1所述蛋白的编码基因。
3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述编码基因是如下1)或2)或3)或4)的基因
1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；
2)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第39-738位的DNA分子；
3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述总黄酮合成相关蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述总黄酮合成相关蛋白的DNA分子。
4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在表达载体pBI121的多克隆位点插入权利要求2或3所述基因得到的重组载体。
6、扩增权利要求2或3所述基因全长或任一片段的引物对。
7、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。
8、一种培育总黄酮含量提高的雪莲的方法，是将权利要求2或3所述基因导入雪莲中，获得总黄酮含量提高的雪莲。
9、一种生产总黄酮的方法，是通过对权利要求8所述方法获得的总黄酮含量提高的雪莲的毛状根根系进行诱导产生不定芽，得到雪莲再生苗，培养所述雪莲再生苗进行生产总黄酮。
全文摘要
本发明公开了一种总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是a)其氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与总黄酮合成相关的由a)衍生的蛋白质。该蛋白的编码基因是1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第39-738位的DNA分子；3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述总黄酮合成相关蛋白的DNA分子。本发明的总黄酮合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要价值。
文档编号C12N15/11GK101319209SQ20081011444
公开日2008年12月10日 申请日期2008年6月5日 优先权日2008年6月5日
发明者赵德修, 李风霞 申请人:中国科学院植物研究所