乙肝L基因和结核Ag85B融合基因及其表达载体的构建与应用的制作方法

专利名称：乙肝L基因和结核Ag85B融合基因及其表达载体的构建与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物工程技术领域，特别涉及一种乙肝病毒全包膜L基 因与结核杆菌Ag85B的融合抗原基因及其载体的构建和表达方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(H印atitis B virus ， HBV)和结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis ， MTB)感染所致传染性疾病是严重危害我 国乃至全人类健康和生命安全的重大公共卫生问题。疫苗接种是预防和控制 乙肝与结核发生和流行的重要手段。目前，乙肝基因工程零组疫苗和卡介苗 在预防乙肝和结核方面取得了巨大的成就，但各自还存在一些不足。如基因 工程重组乙肝疫苗需多次接种，且部分人群接种后出现免疫不应答或低应 答，且该疫苗仅有预防目的，无治疗作用。卡介苗在不同地区不同人群中存 在着差异，免疫保护效果不稳定(保护率为0_80%之间)，，由于MTB耐药菌
株的出现以及艾滋病的合并感染以及世界人口流动的增加等等问题，使得 MTB近年来有死灰复燃的趋势。因而，研究效果更好的乙肝疫苗和结核疫苗 势在必行。
DNA疫苗是近年兴起的新型疫苗，具有亚单位疫苗或灭活疫苗的安全性， 同时具有减毒疫苗或重组疫苗才具有的诱导保护性细胞免疫应答的特点。 DNA疫苗构建方便、制备工艺简单、化学性质稳定、保存运输方便、价格低 廉、可用于构建多价疫苗及预防不同亚型的病毒感染。
疫苗种类和数量的增多，在预防多种传染病的同时，也伴随着一系列问 题的产生，如儿童预防接种次数增加、疫苗管理难度加大、预防接种工作成 本增高等。因此，当前联合疫苗已经成为疫苗研发、生产和使用的一大趋势。 因为联合疫苗可以减少频繁的注射次数和漏种的机会，提高及时接种率和接 种者的依从性，节省接种管理成本和受种者的时间成本。因此，在实施计划 免疫时，采用多价疫苗进行联合免疫受到了世界各国的重视。目前世界各国 的科学工作者都在致力研制新型的乙肝与结核联合疫苗。但是，各种联合疫苗在稳定性、剂型、处方的设计和生产成本上都还存在一些问题，有待改进， 致使乙肝与结核联合疫苗至今仍未在全世界广泛应用。生物工程技术的进展 为重组疫苗提供了新的途径，以DNA疫苗为基础的联合疫苗被寄予厚望。
HBV基因组是一部分双链DNA分子，由约3200个碱基对组成，HBV基因组 的全部顺序均为蛋白编码区，由相互重叠的4个基因S、 C、 P和X基因组成， 分别编码外膜蛋白(HBsAg)、核心蛋白(HBcAg)、聚合酶和X蛋白。本研究中 选择的乙肝抗原基因为可以表达乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的s区全基因，即 可表达PreSl、 PreS2和S抗原三种抗原成分。目前市售的HBsAg啤酒酵母疫 苗是仅由S蛋白组成的疫苗，虽然已显示了较好的免疫保护作用，但是许多 实验结果表明preSl、 preS2区所拥有的B和T细胞表位具有很高的免疫原性， 可以增强对S蛋白的免疫反应，克服对S蛋白的无反应性在疫苗中加入PreSl 和PreS2后，可降低人群对乙肝疫苗的不反应和低反应性。因此，选择了乙 肝包膜大蛋白L基因，作为乙肝的优势抗原基因与结核基因联合。Ag85B是结 核分支杆菌和BCG的分泌性蛋白，是结核菌主要的保护性抗原，含有9个免疫 优势表位，具有体外激活T细胞并能刺激记忆T细胞产生的能力。因此选择将 乙肝包膜大蛋白基因和结核优势抗原Ag85基因融合构建新型的DNA疫苗，将 有利于乙肝和结核的防治。本研究所选用的pVAXl真核表达载体是由 pcDNA3. l改造而来的，全长3.0 kb，是美国FDA认可的安全性较高并且可以 用于人体研究的基因疫苗表达载体。

发明内容
本发明的目在于克服现有疫苗的缺点，提供一种乙肝病毒全包膜L (HBVL)基因和结核杆菌Ag85B (鹏T-Ag85B)基因的融合基因。
本发明的另一目的在于提供一种包含上述融合基因的真核表达载体的 构建和表达方法。
本发明的再一目的在于提供一种上述融合基因的真核表达载体的应用。 本发明的目的通过下述技术方案实现 一种乙肝病毒全包膜L基因和结
核杆菌Ag85B基因的融合基因，其序列如SEQ ID NO. l所述。
一种包含了上述乙肝病毒全包膜L基因和结核杆菌Ag85B基因的融合基
因的真核表达载体的构建和表达方法，包括以下步骤 (1)引物设计
根据乙肝病毒全包膜L基因的编码序列，设计扩增乙肝病毒全包膜L基
5因的l对引物
上游引物序列为PI 5' -CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel 酶切位点和起始密码子ATG;
下游引物序列为P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind in酶切位点，并删除终止密码子；
根据人结核分支杆菌H37Rv株Ag85B基因的编码序列，设计扩增结核杆 菌Ag85B基因的l对引物
上游引物序列为P3 5' - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII(AAGCTT)酶切位点和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker 序列；
下游引物序列为P4 5, -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I酶切位点和终止密码子；
(2) 重组质粒pVL的构建 将乙肝表面抗原阳性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法获得DNA提取液，作
为L基因扩增模板，用歩骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应， 扩增出乙肝病毒全包膜L基因片段，将纯化后的乙肝病毒全包膜L基因片段和 质粒pVAXl分别用Nhel和HindlII进行双酶切，纯化、连接、转化获得重组质 粒pVAX-L;
(3) 重组质粒pVLA的构建
提取人结核分支杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，用步骤(1)设计的 引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应，扩增获得结核杆菌Ag85B基因；将 纯化的结核杆菌Ag85B基因与步骤(2)所得重组质粒pVL分别用HindIII 和Kpn I双酶切，纯化、连接、转化获得重组质粒pVLA;
(4) 重组质粒pVLA转染真核细胞及体外表达鉴定 将酶切和测序鉴定正确的步骤(3)所得重组质粒pVLA转染HEK293细
胞，并通过免疫组织化学法和免疫印记法检测融合基因的表达蛋白质。
步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94"C预 变性5min，然后进入下列循环94°C、 45s，55。C、 45s， 72°C、 lmin，共进 行30个循环，最后72。C延伸10min，扩增完毕后置4'C终止反应；所述混合 液组成如下
浓度为1Oumo1/1的上游引物Pl 1 lU
浓度为10umol/l的下游引物P2 1 P 1dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
DNA提取液 5 " 1
含Mf的Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 u 1
Ex耐热性DNA聚合酶 0. 25 u 1 灭菌水 33.75ul
步骤(3)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94'C预 变性5min，然后进入下列循环94°C、 45s，52。C、 45s， 72°C、 1 min,共进 行30个循环，最后72。C延伸10min，扩增完毕后置4。C终止反应；所述混合
液组成如下
浓度为1Oumo1/1的上游引物P3 1 u 1
浓度为1Oumo1/1的下游引物P4 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
H37Rv基因组DNA 4ul
含Mg2+的Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 p 1
Ex耐热性DNA聚合酶 0. 25 u 1
灭菌水 34. 75 u 1
上述方法构建的真核表达载体作为制备乙肝和结核联合疫苗的用途。
上述方法表达的融合基因的表达蛋白质作为制备乙肝和结核联合疫苗 的用途。
本发明的原理是本发明中将乙肝病毒全包膜L基因与结核杆菌Ag85B基 因联合表达于pVAXl载体，重组质粒pVLA转染细胞并通过免疫组织化学法和 West blot检测融合蛋白L-Ag85B的表达，从而为研究乙肝和结核的联合DNA 疫苗奠定基础。载体pVAXl是美国FDA认可的安全性较高并且可以用于人体研 究的基因疫苗表达载体，可以携带乙肝病毒L与结核杆菌Ag85B基因转染到细 胞中，表达出含有乙肝病毒L与结核杆菌Ag85B基因的融合蛋白。
基因L禾口 Ag85B在NCBI中的登陆号为GI: 157091234和GI :6469794。 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果(l)本发明将乙 肝病毒L与结核杆菌Ag85B两种抗原同时克隆到同一载体上，构建乙肝病毒L 与结核杆菌Ag85B的融合质粒，以期为制备乙肝和结核的联合疫苗奠定基础，有利于乙肝和结核的联合防治；(2)本发明利用的pVAXl载体是美国FDA认 可的安全性较高并且可以用于人体研究的基因疫苗表达载体，为后续的动物 实验及临床实验奠定基础。


图1为重组质粒pVL构建示意图。 图2为重组质粒pVLA构建示意图。 图3为重组质粒pVLA蛋白表达鉴定图。 图4为重组质粒pVL示意图。 图5为重组质粒pVLA示意图。
图6为PCR扩增HBV-L基因片段琼脂糖凝胶电泳图，其中M为1KbDNA Ladder Maker; Linel、 2为丽-L片段，1. 2Kb。
图7为菌落PCR鉴定重组质粒pVL图，其中1为以DNA提取液为模板 的PCR结果；2-6为以转化的单菌落为模板的PCR结果。
图8为pVL重组质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中M为1Kb DNA Ladder Maker; 1、 2为pVL的Nhel和Hindi 11双酶切产物；3为pVL的 HindIII单酶切产物4: pVAXl的HindIII单酶切产物。
图9为PCR扩增MBT-Ag85B基因片段琼脂糖凝胶电泳图，其中M为150bp DNA Ladder Maker; 1、 2为Ag85B， 860bp。
图10为菌落PCR鉴定重组质粒pVLA基因片段图，其中1为以 pcDNA3-Ag85B为模板的PCR扩增的Ag85B; 2-6:菌落PCR。
图11为pVLA重组质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中M为1KB DNA Ladder Maker; 1、 2为pVLA的HindIII和Kpnl双酶切产物。
图12为pVLA重组质粒三酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中M为1KB DNA Ladder Maker; 1: pVLA的Nhel、 HindIII和Kpnl的三酶切产物。
图13为重组质粒大小比较鉴定图，其中M为1KB DNA Ladder Maker; l为pVAXl; 2为PVAX-L; 3为pVLA。
图14为免疫组织化学检测融合蛋白在HEK293细胞中的表达图，其中 图a为转染pVLA质粒的HEK293细胞呈染色棕黄色阳性(200X);图b为转 染pVAXl质粒的HEK293细胞呈染色呈阴性(200X )。图15为重组质粒转染293细胞后的蛋白印迹分析图，其中M为蛋白
markers; 1、 2为样品为转染重组质粒pVLA的293细胞的裂解液上清；3、 4为样品为293细胞的裂解液上清。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施 方式不限于此。
首先对实验材料的说明如下
质粒pVAXl:美国FDA批准可用于人体的DNA疫苗载体，购自Invitrogen 公司；MTB H37Rv购自中科院微生物菌种保藏中心；乙肝表面抗原阳性患者
血清由广州华侨医院提供。
大肠杆菌E. coli T0P10购自天津天有利科技有限公司。
细胞株HEK293细胞((人胚肾上皮细胞)购自上海桑戈生物科技有限公司。
试剂酶类(大连宝生物公司)；试剂盒(质粒DNA小提试剂盒，细菌 基因组DNA抽提试剂盒，Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒，凝胶DNA 纯化回收试剂盒，OMEGA去内毒素质粒提取试剂盒)(OMEGA); PCR引物合成 (上海生工生物工程技术服务有限公司)；重组质粒上目的基因的序列测定 (上海生工生物工程技术服务有限公司)；鼠源性抗HBsAg单克隆抗体(北 京博奥森生物技术有限公司)即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒(武汉 博士德生物工程有限公司)
酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂糖粉(上海生物工程有限公司)；琼脂糖(美 国Sigma公司)；DMS0、青霉素钠、硫酸链霉素、胰蛋白酶、H印es碱(广州 博理生物科技有限公司)；氨苄青霉素(北京鼎国生物技术有限公司)；DMEM 培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 6孔细胞培养、1.8ml冻存管板、0.22um—次性滤器(广州普博公司)。
实施例1: 1、引物设计
根据乙型肝炎病毒全包膜L基因的编码序列，设计扩增HBVL的1对引
物
上游引物序列为:PI 5' —CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel(GCTAGC)酶切位点和起始密码子ATG;
下游引物序列为P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind III (AAGCTT)酶切位点，并删除终止密码子；
根据人结核分支杆菌H37Rv株Ag85B基因的编码序列，设计扩增结核杆 菌Ag85B基因的l对引物
上游引物序列为P3 5' - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII(AAGCTT)酶切位点和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker 序列；
下游引物序列为P4 5' -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I (GGTACC)酶切位点和终止密码子；
2、重组质粒pVL的构建如图1和图4所示 (1) PCR法获得HBV L基因
L基因扩增模板取自乙肝表面抗原阳性患者血清。血清抽提采用苯酚/氯 仿抽提法。乙肝病毒DNA的提取采集静脉血，将100UL血清与蛋白酶K(PK) 缓冲液1UL混匀，加人10ULpK(20mg/mL)， 55。C过夜。与250UL饱和酚/氯仿 (l:l)混匀，10000转/min4。C离心5MIN， 500UL冰乙醇沉淀15MIN， 12000转 /min离心15MIN， 20UL TE缓冲液(10 mmol /L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐 (pH8.0) ，1腿ol /L乙二胺四乙酸二钠)溶解DNA后，一20。C保存备用。 以上述方法所得DNA提取液作为模板，用步骤(1)设计的引物P l和 P2进行常规链式聚合酶反应，扩增获得HBVL基因；扩增的PCR产物大小约 为1. 2Kb。
具体步骤如下将混合液在94'C预变性5 min，然后进入下列循环94 。C变性45s， 55。C退火45s， 72。C延伸1 min，共进行30个循环，最后72°C 再延伸10min，扩增完毕后置4'C终止反应；所述混合液组成如下
浓度为1Oumo1/1的上游引物Pl 1 y 1
浓度为lOumol/1的下游引物P2 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
DNA提取液 5 u 1
Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液(含Mg2+) 5 u 1
Ex耐热性DNA聚合酶 0. 25 u 1
灭菌水 33. 75 y 1
10PCR产物上样电泳(质量百分数为1%的琼脂糖凝胶电泳)，回收1.2KB 的目的条带，如图6所示
用OMEGA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物
(2) 将HBVL基因插入到pVAXl中
将纯化后的PCR产物和pVAXl质粒用Nhe I和Hind III进行双酶切处 理，具体反应体系如下PCR产物酶切体系10XM buffer 2yl ， Nhe I lul， Hind III lul， PCR产物6ul ，灭菌水lOul。载体pVAXl酶切 体系10XM buffer 2 u 1 ， Nhe I lul， Hind III lul， pVAX110ul， 灭菌水6ul.。反应体系旋涡振荡混匀后置于PCR仪中，37t:反应5小时。
用OMEGA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，酶切并纯化后的PCR片段HBV-L 与载体pVAXl质粒利用T4 DNA连接酶进行连接反应。体系配好混匀后16°C 过夜，连接产物4t:保存，在24h内进行转化。连接反应体系如下lOXLigase buffer 2ul， T4 DNA Ligase ;U 1， PCR片段5yl，载体片段10iU， 灭菌水3 u 1 。
(3) 转化
将上述连接反应产物以CaC12法转化至感受态大肠杆菌TOPIO中连 接产物5u 1与lOOix 1 T0P10感受态细菌混匀，冰浴30分钟，42°C热休 克90秒，迅速置冰中1-2分钟，加入LB培养基800 u 1置干燥恒温摇床中 200 rpm 37'C振摇45分钟，使细菌复苏并表达质粒编码的抗性基因。加于 含有卡那霉素的固体LB培养基平板上，室温放置20分钟，将培养皿倒置于 37"C培养箱中过夜。
(4) 筛选鉴定阳性克隆
16小时左右长出菌落。从平板中挑出单菌落于4ml含Kana 50 u g/mL 的LB培养基中，置37'C200rpm的恒温摇床中剧烈振摇6h，待抗性E. coli 生长并达到一定浓度后，取出lOOyl菌液于0.5ml EP管中，置沸水中煮 5min。冷却后取出1 u 1用作菌落PCR的模板。菌落PCR鉴定，如图7所示 将菌落PCR阳性的菌落扩增，提取质粒，进行双酶切鉴定，酶切产物用质量 分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图8所示。
2、重组质粒pVLA的构建(如图2和图5所示) (1) PCR法获得MTB-Ag85B基因
MTB H37Rv基因组DNA的提取与纯化将MTB H37Rv接种于改良罗氏培 养基，器皿口加橡皮塞于37。C培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢， 一般需2 4周长成肉眼可见的菌落。培养2-4周后，刮取少量细菌 于生理盐水中磨菌，用OMEGA细菌基因组DNA抽提试剂盒提取纯化基因组 腿。
以上述方法提取的基因组DNA为模板，用引物P3和P4进行常规链式聚 合酶反应，扩增Ag85B基因，扩增的PCR产物大小约为860bp。
具体步骤如下将混合液在94。C预变性5 min，然后进入下列循环94 。C变性45s， 52。C退火45 s， 72°〇延伸1 min，共进行30个循环，最后72 'C再延伸10min，扩增完毕后置4"C终止反应；所述混合液组成如下
浓度为10umo1/1的上游引物P3 1 ii 1
浓度为10umo1/1的下游引物P4 1 U 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
H37Rv基因组DNA 4ul
Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液(含Mg2+) 5 P 1
Ex耐热性DNA聚合酶 0. 25 " 1
灭菌水 34. 75 u 1
PCR产物上样电泳(质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳)，回收860bp的目 的条带，如图9所示。
用OMEGA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。 (2)将Ag85B插入到PVAX-L
将纯化后的PCR产物Ag85B和重组质粒pVL用Hind III和Kpn I进行 双酶切处理，具体反应体系如下PCR产物酶切体系lOXMbuffer 2ul， Kpnllul， Hind III lul， PCR产物6 u 1 ，灭菌水lOiU。载体Pvax-L 酶切体系lOXMbuffer 2ul， Kpn I 1， Hind III lul， pVL10 u 1 ， 灭菌水6ul 。反应体系旋涡振荡混匀后置于PCR仪中，37"C反应5小时。
用OMEGA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，酶切并纯化后的PCR片段Ag85B 与载体Pvax-L质粒利用T4 DNA连接酶进行连接反应。体系配好混匀后16 "C过夜，连接产物4t:保存，尽量24h内进行转化。连接反应体系如下10 XLigase buffer 2ul， T4 DNA Ligase lul， PCR片段5ul，载体片段 10u 1，灭菌水3u 1 。 (3)转化将上述连接反应产物以CaC12法转化至感受态大肠杆菌T0P10中连接 产物5u 1与100y 1 T0P10感受态细菌混匀，冰浴30分钟，42°C热休克 90秒，迅速置冰中1-2分钟，加入LB培养基800 ii 1置干燥恒温摇床中200 rpm 37'C振摇45分钟，使细菌复苏并表达质粒编码的抗性基因。加于含有 卡那霉素的固体LB培养基平板上，室温放置20分钟，将培养皿倒置于37 'C培养箱中过夜。
(4)筛选鉴定阳性克隆
16小时左右长出菌落。从平板中挑出单菌落于4ml含Kana 50 u g/mL 的LB培养基中，置37'C200rpm的恒温摇床中剧烈振摇6h，待抗性E. coli 生长并达到一定浓度后，取出100ul菌液于0. 5ml EP管中，置沸水中煮 5min。冷却后取出1 u 1用作菌落PCR的模板。菌落PCR鉴定，如图10所示将 菌落PCR阳性的菌落扩增，提取质粒，使用Hind III和Kpn I双酶切，Nhel、 Hind III和Kpn I三酶切鉴定，如图11和图12所示。 (5)重组质粒序列分析
经初步鉴定正确的重组质粒pVLA，还需要通过测序验证插入基因序列的 正确性，从插入片段的上游开始延顺时针方向采用双脱氧链末端终止法进行 单向测序，引物序列为pVAXl载体的通用引物，引物设计合成及测序工作由 上海生物技术工程公司完成。
3.重组质粒pVLA转染真核细胞及体外表达鉴定
(1) HEK293细胞的培养
(2) 重组质粒pVLA转染293细胞
1) HEK293细胞培养转染前1 d，将处于对数生长期的细胞用质量体 积比为0. 25%的胰酶消化，制备成单细胞悬液，以每孔lX10Vml接种6孔 培养板，每孔加含体积百分比为20。/。的胎牛血清的DMEM培养基2ml，在37 °C、体积百分比为5%的C02的饱和湿度培养箱中，细胞生长至面积百分比为 50% 60%。
2) 脂质体/DNA复合物制备A液为4 u g去内毒素的重组质粒pVLA稀释 于无血清OPTi-MEM培养基500" 1， B液为Lipofacta mine 2000 10u 1稀 释于OPTi-MEM培养基500 u 1，轻轻混合AB液成脂质体/DNA复合物，室温 放置20 min。
3) 转染准备用2 ml无血清躍EM培养基漂洗3次。4)转染:将脂质体/DNA复合物缓缓加入6孔培养板中，摇匀，37'C体积 百分比为5%的C02细胞培养箱中放置4 h，加入体积百分比的20%胎牛血清 的DMEM培养基，并置入培养箱中培养。
(3 )免疫组化检测融合蛋白在细胞中的表达
转染质粒DNA48h后，吸出培养基，每孔细胞加入300ul质量体积比 浓度为4%的多聚甲醛，4"固定过夜或37。C固定半小时，用磷酸盐缓冲液 (PBS)洗三次，每次5min。加过氧化物阻断溶液(质量体积比为3%的H202) 孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS洗三次，每次5min;再 加稀释后的一抗，4。C湿盒过夜;PBS冲洗三次，各5min。加生物素标记的第 二抗体，室温孵育10min， PBS冲洗三次，各5min。加链亲和素一过氧化酶 溶液，室温孵育10min。 二氨基联苯胺溶液(DAB)显色，水洗终止，光镜下 观察染色结果并拍照，如图14所示。
(4 )免疫印记检测融合蛋白的表达 1)细胞的裂解
PBS预冷，冰上配细胞裂解缓冲液，倒掉培养基，将培养细胞在冰上用 冰冷的PBS洗3次，甩净。加0. 7ml细胞裂解缓冲液(含有50mmol/L三羟 甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8. 0)， 150醒ol/L氯化钠，0.02%叠氮钠，0. 1%十二 烷基磺酸钠，100ug/ml异丙醇溶液，lug/ml抑肽酶，1%乙基苯基聚乙二醇， 0.5%去氧胆酸钠)，冰上放置20min隔一段时间摇一摇培养瓶。用细胞刮子 将贴壁细胞刮离，移至1. 5ml离心管中。12000xg离心5 min。取上清，-80 'C保存。
2 )蛋白质SDS-PAGE电泳
采用SDS-PAGE电泳，底层分离胶为8% (体积百分比)、上部积层胶为 5% (体积百分比)；待测蛋白样品与2XSDS加样缓冲液按等体积混匀，100 。C加热3-5min。上样，室温下1 XSDS电泳缓冲液中，开始电压为130V，进 入分离胶后该为170V电泳至染料抵达分离胶底部，约lh(双面两个完全相同 的SDS-PAGE电泳)。
电泳完毕取下凝胶，在5倍体积的固定液中室温缓慢摇动2h， 5倍体 积的考马斯亮蓝染色液浸泡、室温缓慢摇动4h。 50ml固定液冲洗、脱色液 再缓慢摇动至获得蓝色条带及干净的背景，期间换液3-4次。将脱色后的凝 胶照像。
3)蛋白印迹》去(Western blotting)电泳后的另一凝胶置转移缓冲液中室温平衡30min。依次组装转印夹层 海绵垫层、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜(NC膜)、滤纸、海绵垫层(NC膜和 滤纸均与凝胶等大，并预先以转移缓冲液湿润)。排出所有气泡。前后端用 多孔有机玻璃板扣紧，在转移缓冲液中冷却条件下恒流350mA，电转50min。 转印结束，取出转印膜，膜上标记定位。凝胶用考马斯亮蓝染色以确定转移 效率。转印膜置于平皿中，加lxPBST缓冲液，在水平摇床上缓慢摇动lh; 将NC膜浸入质量体积比为5%的脱脂奶粉中，37"C于水平摇床缓和振荡lh; lxPBST洗膜3次，每次10min;将NC膜封于杂交袋中，用Mouse Anti- HBsAg 单克隆抗体按照l: 400的稀释倍数用lxPBS稀释，杂交袋中加入相应的一 抗稀释液5ml，排尽袋中气体，封口，水平摇床振荡，4"C反应过夜；将NC 膜从杂交袋中小心取出，lxPBST (将20mL灭菌磷酸盐缓冲液中加入10 y L 0. 05 %吐温20)洗膜3次，每次1 Omin。再将NC膜封于杂交袋中，用 辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG 二抗血清按照1: 5000的稀释倍数用 lxPBS稀释，杂交袋中加入相应的二抗稀释液5ml，排尽袋中气体，封口， 37。C水平摇床振荡2-3h;取出NC膜，lxPBST洗膜3次，每次10min，用ECL 试剂盒以发光法显色，显影1 min，曝光5min，如图15所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上 述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改 变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的 保护范围序列表
〈110〉 李君武
〈120〉乙肝L基因与结核杆菌Ag85B融合基因及其表达载体的构建和应用
〈130〉 2
〈160〉 5
<170> Patentln version 3. 5
〈210〉 1
〈211〉 2093
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 1
gctagcgtaatgggaggttggtcttccaaacctcgacaaggcatggggacaaatctttct60
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gtatacattaagcttggatccggaggttcattctcccggccggggctgccggtcgagtac1260<image>image see original document page 17</image>〈213〉人工序列 <400〉 4
ttataagctt ggatccggag gttcattctc ccggccgggg ctg 43
〈210〉 5 〈211〉 29 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 5
aatggtacct cagccggcgc ctaacgaac 29
权利要求
1、一种乙肝病毒全包膜L基因和结核杆菌Ag85B基因的融合基因，其特征在于其序列如SEQ ID NO.1所述。
2、 一种包含了权利要求1所述乙肝病毒全包膜L基因和结核杆菌Ag85B 基因的融合基因的真核表达载体的构建和表达方法，其特征在于包括以下步骤(1) 引物设计根据乙肝病毒全包膜L基因的编码序列，设计扩增乙肝病毒全包膜L基因的l对引物上游引物序列为Pl 5' -CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel 酶切位点和起始密码子ATG;下游引物序列为P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind III酶切位点，并删除终止密码子；根据人结核分支杆菌H37Rv株Ag85B基因的编码序列，设计扩增结核杆 菌Ag85B基因的l对引物上游引物序列为P3 5, - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII酶切位点和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker序列；下游引物序列为P4 5' -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I酶切位点和终止密码子；(2) 重组质粒pVL的构建 将乙肝表面抗原阳性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法获得DNA提取液，作为L基因扩增模板，用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应， 扩增出乙肝病毒全包膜L基因片段，将纯化后的乙肝病毒全包膜L基因片段和 质粒pVAXl分别用Nhel和HindlII进行双酶切，纯化、连接、转化获得重组质 粒pVL;(3)重组质粒pVLA的构建提取人结核分支杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，用步骤(1)设计的 引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应，扩增获得结核杆菌Ag85B基因；将 纯化的结核杆菌Ag85B基因与步骤(2)所得重组质粒pVL分别用HindIII 和Kpn I双酶切，纯化、连接、转化获得重组质粒pVLA (4)重组质粒pVLA转染真核细胞及体外表达鉴定将酶切和测序鉴定正确的步骤(3)所得重组质粒pVLA转染HEK293细胞，并通过免疫组织化学法和免疫印记法检测融合基因的表达蛋白质。
3、根据权利要求2所述真核表达载体的构建和表达方法，其特征在于:步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体歩骤如下将混合液在94t:预变性 5 min，然后进入下列循环94°C、 45s，55。C、 45s， 72°C、 lmin，共进行30 个循环，最后72。C延伸10min，扩增完毕后置4。C终止反应；所述混合液组成如下浓度为10umo1/1的上游引物Pl 1 u 1浓度为10umol/l的下游引物P2 ly 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度各为2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1DNA提取液 5 u 1含Mg"的Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 ii 1Ex耐热性DNA聚合酶 0. 25 u 1灭菌水 33.75ul
4、根据权利要求2所述真核表达载体的构建和表达方法，其特征在于 步骤(3)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94。C预变性 5 min，然后进入下列循环94°C、 45s，52。C、 45s， 72°C、 1 min,共进行 30个循环，最后72。C延伸10min，扩增完毕后置4。C终止反应；所述混合液组成如下浓度为1Oumo1/1的上游引物P3 1 U 1浓度为1Oumo1/1的下游引物P4 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度各为2. 5 raM的dNTP混合物 4 u 1H37Rv基因组DNA 4iU含Mg"的Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 u 1Ex耐热性DNA聚合酶 0. 25 P 1灭菌水 34. 75 u 1
5、 根据权利要求2所述方法构建的真核表达载体作为制备乙肝和结核 联合疫苗的用途。
6、 根据权利要求2所述方法表达的融合基因的表达蛋白质作为制备乙 肝和结核联合疫苗的用途。
全文摘要
本发明公开了一种乙肝病毒全包膜L基因与结核杆菌Ag85B的融合抗原基因及其构建和表达方法。该融合基因的真核表达载体pVLA的构建和表达根据乙肝病毒全包膜L基因设计1对扩增乙肝病毒全包膜L基因的引物，根据结核杆菌Ag85B基因的编码序列设计1对扩增Ag85B基因的引物；重组质粒pVL的构建；重组质粒pVLA的构建；重组质粒pVLA转染真核细胞及体外表达鉴定。本发明融合抗原基因及其真核表达载体和表达蛋白质均可用于制备乙肝和结核的联合DNA疫苗。
文档编号C12N15/79GK101509009SQ200910037758
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者李君武 申请人:李君武