专利名称：辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对。
背景技术：
植物寄生线虫病是一种世界范围内普遍发生的植物病害，危害3000多种植物。全 球每年因线虫造成的损失高达1000多亿美元。植物根结线虫病害在我国发生比较广泛，尤 其在南方地区危害比较严重，如香蕉根结线虫、西瓜根结线虫、辣椒根结线虫。由于根结线 虫种间存在显著的致病性差异，作物抗性和植物检疫等成功的应用依赖于对根结线虫种类 进行快速、准确的鉴定，因而，采取可靠的分类鉴定方法是植物线虫病害防治的基础。目前，国内外学者常利用mtDNA-RFLP、rDNA-ITS及SCAR等方法鉴定根结线虫的种 类，然而因其各自的局限性(mtDNA-RFLP耗时较长、rDNA-ITS精确度不高、SCAR灵敏度不 强)而不能达到快速、准确鉴定的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对。本发明保护序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对乙。 所述引物对乙可用于辅助鉴别南方根结线虫。本发明还保护一种辅助鉴别南方根结线虫的方法，包括如下步骤(1)提取待测根结线虫的基因组DNA ；(2)以基因组DNA为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增；如果得到PCR扩增产物， 待测根结线虫为候选的南方根结线虫；如果没有得到PCR扩增产物，待测根结线虫为候选 的非南方根结线虫。所述PCR扩增产物具体可为400bp-600bp。本发明还保护引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序 列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA 和序列表的序列4所示DNA组成。所述专用引物可用于辅助鉴别根结线虫。本发明还保护一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤(1)提取待测根结线虫的基因组DNA ；(2)以基因组DNA为模板，用所述专用引物进行PCR扩增；用所述引物对乙进行PCR扩增时如果得到PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的 南方根结线虫；如果没有得到PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的非南方根结线虫；用所述引物对甲进行PCR扩增时如果得到1. 6kb-l. 8kb的PCR扩增产物，待测根 结线虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如果得到1. Okb-1. 2kb的PCR扩增产物，待 测根结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到0. 4kb-0. 6kb的PCR扩增产物，待测根结线虫 为候选的北方根结线虫。用所述引物对乙进行PCR扩增得到的PCR扩增产物具体可为400bp_600bp。本发明还保护序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对甲。所述引物对甲可用于辅助鉴别根结线虫。本发明提供了另一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤(1)提取待测根结线虫的基因组DNA ；(2)以基因组DNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；如果得到1. 6kb-l. 8kb 的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如果得 到1.01Λ-1.21Λ的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到 0. 4kb-0. 6kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的北方根结线虫。以上任一所述辅助鉴别根结线虫的方法中所述待测根结线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫或北方根结线 虫。所述基因组DNA取自成虫、幼虫或卵囊。当基因组DNA取自成虫或幼虫、所述PCR所用的引物对为所述引物对甲时，所述 PCR的反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性lmin、48°C退火lmin、72°C延伸2min，进行 40个循环；最后72°C保温5min。当基因组DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物对为所述引 物对甲时，所述PCR的反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性lmin、48°C退火lmin、72°C 延伸2min，进行；35个循环；最后72°C保温5min。当基因组DNA取自成虫或幼虫、所述PCR所用的引物对为所述引物对乙时，所述 PCR的反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，进行40 个循环；最后72°C保温5min。当基因组DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物对为所述引物 对乙时，所述PCR的反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸 45S，进行；35个循环；最后72°C保温^iin ；以上任一所述方法在均可用于辅助鉴定根结线虫染病植物。应用本发明的引物对辅助鉴定时，基因组DNA既可以取自线虫成虫、线虫幼虫、线 虫卵囊，也可以取自感染根结线虫的植物的根结(根瘤)。为了克服现有的方法不能快速、准确地鉴定根结线虫的不足，本专利提供一种鉴 定根结线虫的方法，该PCR方法不仅能准确区分四种常见的根结线虫，而且灵敏度高，可利 用单个卵囊或单条二龄幼虫鉴定根结线虫种类，可以直接从病组织中分离获得，无需纯化 培养，可以大大缩短线虫纯化培养时间，提高检测效率。
图1为实施例2中采用引物对甲的PCR扩增产物的电泳图。图2为实施例2中采用引物对乙的PCR扩增产物的电泳图。图3为实施例5中采用引物对甲的PCR扩增产物的电泳图。
图4为实施例5中采用引物对乙的PCR扩增产物的电泳图。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。8个根结线虫种群5个南方根结线虫种群(分离自5个染病植株)；1个爪哇根结 线虫种群；1个花生根结线虫种群；1个北方根结线虫种群。实施例1、引物的制备人工合成如下四条引物#C2F3 :5，-GGTCAA TGTCAGAAA TTTGTGG-3‘；序列 1 ；#1108:5' -TACCTTTGACCAA TCACGCT-3‘；序列 2 ；MI-F :5，-GGGCAAGTAAGGATGCTCTGAC-3‘；序列 3 ；MI-R (5 ‘ -CTTTCATAGCCACGTCGCGATC-3 ‘；序列 4。#C2F3和# 1108组成的引物对作为引物对甲，MI-F和MI-R组成的引物对作为引物 对乙。引物对甲针对线粒体DNA(mtDNA)中的CO II和LrRNA间区域。引物对乙针对食管
腺蛋白基因。实施例2、应用引物对辅助鉴别根结线虫(成虫)一、用引物对甲辅助鉴别根结线虫1、提取单条根结线虫(成虫)的基因组DNA。2、以基因组DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR 反应程序94°C预变性 ^iin ；94°C变性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 进行40个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0. 5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软 件注册号000395 对条带大小进行分析。结果见图1。图1中M 标准分子量；1-5 南方根结线虫；6 爪哇根结线虫；7 花 生根结线虫；8 北方根结线虫；9 :CK(不加模板)。条带大小分析结果南方根结线虫和爪 哇根结线虫的PCR扩增产物约为1. 7kb(l. 6kb-l. 8kb之间)，花生根结线虫的PCR扩增产 物约为1. Ikb (1. Okb-1. 2kb之间)，北方根结线虫的PCR扩增产物约为0. 5kb (0. 4kb-0. 6kb 之间)。二、用引物对乙辅助鉴别根结线虫成虫1、提取单条根结线虫(成虫)的基因组DNA。2、以基因组DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反应程序94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，进行 40个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0. 5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软件注册号000395 对条带大小进行分析。结果见图2。图2中M 标准分子量；1-5:南方根结线虫；6:爪哇根结线虫；7: 花生根结线虫；8 北方根结线虫；9 :CK(不加模板)。除了南方根结线虫，其它三种根结 线虫均没有得到PCR扩增产物。条带大小分析结果南方根结线虫的PCR扩增产物约为 500bp (400b-600b 之间)。实施例3、应用引物对辅助鉴别根结线虫幼虫O龄幼虫)—、用引物对甲辅助鉴别根结线虫1、提取单条根结线虫O龄幼虫)的基因组DNA。2、以基因组DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR 反应程序94°C预变性 ^iin ；94°C变性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 进行40个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为
0.5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软 件注册号000395 对条带大小进行分析。条带大小分析结果南方根结线虫和爪哇根结线虫的PCR扩增产物约为
1.7kb (1. 6kb-l. 8kb之间)，花生根结线虫的PCR扩增产物约为1. Ikb (1. Okb-1. 2kb之间)， 北方根结线虫的PCR扩增产物约为0. 5kb (0. 4kb-0. 6kb之间)。二、用引物对乙辅助鉴别根结线虫成虫1、提取单条根结线虫O龄幼虫)的基因组DNA。2、以基因组DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反应程序94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，进行 40个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0. 5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软 件注册号000395 对条带大小进行分析。除了南方根结线虫，其它三种根结线虫均没有得到PCR扩增产物。条带大小分析 结果南方根结线虫的PCR扩增产物约为500bp (400b-600b之间)。实施例4、应用引物对辅助鉴别根结线虫幼虫(卵囊)—、用引物对甲辅助鉴别根结线虫1、提取根结线虫卵囊的基因组DNA。2、以基因组DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。
PCR 反应程序94°C预变性 ^iin ；94°C变性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 进行35个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行(含0.5yg/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为
0.5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软 件注册号000395 对条带大小进行分析。条带大小分析结果南方根结线虫和爪哇根结线虫的PCR扩增产物约为
1.7kb (1. 6kb-l. 8kb之间)，花生根结线虫的PCR扩增产物约为1. Ikb (1. Okb-1. 2kb之间)， 北方根结线虫的PCR扩增产物约为0. 5kb (0. 4kb-0. 6kb之间)。二、用引物对乙辅助鉴别根结线虫成虫1、提取根结线虫卵囊的基因组DNA。2、以基因组DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反应程序94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，进行 35个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0. 5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软 件注册号000395 对条带大小进行分析。除了南方根结线虫，其它三种根结线虫均没有得到PCR扩增产物。条带大小分析 结果南方根结线虫的PCR扩增产物约为500bp (400b-600b之间)。实施例5、应用引物对检测染病植物取自海南的染病植物样本如下香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜、黄瓜。一、用引物对甲检测染病植物1、取染病植物的根结(根瘤)，提取总DNA。2、以总DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR 反应程序94°C预变性 ^iin ；94°C变性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 进行35个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0. 5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软 件注册号000395 对条带大小进行分析。结果见图3。图3中M 标准分子量；1 香蕉；2 番茄；3 辣椒；4 甜瓜；5 序菜； 6 黄瓜。6种染病植物均得到约为1. 7kb (1. 6kb-l. 8kb之间)的PCR扩增产物。说明6种 植物均为南方根结线虫或爪哇根结线虫侵染。二、用引物对乙检测染病植物
1、取染病植物的根结(根瘤)，提取总DNA。2、以总DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反应程序94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，进行 40个循环；最后72°C保温5min。3、PCR扩增产物进行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0. 5XTBE,电压为80V，电泳约30min。在凝胶图像系统(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系统的自带软件(天能GIS凝胶图像处理系统；版本4. 00，软 件注册号000395 对条带大小进行分析。结果见图4。图4中M 标准分子量；1 香蕉；2 番茄；3 辣椒；4 甜瓜；5 芹菜； 6:黄瓜。香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜均得到约为500bp(400b-600b之间)的PCR扩增产 物，黄瓜没有得到PCR扩增产物。结合步骤一的结果，得出结论如下香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜均为南方根结线 虫侵染。黄瓜为爪哇根结线虫侵染。
权利要求
1.序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对乙。
2.权利要求1所述引物对乙在辅助鉴别南方根结线虫中的应用。
3.一种辅助鉴别南方根结线虫的方法，包括如下步骤(1)提取待测根结线虫的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对乙进行PCR扩增；如果得到PCR扩 增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫；如果没有得到PCR扩增产物，待测根结线虫 为候选的非南方根结线虫。
4.引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序列1所示DNA和 序列表的序列2所示DNA组成；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列 4所示DNA组成。
5.权利要求4所述专用引物在辅助鉴别根结线虫中的应用。
6.一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤(1)提取待测根结线虫的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，用权利要求4所述专用引物进行PCR扩增；用所述引物对乙进行PCR扩增时；如果得到PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的南方 根结线虫；如果没有得到PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的非南方根结线虫；用所述引物对甲进行PCR扩增时；如果得到1. 6kb-l. 8kb的PCR扩增产物，待测根结线 虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如果得到1. Okb-1. 2kb的PCR扩增产物，待测根 结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到0. 4kb-0. 6kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候 选的北方根结线虫。
7.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对甲。
8.一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤(1)提取待测根结线虫的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，用权利要求7所述引物对甲进行PCR扩增；如果得到 1. 6kb-l. 8kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如 果得到1.01Λ-1.21Λ的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到 0. 4kb-0. 6kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的北方根结线虫。
9.如权利要求3、6或8所述的方法，其特征在于权利要求6或8的步骤(1)中所述待测根结线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花 生根结线虫或北方根结线虫；权利要求3、6或8中所述基因组DNA取自成虫、幼虫或卵囊；当基因组DNA取自成虫或幼虫、所述PCR所用的引物对为所述引物对甲时，所述PCR的 反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性lmin、48°C退火lmin、72°C延伸2min，进行40个循 环；最后72°C保温5min ；当基因组DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物对为所述引物对甲时，所述PCR的反应程 序为94°C预变性^iin ；94°C变性lmin、48°C退火lmin、72°C延伸2min，进行35个循环；最 后72°C保温5min ；当基因组DNA取自成虫或幼虫、所述PCR所用的引物对为所述引物对乙时，所述PCR的 反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，进行40个循环；最后72°C保温5min ；当基因组DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物对为所述引物对乙时，所述PCR的反应程 序为94°C预变性^iin ；94°C变性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，进行35个循环；最后 72°C 保温 5min ；用所述引物对乙进行PCR扩增得到的PCR扩增产物为400bp-600bp。
10.权利要求1至9中任一所述方法在辅助鉴定根结线虫染病植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对。本发明提供了引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。所述专用引物可用于辅助鉴别根结线虫。本发明提供的方法，不仅能准确区分四种常见的根结线虫，而且灵敏度高，可利用单个卵囊或单条二龄幼虫鉴定根结线虫种类，可以直接从病组织中分离获得，无需纯化培养，可以大大缩短线虫纯化培养时间，提高检测效率。
文档编号C12N15/11GK102102100SQ201010175658
公开日2011年6月22日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者吴伦英, 吴 琳, 景晓辉, 朱利林, 杨腊英, 汪军, 薛玉潇, 黄俊生 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所