使用flt3抑制剂和法尼基转移酶抑制剂协同调节flt3激酶的制作方法

专利名称：使用flt3抑制剂和法尼基转移酶抑制剂协同调节flt3激酶的制作方法
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本申请要求2006年4月19日提交的美国临时申请号60/793,320和2005年6月10日提交的美国临时申请号60/690,070的优先权，其全部内容以其全文并入此处作为参考。
发明领域 本申请涉及使用法尼基转移酶抑制剂结合FLT3酪氨酸激酶抑制剂治疗细胞增生疾病或与FLT3相关的疾病。

背景技术：
FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)配体(FLT3L)为影响多种造血体系发展的细胞因子之一。这些影响通过FLT3L结合到FLT3受体上发生，还称为胎肝激酶-2(flk-2)和STK-1、表达在造血干细胞和祖细胞上的受体酪氨酸激酶(RTK)。FLT3基因编码跨膜III型RTK，其在正常血细胞生成期间在细胞的繁殖、分化和凋亡中起重要作用。FLT3基因主要通过早期骨髓和淋巴祖细胞表达。参见McKenna，Hilary J.等人，Micelacking flt3 ligand have deficient hematopoiesis affecting hematopoieticprogenitor cells，dendritic cells，and natural killer cells.Blood.2000年6月；953489-3497；Drexler，H.G.和H.Quentmeier(2004).″FLT3receptorand ligand.″Growth Factors 22(2)71-3。
FLT3配体通过骨髓基质细胞和其它细胞表达，并且与其它生长因子协同以刺激干细胞、祖细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的增殖。
造血病症为这些系统的癌变前疾病，例如包括脊髓增生病，例如血小板增多症、原发性血小板增多症(ET)、血管生成髓样化生、骨髓纤维化症(MF)、伴有髓样化生的骨髓纤维化症(MMM)、慢性特发性骨髓纤维化(IMF)、真性红细胞增多症(PV)、血细胞减少症和癌变前骨髓发育异常综合征。参见Stirewalt，D.L.和J.P.Radich(2003)，“Therole of FLT3 in haematopoietic malignancies”，Nat Rev Cancer 3(9)650-65；Scheijen，B.和J.D.Griffin(2002)，“Tyrosine kinase oncogenes innormal hematopoiesis and hematological disease”，Oncogene 21(21)3314-33。
血液恶性肿瘤为身体血管形成和免疫系统、骨髓和淋巴组织的癌症。然而在正常骨髓中，FLT3表达仅限于早期祖细胞中，在血液恶性肿瘤中，FLT3以高浓度表达，或者FLT3突变引发FLT3受体和下游分子通道的非受控诱导，很可能Ras活化。血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤(非何杰金淋巴瘤)、何杰金病(还称为何杰金淋巴瘤)，和骨髓瘤例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、急性未分化性白血病(AUL)、间变性的巨细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞白血病(PML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、成人T-细胞ALL、伴随骨髓三系细胞异常增生的AML(AML/TMDS)、混合性白血病(MLL)、骨髓发育异常综合征(MDSs)、脊髓增生病(MPD)、多发性骨髓瘤(MM)和髓细胞肉瘤。参见Kottaridis，P.D.，R.E.Gale等人(2003)，“Flt3 mutations and leukaemia”，Br J Haematol 122(4)523-38。髓细胞肉瘤还与FLT3突变有关。参见Ansari-Lari，Ali等人，FLT3 mutations in myeloid sarcoma.British Journal of Haematology.2004年9月，126(6)785-91。
急性髓细胞性白血病(AML)为成年白血病的最普遍形式并且占儿童期白血病的15-20％。美国在2002年诊断出约11000个新病例并且估计8000患者死于AML。参见美国国家癌症学会SEER数据库http://seer.cancer.gov/。虽然AML诊断传统上基于组织学方法和血液白细胞计数，细胞遗传和基因分析的最新进展已经揭示了AML为不同疾病的混合，区别在于其基因异常、临床特征和对治疗的响应。最近的研究已经开始使化学疗法适合不同亚型的AML(亚型基于疾病相关的蛋白质表达的细胞遗传分析和免疫组织化学分析)，并取得一定成功。AML的治疗通常存在两个阶段诱导和诱导后治疗。诱导治疗通常包括三剂蒽环类抗生素例如柔红霉素，然后静脉内弹丸浓注细胞毒素阿糖胞苷7-10天。这种治疗方案有效在60岁以下患者中产生70-80％症状缓解，在60岁以上患者产生约50％症状缓解。参见Burnett，A.K.(2002)，“Acute myeloid leukemiatreatment of adults under 60 years”，Rev ClinExp Hematol 6(1)26-45；Buchner T.，W.Hiddemann等人，(2002)，“Acute myeloid leukemiatreatment over 60”，Rev Clin Exp Hematol.6(1)46-59。诱导治疗后存在几种诱导后选择，包括化学疗法或骨髓移植的其它循环。诱导后治疗的选择和成功取决于患者的年龄和AML的亚型。虽然AML的诊断和治疗在过去的十年期间的进展，65岁以下患者的5年健康存活率仅仅为40％，并且65岁以上患者的5年健康存活率小于10％。因此对于AML，特别是对于65岁以上患者，仍然存在显著的、未满足的需要。随着不同亚型AML机理认识的不断增加，新设计的治疗方案开始以有希望的效果引入。
复发和难治疗AML的治疗中的最新成果在于诱导后治疗的法尼基转移酶抑制剂(FTI)的研制和使用。法尼基转移酶抑制剂为胞内法尼基蛋白质转移酶(FPT)的一类有效选择性抑制剂。FPT催化多种胞内蛋白(包括Ras和Rho家族的小分子鸟苷酸三磷酸酶和核纤层蛋白)的脂质修饰，以指示其到细胞内质膜或膜隔室的定位。
FTIs最初研制用于预防Ras肿瘤蛋白的翻译后法尼基化和活化(Prendergast G.C.和Rane，N.(2001)“Farnesyl Transferase InhibtorsMechanism and Applications”Expert Opin Investig Drugs.10(12)2105-16)。最近的研究还表明，通过Ras-依赖的Nf-xB活化的抑制，FTI产生的Nf-xB活化抑制产生对炎性基因表达的细胞凋亡和下调的增加的敏感性。参见Takada，Y.等人，(2004)，“Proteinfarnesyltransferase inhibitor(SCH 66336)abolishes NF-kappaB activationinduced by I various carcinogens and inflammatory stimuli leading tosuppression of NF-kappaB-regulated gene expression and up-regulation ofapoptosis”，J Biol Chem 279，26287-99。
对于肿瘤特别令人感兴趣的是，Ras和Rho家族致癌基因的FTI抑制导致肿瘤细胞体外和体内的生长抑制和凋亡。参见Haluska P.，G.K.Dy，A.A.Adjei.(2002)，“Farnesyl transferase inhibitors as anticanceragents”，Eur J Cancer.38(13)1685-700。从临床观点来看，脊髓恶性肿瘤特别是AML代表了FTI疗法的重要机会。
如先前所述，AML为具有非常低长期存活率和增加化学疗法所致毒性和抗性的疾病(特别是60岁以上患者)。此外，AML细胞增殖机制依赖于Ras和Rho家族的小分子鸟苷酸三磷酸酶。随着AML治疗中表明FTIs效力的临床前数据的过多，开始了使用FTI的几种临床试验，包括R115777(Zarnestra，Johnson and Johnson)、BMS-214662、CP-60974(Pfizer)和Sch-6636(lonafarnib，Schering-Plough)。
ZARNESTRA

(还已知为R115777或tipifarnib)为最先进和最有前途的FTI类化合物。在患有反复和顽固AML的患者的临床治疗中，zarnestra治疗产生包括两个实现彻底症状缓解的30％的响应速率。参见Lancet J.E.，J.D.Rosenblatt，J.E.Karp.(2003)，“Farnesyltransferaseinhibitors and myeloid malignanciesphase I evidence of Zarnestra activityin high-risk leukemias”，Semin Hematol.39(3增刊2)31-5。由于试验中没有患者具有时常在AML患者中发现的Ras突变，这些响应的存在与患者Ras突变状态无关。然而在治疗开始时存在患者响应与其丝裂原活化蛋白激酶(Ras和Rho蛋白质活化的下游目标)的直接相关，表明通过其它机理活化的Ras/丝裂原活化蛋白激酶(MAPkinase)通道的活性可为患者响应的良好预测因子。参见Lancet J.E.，J.D.Rosenblatt，J.E.Karp.(2003)，“Farnesyltransferase inhibitors and myeloid malignanciesphase I evidence of Zarnestra activity in high-risk leukemias”，SeminHematol.39(3增刊2)31-5。此外，患有复发AML患者的最新多通道II期试验表明在50个患者中17个中的完全响应(骨髓胚细胞＜5％)，以及50个患者中31个中骨髓胚细胞＞50％的降低。在Gotlib，J(2005)“Farnesyltransferase inhibitor therapy in acute myelogenous leukemia”，Curr.Hematol.Rep.；4(1)77-84中的综述。在此实验中反应者FTI治疗调节的基因的初步分析还表明在丝裂原活化蛋白激酶通道中对蛋白的影响。这种满意结果使得本领域专家期望将Zarnestra近期用于治疗。
最近已经出现了用于治疗AML以及患有MDS和ALL患者亚类的另一目标。已经确定受体酪氨酸激酶、FLT3和FLT3的突变为AML发病的关键因素。将FLT3活性连接到这些疾病的多种研究的概要已经广泛综述于Gilliland，D.G.和J.D.Griffin(2002)，“The roles ofFLT3 inhematopoiesis and leukemia”，Blood 100(5)1532-42，以及Stirewalt，D.L.和J.P.Radich(2003)，“The role of FLT3 in haematopoieticmalignancies”，Nat Rev Cancer 3(9)650-65中。90％以上AML患者在胚细胞中具有FLT3表达。现在已知大约30-40％AML患者具有FLT3活化突变，使得FLT3突变为AML患者中最常见的突变。存在两种已知类型的FLT3活化突变。一种为受体近膜区(ITD突变)中4-40％氨基酸的复制，并且另一种为激酶区中的基因点突变(5-7％患者)。这些受体突变引起包括Ras/丝裂原活化蛋白激酶、PI3激酶/AKT和STAT通道的多种信号传导通道的组成性活化。此外，FLT3ITD突变还已经表明降低早期骨髓细胞的分化。更值得注意的是，具有ITD突变的患者具有降低的症状缓解诱导速率、降低的症状缓解时间和更差的总体预后。FLT3ITD突变还已经发现于具有MLL基因重排的ALL中，并且还发现于MDS患者子群中。MDS和ALL中FLT3ITD突变的存在还与这些患者中加速的疾病病变和更差的预后有关。参见Shih L Y.等人，(2004)，“Internal tandem duplication of fms-like tyrosine kinase 3 is associatedwith poor outcome in patients with myelodysplastic syndrome”，Cancer，101；989-98；和Armstrong，S.A.等人，(2004)，“FLT3 mutations inchildhood acute lymphoblastic leukemia”，Blood.1033544-6。到目前为止，还没有强有力证据表明激酶领域的点突变或过度表达的野生型受体为疾病的原因，然而FLT3表达可能促进该疾病的发展。这些组合临床前和临床证据已经引起了多种FLT3抑制剂的研发，其目前正在临床前和临床环境中评价。
治疗AML形成的策略为在诱导和/或诱导后疗法中直接靶向药物和常规细胞毒素的组合。原理方面的最新证据已经公开，其表明细胞毒素(例如阿糖胞苷或柔红霉素)和FLT3抑制剂的组合抑制了表达FLT3ITD的AML细胞的生长。参见Levis，M.，R.Pham，等人，(2004)，“In vitro studies of a FLT3 inhibitor combined with chemotherapysequence of administration is important to achieve synergistic cytotoxiceffects”，Blood 104(4)1145-50，以及Yee KW，Schittenhelm M，O′FarrellAM，Town AR，McGreevey L，Bainbridge T，Cherrington JM，Heinrich MC.(2004)，“Synergistic effect of SUl1248 with cytarabine or daunorubicin onFLT3ITD-positive leukemic cells”，Blood.104(13)4202-9。
因此本发明提供了用于治疗FLT3表达细胞增殖病症的协同治疗方法，包括共同给药(同时或相继)此处所述新FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。
各种法尼基转移酶抑制剂当前已知。适用于本发明的FTIs为以下WO-97/21701和美国专利6,037,350，以其全文并入此处，其中公开了某些抑制法尼基转移酶的式(I)、(II)和(III)的(咪唑-5-基)甲基-2-喹啉酮(quinolinone)，以及体内代谢成式(I)化合物的式(II)和(III)中间体的制备、制剂和药学性质。式(I)、(II)和(III)化合物由下式
其药学上可接受的酸或碱加成盐以及立体化学异构形式表示，其中 虚线表示任选的键； X为氧或硫； R1为氢、C1-12烷基、Ar1、Ar2C1-6烷基、喹啉基C1-6烷基、吡啶基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、氨基C1-6烷基，或者式-Alk1-C(＝O)-R9、-Alk1-S(O)-R9或-Alk1-S(O)2-R9的基团，其中Alk1为C1-6烷二基， R9为羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基、C1-8烷氨基或被C1-6烷氧羰基取代的C1-8烷氨基， R2、R3和R16每个独立地为氢、羟基、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、氨基C1-6烷氧基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、Ar1、Ar2C1-6烷基、Ar2氧基、Ar2C1-6烷氧基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、C2-6烯基、4，4-二甲基噁唑基；或 当处于相邻位置时，R2和R3一起可以形成下式二价基团 -O-CH2-O- (a-1)， -O-CH2-CH2-O- (a-2)， -O-CH＝CH-(a-3)， -O-CH2-CH2- (a-4)， -O-CH2-CH2-CH2- (a-5)，或 -CH＝CH-CH＝CH- (a-6) R4和R5每个独立地为氢、卤素、Ar1、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基； R6和R7每个独立地为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ar2氧基、三卤代甲基、C1-6烷硫基、二(C1-6烷基)氨基，或 当处于相邻位置时，R6和R7一起可以形成下式二价基团 -O-CH2-O- (c-1)，或 -CH＝CH-CH＝CH- (c-2)， R8为氢、C1-6烷基、氰基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、咪唑基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基，或下式基团 -O-R10 (b-1)， -S-R10 (b-2)， -N-R11R12(b-3)， 其中R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1、Ar2C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基，或式-Alk2-OR13或-Alk2-NR14R15的基团； R11为氢、C1-12烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R12为氢、C1-6烷基、C1-16烷基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基氨基羰基、Ar1、Ar2C1-6烷基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、天然氨基酸、Ar1羰基、Ar2C1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、羟基、C1-6烷氧基、氨基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰基、氨基、C1-6烷氨基、C1-6烷基羰基氨基，或式-Alk2-OR13或-Alk2-NR14R15的基团； 其中，Alk2为C1-6烷二基； R13为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基C1-6烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R14为氢、C1-6烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R15为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R17为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、Ar1； R18为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素； R19为氢或C1-6烷基； Ar1为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基； Ar2为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基。
以其全文并入此处的WO-97/16443和美国专利5,968,952公开了式(IV)的法尼基转移酶抑制化合物的制备、制剂和药学性质，以及体内代谢为式(IV)化合物的式(V)和(VI)中间体。式(IV)、(V)和(VI)化合物由下式、
其药学上可接受的酸或碱加成盐以及其立体化学异构形式表示，其中 虚线表示任选的键； X为氧或硫； R1为氢、C1-12烷基、Ar1、Ar2C1-6烷基、喹啉基C1-6烷基、吡啶基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、氨基C1-6烷基，或式-Alk1-C(＝O)-R9、-Alk1-S(O)-R9或-Alk1-S(O)2-R9的基团，其中Alk1为C1-6烷二基， R9为羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基、C1-8烷氨基或被C1-6烷氧羰基取代的C1-8烷氨基， R2和R3每个独立地为氢、羟基、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、氨基C1-6烷氧基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、Ar1、Ar2C1-6烷基、Ar2氧基、Ar2C1-6烷氧基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、C2-6烯基；或当处于相邻位置时，R2和R3一起可以形成下式二价基团 -O-CH2-O-(a-1)， -O-CH2-CH2-O-(a-2)， -O-CH＝CH- (a-3)， -O-CH2-CH2- (a-4)， -O-CH2-CH2-CH2- (a-5)，或 -CH＝CH-CH＝CH- (a-6)； R4和R5每个独立地为氢、Ar1、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基； R6和R7每个独立地为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或Ar2氧基； R8为氢、C1-6烷基、氰基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、羟基羰基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、Ar1、Ar2C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷硫基C1-6烷基； R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素； R11为氢或C1-6烷基； Ar1为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基； Ar2为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基。
以其全文并入此处的WO-98/40383和美国专利6,187,786公开了式(VII)
的法尼基转移酶抑制化合物、其药学上可接受的酸加成盐以及其立体化学异构体的制备、制剂和药学性质，其中 虚线表示任选的键； X为氧或硫； -A-为下式双键 -CH＝CH- (a-1)，-CH2-S-(a-6)， -CH2-CH2- (a-2)，-CH2-CH2-S-(a-7)， -CH2-CH2-CH2- (a-3)，-CH＝N-(a-8)， -CH2-O-(a-4)，-N＝N- (a-9)，或 -CH2-CH2-O-(a-5)，-CO-NH-(a-10)； 其中任选一个氢原子可被C1-4烷基或Ar1取代； R1和R2每个独立地为氢、羟基、卤素、氰基、C1-6烷基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、C2-6烯基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基羰基、氨基C1-6烷氧基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、Ar2、Ar2C1-6烷基、Ar2氧基、Ar2C1-6烷氧基；或当处于相邻位置时，R1和R2一起可以形成下式二价基团 -O-CH2-O-(b-1)， -O-CH2-CH2-O-(b-2)， -O-CH＝CH- (b-3)， -O-CH2-CH2- (b-4)， -O-CH2-CH2-CH2- (b-5)，或 -CH＝CH-CH＝CH- (b-6)； R3和R4每个独立地为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ar3氧基、C1-6烷硫基、二(C1-6烷基)氨基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、或当处于相邻位置时，R3和R4一起可以形成下式二价基团 -O-CH2-O- (c-1)， -O-CH2-CH2-O- (c-2)，或 -CH＝CH-CH＝CH-(c-3)； R5为下式基团
其中R13为氢、卤素、Ar4、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基； R14为氢、C1-6烷基或二(C1-4烷基)氨磺酰基； R6为氢、羟基、卤素、C1-6烷基、氰基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷硫基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基-C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、Ar5、Ar5-C1-6烷氧基C1-6烷基；或下式基团 -O-R7 (e-1)， -S-R7 (e-2)， -N-R8R9(e-3)， 其中R7为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar6、Ar6C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基，或式-Alk-OR10或-Alk-NR11R12的基团； R8为氢、C1-6烷基、Ar7或Ar7C1-6烷基； R9为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基氨基羰基、Ar8、Ar8C1-6烷基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、Ar8羰基、Ar8C1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、羟基、C1-6烷氧基、氨基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰基、氨基、C1-6烷氨基、C1-6烷基羰基氨基，或式-Alk-OR10或-Alk-NR11R12的基团； 其中，Alk为C1-6烷二基； R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基C1-6烷基、Ar9或Ar9C1-6烷基； R11为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar10或Ar10C1-6烷基； R12为氢、C1-6烷基、Ar11或Ar11C1-6烷基；和 Ar1至Ar11每个独立地选自苯基；或被卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或三氟甲基取代的苯基。
以其全文并入此处的WO-98/49157和美国专利6,117,432公开了式(VIII)
的法尼基转移酶抑制化合物、其药学上可接受的酸加成盐以及其立体化学异构体的制备、制剂和药学性质，其中 虚线表示任选的键； X为氧或硫； R1和R2每个独立地为氢、羟基、卤素、氰基、C1-6烷基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、C2-6烯基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基羰基、氨基C1-6烷氧基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、Ar1、Ar1C1-6烷基、Ar1氧基或Ar1C1-6烷氧基； R3和R4每个独立地为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ar1氧基、C1-6烷硫基、二(C1-6烷基)氨基、三卤代甲基或三卤代甲氧基； R5为氢、卤素、C1-6烷基、氰基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷硫基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基-C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、Ar1、Ar1-C1-6烷氧基C1-6烷基；或下式基团 -O-R10 (a-1)， -S-R10 (a-2)， -N-R11R12(a-3)， 其中R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1、Ar1C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基，或式-Alk-OR13或-Alk-NR14R15的基团； R11为氢、C1-6烷基、Ar1或Ar1C1-6烷基； R12为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基氨基羰基、Ar1、Ar1C1-6烷基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、Ar1羰基、Ar1C1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、羟基、C1-6烷氧基、氨基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰基、氨基、C1-6烷氨基、C1-6烷基羰基氨基，或式-Alk-OR13或-Alk-NR14R15的基团； 其中，Alk为C1-6烷二基； R13为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基C1-6烷基、Ar1或Ar1C1-6烷基； R14为氢、C1-6烷基、Ar1或Ar1C1-6烷基； R15为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1或Ar1C1-6烷基； R6为下式基团
其中R16为氢、卤素、Ar1、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷硫基C1-6烷基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基； R17为氢、C1-6烷基或二(C1-4烷基)氨磺酰基； R7为氢或C1-6烷基，条件是虚线不表示键； R8为氢、C1-6烷基或Ar2CH2或Het1CH2； R9为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素；或者 R8与R9一起形成下式二价基团 -CH＝CH-(c-1)， -CH2-CH2- (c-2)， -CH2-CH2-CH2- (c-3)， -CH2-O-(c-4)，或 -CH2-CH2-O-(c-5)； Ar1为苯基；或被1或2个每个独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或三氟甲基的取代基取代的苯基； Ar2为苯基；或被1或2个每个独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或三氟甲基的取代基取代的苯基；和 Het1为吡啶基；或被1或2个每个独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或三氟甲基的取代基取代的吡啶基。
以其全文并入此处的WO-00/39082和美国专利6,458,800公开了式(IX)
的法尼基转移酶抑制化合物、或其药学上可接受的酸加成盐以及其立体化学异构形式的制备、制剂和药学性质，其中 ＝X1-X2-X3为下式三价基团 ＝N-CR6＝CR7- (x-1)，＝CR6-CR7＝CR8-(x-6)， ＝N-N＝CR6- (x-2)，＝CR6-N＝CR7- (x-7)， ＝N-NH-C(＝O)- (x-3)，＝CR6-NH-C(＝O)- (x-8)，或 ＝N-N＝N- (x-4)，＝CR6-N＝N-(x-9)； ＝N-CR6＝N- (x-5)， 其中R6、R7和R8每个独立地为氢、C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基、芳氧基、C1-4烷氧羰基、羟基C1-4烷基、C1-4烷氧基C1-4烷基、单或二(C1-4烷基)氨基C1-4烷基、氰基、氨基、硫代、C1-4烷硫基、芳硫基或芳基； ＞Y1-Y2-为下式三价基团 ＞CH-CHR9-(y-1) ＞C＝N- (y-2)， ＞CH-NR9- (y-3)，或 ＞C＝CR9- (y-4)； 其中每个R9独立地为氢、卤素、卤代羰基、氨基羰基、羟基C1-4烷基、氰基、羧基、G1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基C1-4烷基、C1-4烷氧羰基、单或二(C1-4烷基)氨基、单或二(C1-4烷基)氨基C1-4烷基、芳基； r和s每个独立地为0、1、2、3、4或5； t为0、1、2或3； 每个R1和R2独立地为羟基、卤素、氰基、C1-6烷基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、C2-6烯基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷氧羰基、氨基C1-6烷氧基、单或二(C1-6烷基)氨基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、芳基、芳基C1-6烷基、芳氧基或芳基C1-6烷氧基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、氨基羰基、氨基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基羰基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；或 苯环上彼此相邻的两个R1或R2取代基可以独立地一起形成以下二价基团 -O-CH2-O- (b-1)， -O-CH2-CH2-O- (b-2)， -O-CH＝CH-(b-3)， -O-CH2-CH2- (b-4)， -O-CH2-CH2-CH2- (b-5)，或 -CH＝CH-CH＝CH- (b-6)； R3为氢、卤素、C1-6烷基、氰基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷硫基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、芳基、芳基C1-6烷氧基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基； 或下式基团 -O-R10 (b-1)， -S-R10 (b-2)， -NR11R12(b-3)， 其中R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、芳基、芳基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基，或式-Alk-OR13或-Alk-NR14R15基团； R11为氢、C1-6烷基、芳基或芳基C1-6烷基； R12为氢、C1-6烷基、芳基、羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、芳基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、单或二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基羰基、氨基羰基、芳基羰基、卤代C1-6烷基羰基、芳基C1-6烷基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、单或二(C1-6烷基)氨基羰基，其中烷基部分可任选被一个或多个独立地选自芳基或C1-3烷氧羰基、氨基羰基羰基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰基，或式-Alk-OR13或-Alk-NR14R15基团的基团取代； 其中，Alk为C1-6烷二基； R13为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基C1-6烷基、芳基或芳基C1-6烷基； R14为氢、C1-6烷基、芳基或芳基C1-6烷基； R15为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、芳基或芳基C1-6烷基； R4为下式基团
其中R16为氢、卤素、芳基、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、单或二(C1-4烷基)氨基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷硫基C1-6烷基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基； R16还可连接到式(c-1)或(c-2)咪唑环的一个氮原子上，在这种情况下当连接到氮原子时R16的定义限于氢、芳基、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基； R17为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、芳基C1-6烷基、三氟甲基或二(C1-4烷基)氨磺酰基； R5为C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素； 芳基为苯基、萘基或被一个或多个每个独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或三氟甲基的取代基取代的苯基。
除了以上式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)法尼基转移酶抑制剂外，本领域已知的其它法尼基转移酶抑制剂包括WO-98/28303(NuOncology Labs)中公开的Arglabin(即1(R)-10-环氧-5(S)，7(S)-guaia-3(4)，11(13)-dien-6，12-olide；WO-99/45912(WisconsinGenetics)中公开的perrilyl醇；美国专利5874442(Schering)中公开的SCH-66336，即(+)-(R)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-5，6-二氢-11H-苯并[5，6]环庚[1，2-b]吡啶-11-基)哌啶-1-基]-2-氧乙基]哌啶-1-羧酰胺；WO-00/01691(Merck)中公开的L778123，即1-(3-氯苯基)-4-[1-(4-氰苄基)-5-咪唑基甲基]-2-哌嗪酮；WO-94/10138(Merck)中公开的化合物2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巯基]丙基氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯基丙酰基-蛋氨酸砜；和WO 97/30992(Bristol Myers Squibb)中公开的BMS214662，即，(R)-2，3，4，5-四氢-1-(1H-咪唑-4-基甲基)-3-(苯基甲基)-4-(2-噻吩基磺酰基)-1H-1，4-苯基二氮杂

-7-腈；和WO-00/12498和WO-00/12499中公开的Pfizer化合物(A)和(B)
本领域已知的FLT3抑制剂包括AG1295和AG1296；Lestaurtinib(还已知为CEP 701、先前为KT-5555，Kyowa Hakko，由Cephalon许可)；CEP-5214和CEP-7055(Cephalon)；CHIR-258(Chiron Corp.)；EB-10和IMC-Eb10(ImClone Systems Inc.)；GTP 14564(Merk Biosciences UK)。Midostaurin(还已知为PKC 412 Novartis AG)；MLN 608(MillenniumUSA)；MLN-518(先前为CT53518，COR Therapeutics Inc.，由MillenniumPharmaceuticals Inc.许可)；MLN-608(Millennium Pharmaceuticals Inc.)；SU-11248(Pfizer USA)；SU-11657(Pfizer USA)；SU-5416和SU 5614；THRX-165724(Theravance Inc.)；AMI-10706(Theravance Inc.)；VX-528和VX-680(Vertex Pharmaceuticals USA，由Novartis(瑞士)，Merck&Co USA许可)；和XL 999(Exelixis USA)。
还参见Levis，M.，K.F.Tse等人，(2001)“A FLT3 tyrosine kinaseinhibitor is selectively cytotoxic to acute myeloid leukemia blasts harboringFLT3 internal tandem duplication mutations”。B1ood 98(3)885-7；Tse KF等人，(2001)，Inhibition of FLT3-mediated transformation by use of atyrosine kinase inhibitor。Leukemia.Jul；15(7)1001-10；Smith，B.Douglas等人，Single-agent CEP-701，a novel FLT3 inhibitor，shows biologic andclinical activity in patients with relapsed or refractory acute myeloidleukemia Blood，2004年5月；1033669-3676；Griswold，Ian J等人，Effectsof MLN518，A Dual FLT3 and KIT Inhibitor，on Normal and MalignantHematopoiesis.Blood，2004年7月；[Epub ahead of print]；Yee，Kevin W.H.等人，SU5416 and SU5614 inhibit kinase activity of wild-type andmutant FLT3 receptor tyrosine kinase，Blood，2002年9月；1002941-294；O′Farrell，Anne-Marie等人，SUl 1248 is a novel FLT3 tyrosine kinaseinhibitor with potent activity in vitro and in vivo，Blood，2003年5月；1013597-3605；Stone，R.M.等人，PKC 412 FLT3 inhibitor therapy in AMLresults of a phase II trial，Ann Hematol.2004；83增刊1S89-90；和Murata，K.等人，Selective cytotoxic mechanism of GTP-14564，a novel tyrosinekinase inhibitor in leukemia cells expressing a constitutively activeFms-like tyrosine kinase 3(FLT3)，J Biol Chem.2003年8月29日；278(35)32892-8；Levis，Mark等人，Novel FLT3 tyrosine kinase inhibitors.Expert Opin.Investing，Drugs(2003)12(12)1951-1962；Levis，Mark等人，Small Molecule FLT3 Tyrosine Kinase Inhibitors.Current PharmaceuticalDesign，2004，10，1183-1193。
发明概述 本发明包括在细胞或主体中抑制FLT3酪氨酸激酶活性或表达，或者降低FLT3激酶活性或表达的方法，所述方法包括给药FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。本发明范围内为用于治疗处于细胞增殖病症或与FLT3相关的病症的危险(或易于感染这些疾病)的主体的预防和治疗方法，所述方法通常包括向主体给药预防有效量的FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以以含有FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的单一药物组合物给药，或者以分离药物组合物给药，所述药物组合物包括(1)含有FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。本发明进一步包括用于在主体中治疗或预防细胞增殖病症或与FLT3相关的病症的发作的多组分疗法，包括向主体中给药治疗或预防有效量的FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂以及包括化学疗法、放射疗法、基因疗法和免疫疗法的一种或多种其它抗细胞增殖疗法。
本发明的其它实施方案、特点、有点和方面将由根据以下附图的详细说明显而易见。
附图简介

图1.口服给药的本发明化合物对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物生长的作用。
图2.口服给药的本发明化合物对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物最终体重的作用。
图3.在用本发明化合物处理的小鼠中得到的MV4-11肿瘤中的FLT3磷酸化作用。
图4.图4被有意删除。
图5.测试对FLT3-依赖的增殖的抑制的化合物。
图6.1-6.8.单一药剂对FLT3依赖的AML细胞增殖的剂量响应。
图7a-c.低剂量FLT3抑制剂显著改变Tipifarnib在FLT3依赖性细胞中的效力。
图8a-d.FLT3抑制化合物(A)和Tipifarnib或阿糖胞苷的单剂量组合协同抑制FLT3依赖的细胞系生长。
图9a-b.FLT3抑制化合物B和D与Tipifarnib或阿糖胞苷的单剂量组合协同抑制MV4-11细胞生长。
图10.1.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物A和Tipifarnib协同抑制了FLT3依赖的细胞的增殖。
图10.2.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物B和Tipifarnib协同抑制了FLT3依赖的细胞的增殖。
图10.3.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物C和Tipifarnib协同抑制了FLT3依赖的细胞的增殖。
图10.4.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物D和Tipifarnib协同抑制了FLT3依赖的细胞的增殖。
图10.5.如Chou and Talalay方法测量，FLT3抑制化合物H和Tipifarnib协同抑制了MV4-11细胞的增殖。
图10.6.如Chou and Talalay方法测量，FLT3抑制化合物E和Zarnestra协同抑制了MV4-11细胞的增殖。
图10.7.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物F和Tipifarnib协同抑制了FLT3依赖的MV4-11细胞的增殖。
图10.8.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物G和Tipifarnib协同抑制了FLT3依赖的MV4-11细胞的增殖。
图11a-c.FLT3抑制剂和FTI的组合协同诱导了MV4-11细胞的凋亡。
图12a-d.单一药物在caspase3/7诱导和FLT3依赖的MV4-11细胞的凋亡方面的剂量响应。
图13.1.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物B和Tipifarnib协同诱发了caspase3/7在FLT3依赖的MV4-11细胞中的活化。
图13.2.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物C和Tipifarnib协同诱发了caspase3/7在FLT3依赖的MV4-11细胞中的活化。
图13.3.如Chou ad Talalay方法测量，FLT3抑制化合物D和Tipifarnib协同诱发了caspase3/7在FLT3依赖的MV4-11细胞中的活化。
图14.Tipifarnib增加了FLT3抑制化合物A在MV4-11细胞中抑制FLT3和MapKinase磷酸化作用的效力。
图15.在裸小鼠的MV-4-11肿瘤异种移植物的生长中，单独或组合口服给药的FLT3抑制化合物B和Tipifarnib随时间对肿瘤体积的影响。
图16.在研究的最后一天，在裸小鼠的MV-4-11肿瘤异种移植物的生长中，单独或组合口服给药的FLT3抑制化合物B和Tipifarnib对肿瘤体积的影响。
图17.在研究的最后一天，在裸小鼠的MV-4-11肿瘤异种移植物的生长中，单独或组合口服给药的FLT3抑制化合物B和Tipifarnib对肿瘤重量的影响。
图18.本发明FLT3抑制化合物D的口服给药对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物生长的影响。
图19.本发明FLT3抑制化合物D的口服给药对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物最终重量的影响。
图20.本发明FLT3抑制化合物D的口服给药对小鼠体重的影响。
图21.在用本发明FLT3抑制化合物D处理的小鼠中得到的MV4-11肿瘤中的FLT3磷酸化作用。
图22.在裸小鼠的MV-4-11肿瘤异种移植物的生长中，单独或组合口服给药的FLT3抑制化合物D和Tipifarnib随时间对肿瘤体积的影响。
图23.在裸小鼠的MV-4-11肿瘤异种移植物的生长中，单独或组合口服给药的FLT3抑制化合物D和Tipifarnib对肿瘤体积的影响。
图24.单独或组合口服给药的FLT3抑制化合物D和Tipifarnib对裸小鼠的MV-4-11肿瘤异种移植物的最终重量的影响。
本发明和优选实施方案的详细说明 此处术语“包括”以其开放、非限制意义使用。
本发明包括抑制FLT3酪氨酸激酶活性或表达，或者在细胞或主体中降低FLT3激酶活性或表达的方法，所述方法包括给药FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。
本发明一个实施方案包括在主体中降低或抑制FLT3酪氨酸激酶活性的方法，包括向主体中给药FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。
本发明一个实施方案包括在主体中治疗与FLT3酪氨酸激酶活性或表达有关的病症的方法，包括向主体中给药FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。
本发明一个实施方案包括在细胞中降低或抑制FLT3酪氨酸激酶活性的方法，包括将细胞与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂接触的步骤。
本发明还提供在主体中降低或抑制FLT3酪氨酸激酶表达的方法，包括将FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂给药到主体的步骤。
本发明此外提供在细胞中抑制细胞增殖的方法，包括将细胞与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂接触的步骤。
细胞或主体中FLT3的激酶活性可以通过本领域公知的方法确定，例如此处所述的FLT3激酶测试。
此处使用的术语“主体”指的是动物，优选哺乳动物，最优选人类，其已经成为治疗、观察或试验的目标。
此处使用的术语“接触”指的是化合物加入到细胞中由此化合物被细胞吸收。
在此方面的其它实施方案中，本发明提供用于治疗处于(或易于)发展细胞增殖病症或与FLT3有关的病症的危险的主体的预防和治疗方法。
在一个实施例中，本发明提供在主体中预防细胞增殖病症或与FLT3有关的病症的方法，包括向主体中给药预防有效量的(1)含有FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。
在一个实施例中，本发明提供了在主体中预防细胞增殖病症或与FLT3有关的病症的方法，包括向主体中给药预防有效量的含有FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物。
所述预防药物的给药可以在细胞增殖病症或与FLT3有关的病症的症状显现之前进行，由此疾病或病症可以预防，或者延缓其发展。
在另一实施例中，本发明涉及在主体中治疗细胞增殖病症或与FLT3有关的病症的方法，包括向主体给药治疗有效量的(1)含有FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。
在另一实施例中，本发明涉及在主体中治疗细胞增殖病症或与FLT3有关的病症的方法，包括向主体给药治疗有效量的含有FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物。
所述治疗药物的给药可以在病症的症状显现同时进行，由此所述治疗药物起治疗的作用，以治疗细胞增殖病症或与FLT3有关的病症。
FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以以含有FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的单一药物组合物给药，或者以分离药物组合物给药(1)含有FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。在后一种情形，两种药物组合物可以同时(即便是在单独的组合物中)、以任何一种顺序序贯、差不多同时给药，或者以单独的给药时间表给药。在单独的给药时间表中，两种组合物在一定时间和一定量并以某种方式给药，以注意确保实现有利或协同作用。
应当能够理解的是，组合中各个组分优选的给药方法和顺序以及其各自剂量和给药模式将取决于给药的药物、给药途径、治疗的特定肿瘤和治疗的特定宿主。
本领域普通技术人员能够理解的是，本领域熟练技术人员使用常规方法并考虑到此外的信息可以容易地确定FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂给药的最佳方法和顺序以及剂量和给药模式。
FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的给药剂量和给药模式将类似于或低于这些药物单独给药或者与其它化学疗法组合的临床疗法中已经使用的那些。
此处使用的术语“预防有效量”指的是研究人员、兽医、医生或其它临床医师所寻求的在主体中抑制或延缓疾病发作的活性化合物或药剂的量。
此处使用的术语“治疗有效量”指的是研究人员、兽医、医生或其它临床医师所寻求的在主体中引起生物或药物响应的活性化合物或药剂的量，该响应包括疾病或治疗病症症状的减轻。
对于本发明药物组合物，确定治疗和预防有效量的方法为本领域已知。
如本文所用，术语“组合物”意在包括包含特定量特定成分的产品，以及直接或间接地由组合特定量的特定成分所得的任何产品。
此处使用的术语“与FLT3有关的病症”，或“与FLT3受体有关的疾病”，或“与FLT3受体酪氨酸激酶有关的疾病”将包括与FLT3活性有关或者涉及FLT3活性(例如FLT3的过度活化)的疾病，以及伴有这些疾病的病症。术语“FLT3的过度活化”指的是1)在通常不表达FLT3的细胞中的FLT3表达；2)通过通常不表达FLT3的细胞表达FLT3；3)引起不希望的细胞增殖的增加的FLT3表达；或4)引起FLT3组成活化的突变。“与FLT3有关的病症”的实例包括由于反常高量FLT3或FLT3中突变所引起的FLT3过度刺激引起的病症，或者由于反常高量FLT3或FLT3中突变所引起的反常高量FLT3活性所引起的病症。众所周知，FLT3的过度活化已经与多种疾病的致病有关，包括列于如下的细胞增殖病症、肿瘤病症和癌症。
术语“细胞增殖病症”指的是对多细胞机体产生损害(即，不适或降低寿命预期)的多细胞机体中一组或多组细胞中的不利细胞增殖。细胞增殖病症可发生于不同种类的动物和人中。例如，此处使用的术语“细胞增殖病症”包括肿瘤病症和其它细胞增殖病症。
此处使用的“肿瘤病症”指的是由反常或非受控细胞生长导致的肿瘤。肿瘤病症的实例包括但不限于造血病症，例如脊髓增生病症，如血小板增多症、原发性血小板增多症(ET)、血管生成骨髓组织异生、骨髓纤维化症(MF)、伴有髓样化生的骨髓纤维化症(MMM)、慢性特发性骨髓纤维化症(IMF)、真性红细胞增多症(PV)、血细胞减少症和癌变前骨髓增生异常综合症；癌症，例如胶质瘤癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌，以及成血液恶性肿瘤，包括脊髓发育不良、多发性脊髓瘤、白血病和淋巴瘤。血液恶性肿瘤的实例包括，例如白血病、淋巴瘤(非何杰金淋巴瘤)、何杰金病(还称为何杰金淋巴瘤)，和骨髓瘤例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性前髓细胞性白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、急性未分化性白血病(AUL)、间变性巨细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞白血病(PML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、成人T-细胞ALL、伴随骨髓三系细胞异常增生的AML(AML/TMDS)、混合性白血病(MLL)、骨髓发育异常综合征(MDSs)、脊髓增生病(MPD)和多发性骨髓瘤(MM)。
在此方面的另一实施方案中，本发明包括用于在主体中治疗或抑制细胞增殖病症或与FLT3相关的病症的发作的多组分治疗，包括向主体中给药治疗或预防有效量的FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂以及包括化学疗法、放射疗法、基因疗法和免疫疗法的一种或多种的其它抗细胞增殖疗法。
此处使用的“化学疗法”指的是使用化学疗法剂的疗法。多种化学疗法剂可用于此处公开的多组分治疗方法中。作为示范使用的化学疗法剂包括但不限于铂化合物(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)；紫杉烷化合物(例如紫杉醇、多西他赛)；喜树碱化合物(例如伊立替康、托泊替康)；长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞宾)；抗肿瘤核苷衍生物(例如5-氟尿嘧啶、亚叶酸、吉西他滨、卡培他滨)；烷化剂(例如环磷酰胺、卡莫斯汀、洛莫斯汀、噻替派)；表鬼臼脂素/鬼臼霉素(例如依托泊苷、替尼泊苷)；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、依西美坦)；抗雌激素化合物(例如他莫昔芬、氟维司群)，抗叶酸物(例如培美曲塞二钠(premetrexed disodium))；去甲基化剂(例如阿扎胞苷)；生物制品(例如吉姆单抗(gemtuzamab)、西妥昔单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗、贝伐单抗、埃罗替尼(erlotinib))；抗生素/蒽环类抗生素(例如伊达比星、放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、丝裂霉素C、更生霉素、洋红霉素、道诺霉素)；抗代谢物(例如氨蝶呤、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷、甲氨蝶呤)；微管蛋白粘合剂(例如考布他汀、秋水仙碱、诺考达唑)；拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱)。其它有用的药剂包括维拉帕米，其为一种钙拮抗剂，发现其可与抗肿瘤剂协同使用以在对接受的化学疗法剂产生抗性的肿瘤细胞中形成化学敏感性，并且增强这些化合物在药物敏感的恶性肿瘤中的效力。参见Simpson WG，The calciumchannel blocker verapamil and cancer chemotherapy.Cell Calcium.1985年12月；6(6)449-67。此外，仍然不断出现可用于与本发明化合物组合使用的化学疗法剂。
在本发明另一实施方案中，FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以与放射疗法一起给予。此处使用的“放射疗法”指的是包括将需要该处理的主体暴露于辐射的疗法。这种治疗为本领域技术人员所公知。合适的放射疗法方案将与临床治疗中已经使用的那些类似，其中放射疗法单独使用或者与其它化学疗法联合使用。
在本发明另一实施方案中，FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以与基因疗法一起给予。此处使用的“基因疗法”指的是靶向于涉及肿瘤形成的具体基因的疗法。可能的基因疗法策略包括有缺陷的癌症抑制基因的恢复、使用与编码生长因子及其受体的基因相应的反义DNA的细胞转导或转染、基于RNA的策略，例如核糖酶、RNAdecoys、反义信使RNA和小干扰RNA(SiRNA)分子和所谓的“自杀基因”。
在本发明其它实施方案中，FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以与免疫疗法一起给予。此处使用的“免疫疗法”指的是通过对这种蛋白质特异性抗体靶向涉及肿瘤的具体蛋白质的疗法。例如，对抗血管内皮细胞生长因子的单克隆抗体已经用于治疗癌症。
当一种或多种其它化学疗法剂与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂组合使用时，其它化学疗法剂、FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以同时(例如以分离或单一组合物)给药、在差不多相同的时间以任何顺序给药，或者以分离给药进度表给药。在后一种情形，药物将在一定时间内并且以足以保证实现有利和协同作用的量和方式给药。应当理解的是，优选的方法、给药顺序和各自的给药量以及其它化学疗法剂的给药方案将取决于与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂一起给药的特定化学疗法剂、其给药途径、治疗的特定肿瘤和特定主体。本领域熟练技术人员将能够理解的是，其它化学疗法剂的合适的量将与化学疗法单独给药或者与其它化学疗法组合给药的已经应用于临床治疗的那些类似，或者小于化学疗法单独给药或者与其它化学疗法组合给药的已经应用于临床治疗的那些。
本领域熟练技术人员使用常规方法并考虑到此处提供的信息可以容易地确定最佳方法、给药顺序以及剂量和给药方案。
举例来说，在每个疗程中铂化合物有利地以1-500毫克/平方米(mg/m2)体表面积，例如50-400mg/m2的剂量给药，特别地对于顺铂以约75mg/m2的剂量给药，对于卡铂以约300mg/m2的剂量给药。顺铂口服不被吸收，并且因此必须通过静脉内、皮下、瘤体内或腹膜内注射给药。
举例来说，在每个疗程中紫杉烷化合物有利地以50-400毫克/平方米(mg/m2)体表面积，例如75-250mg/m2的剂量给药，特别地对于紫杉醇以约175-250mg/m2的剂量给药，对于多西他赛以约75-150mg/m2的剂量给药。
举例来说，在每个疗程中喜树碱化合物有利地以0.1-400毫克/平方米(mg/m2)体表面积，例如1-300mg/m2的剂量给药，特别地对于伊立替康以约100-350mg/m2的剂量给药，对于托泊替康以约1-2mg/m2的剂量给药。
举例来说，在每个疗程中长春花生物碱有利地以2-30毫克/平方米(mg/m2)体表面积，特别地对于长春碱以约3-12mg/m2的剂量给药，对于长春新碱以约1-2mg/m2的剂量给药，对于长春瑞宾以约10-30mg/m2的剂量给药。
举例来说，抗肿瘤核苷衍生物有利地以200-2500毫克/平方米(mg/m2)体表面积，例如700-1500mg/m2的剂量给药。5-氟尿嘧啶(5-FU)通常以200-500mg/m2(优选3-15毫克/千克/天)经由静脉内注射给药使用。在每个疗程中，吉西他滨有利地以约800-1200mg/m2的剂量给药，并且卡培他滨有利地以约1000-2500mg/m2的剂量给药。
举例来说，在每个疗程中烷化剂有利地以100-500毫克/平方米(mg/m2)体表面积，例如120-200mg/m2的剂量给药，特别地对于环磷酰胺以约100-500mg/m2的剂量给药，对于苯丁酸氮芥以约0.1-0.2mg/千克体重的剂量给药，对于卡莫斯汀以约150-200mg/m2的剂量给药，对于洛莫斯汀以约100-150mg/m2的剂量给药。
举例来说，在每个疗程中鬼臼霉素衍生物有利地以30-300毫克/平方米(mg/m2)体表面积，例如50-250mg/m2的剂量给药，特别地对于依托泊苷以约35-100mg/m2的剂量给药，对于替尼泊苷以约50-250mg/m2的剂量给药。
举例来说，在每个疗程中蒽环类抗生素衍生物有利地以10-75毫克/平方米(mg/m2)体表面积，例如15-60mg/m2的剂量给药，特别地对于多柔比星以约40-75mg/m2的剂量给药，对于柔红霉素以约25-45mg/m2的剂量给药，并且对于伊达比星以约10-15mg/m2的剂量给药。
举例来说，根据特定的药物和治疗的疾病，抗雌激素化合物可有利地以每天约1-100毫克的剂量给药。他莫昔芬有利地以5-50毫克，优选10-20毫克的剂量每天口服两次给药，延续治疗足够的时间以实现并维持疗效。托瑞米芬有利地以约60毫克的剂量每天口服一次给药，延续治疗足够的时间以实现并维持疗效。阿那曲唑有利地以约1毫克的剂量每天口服一次给药。屈洛昔芬有利地以约20-100毫克的剂量每天口服一次给药。雷洛昔芬有利地以约60毫克的剂量每天口服一次给药。依西美坦有利地以约25毫克的剂量每天口服一次给药。
举例来说，在每个疗程中生物素有利地以约1-5毫克/平方米(mg/m2)体表面积的量给药，或者如果不同的话以本领域已知的量给药，例如，曲妥珠单抗以每个疗程约1-5mg/m2，特别是2-4mg/m2的剂量给药。
每个疗程中药物可以给药例如一次、两次或多次，其可以例如每7、14、21或28天重复。
FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以全身给药到主体中，例如静脉内、口服、皮下、肌肉内、皮内或肠胃外给药。FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂也可以局部给药到主体中。局部递送系统的非限制性实例包括使用管腔内医疗器具，包括血管内药物递送导管、导线、药理学支架和腔内涂膜术(endoluminal paving)。FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂另外可以与靶向药物一起给药到主体，以在目标位置实现较高局部浓度的FLT3抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。此外，FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以根据将所需药物或药剂与靶向组织保持接触几小时到几星期的目标而配制用于速释或缓释。
分别含有与药学上可接受的载体结合的FLT3激酶抑制剂和含有与药学上可接受的载体结合的法尼基转移酶抑制剂的分离药物组合物可含有约0.1毫克至1000毫克，优选约100至500毫克单一药剂化合物，并且可以形成适于选定给药模式的任何形式。
含有与药学上可接受的载体结合的FLT3抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的单一药物组合物可含有约0.1毫克至1000毫克，优选约100至500毫克化合物，并且可以形成适于选定给药模式的任何形式。
术语“药学上可接受的”指的是根据需要给药到动物或人时没有产生不利、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。兽医学应用同样包括在本发明内并且“药学上可接受的”制剂，包括临床和/或兽医学应用的制剂。
载体包括必须并且惰性的药物载体，包括但不限于粘合剂、悬浮剂、润滑剂、香料、甜味剂、防腐剂、染料和涂料。适于口服给药的组合物包括固体形式，例如丸剂、片剂、囊片、胶囊(每个包括立即释放、定时释放和持续释放制剂)、颗粒剂和粉剂，并且包括液体形式，例如溶液、糖浆、酏剂、乳剂和悬浮剂。用于肠胃外给药的形式包括无菌溶液、乳剂和悬浮液。
本发明药物组合物，不管是单一制剂还是分离制剂，可以配制用于FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的缓慢释放。这种单一或分离的组合物，含有缓释载体(通常为聚合载体)和FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂中的一种，或者在单一制剂的情况下含有FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂中的两种。
本领域公知这样的缓慢释放的可生物降解的载体。这些为可以形成颗粒以在其中捕捉活性化合物并且在合适的环境下(例如，水、酸性、碱性等等)缓慢降解/溶解，由此降解/溶解在体液中并向其中释放活性化合物的材料。颗粒优选为纳米颗粒(即，直径在约1至500纳米的范围内，优选约50-200纳米，并且最优选约100纳米)。
法尼基转移酶抑制剂 可用于根据本发明的方法或治疗的法尼基转移酶抑制剂的实例包括上式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)的法尼基转移酶抑制剂(“FTI”)。
优选的FTI包括式(I)、(II)或(III)的化合物，
其药学上可接受的酸或碱加成盐以及其立体化学同分异构形式，其中 虚线表示任选的键； X为氧或硫； R1为氢、C1-12烷基、Ar1、Ar2C1-6烷基、喹啉基C1-6烷基、吡啶基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、氨基C1-6烷基，或者式-Alk1-C(＝O)-R9、-Alk1-S(O)-R9或-Alk1-S(O)2-R9基团，其中Alk1为C1-6烷二基， R9为羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基、C1-8烷氨基或被C1-6烷氧羰基取代的C1-8烷氨基， R2、R3和R16每个独立地为氢、羟基、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、氨基C1-6烷氧基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、Ar1、Ar2C1-6烷基、Ar2氧基、Ar2C1-6烷氧基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、C2-6烯基、4，4-二甲基噁唑基；或 当处于相邻位置时，R2和R3一起可以形成下式二价基团 -O-CH2-O- (a-1)， -O-CH2-CH2-O- (a-2)， -O-CH＝CH- (a-3)， -O-CH2-CH2-(a-4)， -O-CH2-CH2-CH2-(a-5)，或 -CH＝CH-CH＝CH-(a-6) R4和R5每个独立地为氢、卤素、Ar1、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基； R6和R7每个独立地为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ar2氧基、三卤代甲基、C1-6烷硫基、二(C1-6烷基)氨基，或 当处于相邻位置时，R6和R7一起可以形成下式二价基团 -O-CH2-O- (c-1)， -CH＝CH-CH＝CH- (c-2)， R8为氢、C1-6烷基、氰基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、咪唑基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基，或下式基团 -O-R10(b-1)， -S-R10(b-2)， -N-R11R12 (b-3)， 其中R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1、Ar2C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基，或式-Alk2-OR13或-Alk2-NR14R15的基团； R11为氢、C1-12烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R12为氢、C1-6烷基、C1-16烷基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基氨基羰基、Ar1、Ar2C1-6烷基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、天然氨基酸、Ar1羰基、Ar2C1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、羟基、C1-6烷氧基、氨基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰基、氨基、C1-6烷氨基、C1-6烷基羰基氨基，或式-Alk2-OR13或-Alk2-NR14R15的基团； 其中，Alk2为C1-6烷二基； R13为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基C1-6烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R14为氢、C1-6烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R15为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1或Ar2C1-6烷基； R17为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、Ar1； R18为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素； R19为氢或C1-6烷基； Ar1为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基； Ar2为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基。
在式(I)、(II)和(III)中，R4和R5还可连接到咪唑环中的一个氮原子上。在那种情况下，氮上的氢被R4或R5取代，并且当R4和R5连接到氮原子时R4和R5的定义限于氢、Ar1、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基、C1-6烷基S(O)2C1-6烷基。
优选式(I)、(II)和(III)中的取代基R18位于喹啉酮部分的5或7位，并且当R18位于7-位时，取代基R19位于8位。
FTI的优选实例为X为氧的那些式(I)化合物。
并且，优选FTI的实例为其中虚线表示键由此形成双键的那些式(I)化合物。
另一组优选的FTI为其中R1为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基或式-Alk1-C(＝O)-R9的基团的那些式(I)化合物，其中Alk1为亚甲基，R9为被C1-6烷氧羰基取代的C1-8烷氨基。
另外一组优选的FTI为其中R3为氢或卤素，并且R2为卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C1-6烷氧基、三卤代甲氧基或羟基C1-6烷氧基的那些式(I)化合物。
另一组优选的FTI为其中R2和R3处于相邻位置并且一起形成式(a-1)、(a-2)或(a-3)二价基团的那些式(I)化合物。
另一组优选的FTI为其中R5为氢并且R4为氢或C1-6烷基的那些式(I)化合物。
另一组优选的FTI为其中R7为氢，并且R6为C1-6烷基或卤素，优选氯，尤其优选4-氯的那些式(I)化合物。
优选的FTI的另一示例组为其中R8为氢、羟基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、咪唑基、或式-NR11R12的基团，其中R11为氢或C1-12烷基，R12为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、或式-Alk2OR13的基团，其中R13为氢或C1-6烷基。
优选的化合物为其中R1为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基或式-Alk1-C(＝O)-R9的基团，其中Alk1为亚甲基并且R9为被C1-6烷氧羰基取代的C1-8烷氨基；R2为卤素、G1-6烷基、C2-6烯基、C1-6烷氧基、三卤代甲氧基、羟基C1-6烷氧基或Ar1；R3为氢；R4为连接到咪唑3-位氮原子上的甲基；R5为氢；R6为氯；R7为氢；R8为氢、羟基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、咪唑基、或为式-NR11R12的基团，其中R11为氢或C1-12烷基并且R12为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基，或为式-Alk2-OR13的基团其中R13为C1-6烷基；R17为氢并且R18为氢的那些式(I)化合物。
尤其优选的FTI是 4-(3-氯苯基)-6-[(4-氯苯基)羟基(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-1-甲基-2(1H)-喹啉酮； 6-[氨基(4-氯苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮； 6-[(4-氯苯基)羟基(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-乙氧基苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮； 6-[(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-乙氧基苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮一盐酸盐一水合物； 6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-乙氧基苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮； 6-氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-1-甲基-4-(3-丙基苯基)-2(1H)-喹啉酮；其立体异构形式或药学上可接受的酸或碱加成盐；和 (+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮(tipifarnib；WO 97/21701表1中的化合物75)；及其药学上可接受的酸加成盐以及其立体化学同分异构形式。
Tipifarnib或ZARNESTRA

为尤其优选的FTI。
此外优选的FTI包括式(IX)化合物，其中一个或多个以下条件适用 ·＝X1-X2-X3为式(x-1)、(x-2)、(x-3)、(x-4)或(x-9)的三价基团，其中每个R6独立地为氢、C1-4烷基、C1-4烷氧羰基、氨基或芳基并且R7为氢； ·＞Y1-Y2-为(y-1)、(y-2)、(y-3)或(y-4)的三价基团，其中每个R9独立地为氢、卤素、羧基、C1-4烷基或C1-4烷氧羰基； ·r为0、1或2； ·s为0或1； ·t为0； ·R1为卤素、C1-6烷基，或者苯环上两个相邻的取代基R1可以独立地一起形成式(a-1)的二价基团； ·R2为卤素； ·R3为卤素或式(b-1)或(b-3)的基团，其中 R10为氢或-Alk-OR13的基团， R11为氢； R12为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基、C1-6烷氧基或单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰基； Alk为C1-6烷二基且R13为氢； ·R4为式(c-1)或(c-2)的基团，其中 R16为氢、卤素或单或二(C1-4烷基)氨基； R17为氢或C1-6烷基； ·芳基为苯基。
另一组优选的FTI为式(IX)化合物，其中＝X1-X2-X3为式(x-1)、(x-2)、(x-3)、(x-4)或(x-9)的三价基团，＞Y1-Y2为式(y-2)、(y-3)或(y-4)的三价基团，r为0或1，s为1，t为0，R1为卤素、C1-4烷基或形成式(a-1)二价基团，R2为卤素或C1-4烷基，R3为氢或式(b-1)或(b-3)基团，R4为式(c-1)或(c-2)基团，R6为氢、C1-4烷基或苯基，R7为氢，R9为氢或C1-4烷基，R10为氢或-Alk-OR13，R11为氢并且R12为氢或C1-6烷基羰基和R13为氢； 优选的FTI为式(IX)化合物，其中＝X1-X2-X3为式(x-1)或(x-4)三价基团，＞Y1-Y2为式(y-4)三价基团，r为0或1，s为1，t为0，R1为卤素，优选氯并且最优选3-氯，R2为卤素，优选4-氯或4-氟，R3为氢或式(b-1)或(b-3)基团，R4为式(c-1)或(c-2)基团，R6为氢，R7为氢，R9为氢，R10为氢，R11为氢并且R12为氢。
其它优选的FTI为式(IX)化合物，其中＝X1-X2-X3为式(x-2)、(x-3)或(x-4)三价基团，＞Y1-Y2为式(y-2)、(y-3)或(y-4)三价基团，r和s为1，t为0，R1为卤素，优选氯并且最优选3-氯，或者R1为C1-4烷基，优选3-甲基，R2为卤素，优选氯并且最优选4-氯，R3为氢或式(b-1)或(b-3)基团，R4为式(c-2)基团，R6为C1-4烷基，R9为氢，R10和R11为氢并且R12为氢或羟基。
式(IX)的特别优选的FTI化合物为 7-[(4-氟苯基)(1H-咪唑-1-基)甲基]-5-苯基咪唑[1，2-a]喹啉； α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-5-苯基咪唑并[1，2-a]喹啉-7-甲醇； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-咪唑并[1，2-a]喹啉-7-甲醇； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-咪唑并[1，2-a]喹啉-7-甲胺； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹啉-7-甲胺； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-1-甲基-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-1，2，4-三唑并[4，3-a]喹啉-7-甲醇； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹啉-7-甲胺； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲醇； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-4，5-二氢-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲醇； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲胺； 5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-N-羟基-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四氢[1，5-a]喹啉-7-甲胺；和 α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-5-(3-甲基苯基)四唑并[1，5-a]喹啉-7-甲胺；以及其药学上可接受的酸加成盐及其立体化学同分异构形式。
5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑[1，5-a]喹唑啉-7-甲胺，尤其是(-)对映体及其药学上可接受的酸加成盐为尤其优选的FTI。
上文所述的药学上可接受的酸或碱加成盐意图包括式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物所能够形成的治疗活性无毒酸或无毒碱加成盐形式。具有碱性性质的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物可通过用合适的酸处理而转化为其药学上可接受的酸加成盐。合适的酸包括例如，无机酸，如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等酸；或为有机酸，例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即，丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸等酸。
具有酸性性质的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物可通过用合适的有机或无机碱处理而转化为其药学上可接受的碱加成盐。合适的碱式盐形式包括例如铵盐、碱金属和碱土金属盐，如锂、钠、钾、镁、钙盐等，与有机碱的盐，例如苄星、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺盐，以及与氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等的盐。
酸和碱加成盐还包括优选的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物能够形成的水合物和溶剂合物形式。这些形式的实例例如为水合物、乙醇化物等等。
上文使用的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物包括所述结构的全部立体化学同分异构形式(由相同化学键顺序然而具有不同三维结构的相同原子组成的全部可能的化合物)。除非另有说明或指示，FTI化合物的化学名称将理解为包括该化合物可能具有的全部可能的立体化学同分异构形式的混合物。这种混合物可包括该化合物碱性分子结构的全部非对映体和/或对映体。以纯净形式或混合物形式的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物的全部立体化学同分异构形式将包括在所述结构的范围之内。
某些式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物还可以其互变异构形式存在。虽然没有明确在上式中表示，这些形式视为包括在该范围之内。
因此除非在下文中另有说明，术语“式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)化合物”和“式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)法尼基转移酶抑制剂”还意图包括药学上可接受的酸或碱加成盐和全部立体异构和互变异构形式。
可以根据本发明使用的其它法尼基转移酶抑制剂包括Arglabin、perrilyl醇、CH-66336、2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巯基]丙氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯丙酰基-蛋氨酸砜(Merck)；L778123、BMS 214662、上述Pfizer化合物A和B。化合物Arglabin(WO98/28303)、perrilyl醇(WO99/45712)、SCH-66336(US 5,874,442)、L778123(WO 00/01691)、2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巯基]丙氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯丙酰基-蛋氨酸砜(WO94/10138)、BMS 214662(WO 97/30992)、Pfizer化合物A和B(WO 00/12499和WO 00/12498)的合适的剂量或治疗有效量给出在公开的专利说明书中，或者为本领域熟练技术人员已知，或者本领域熟练技术人员可以容易地确定。
FLT3激酶抑制剂 本发明FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物
或其溶剂化物、水合物、互变异构体或其药学上可接受的盐，其中 A为苯基或吡啶基，二者任一可被氯、氟、甲基、-N3、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-S(烷基)、-O(烷基)或4-氨基苯基中一个取代； W为吡咯基(包括1H-吡咯-2-基)、咪唑基(包括1H-咪唑-2-基)、异噁唑基、噁唑基、1，2，4-三唑基或呋喃基(包括呋喃-2-基)，其中任何一个可通过任一碳原子连接，其中吡咯基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、1，2，4-三唑基或呋喃基可含有连接到任一其它碳原子上的-Cl、-CN、-NO2、-OMe或-CF3取代基； R2为环烷基(包括环己烯基、环戊烯基)、噻吩基、二氢磺酰基吡喃基(dihydrosulfonopyranyl)、苯基、呋喃基、四氢吡啶基或二氢吡喃基，其中任何一个可独立地被一个或两个以下取代基取代氯、氟和C(1-3)烷基(包括4，4-二甲基环己烯基、4-甲基环己烯基、2-甲基噻吩基、3-甲基噻吩基)，条件是四氢吡啶基通过碳碳键连接到环A； X为
Z为CH或N； D1和D2每个为氢或一起形成连接到氧的双键； D3和D4每个为氢或一起形成连接到氧的双键； D5为氢或-CH3，其中所述-CH3可以相对顺式或反式取向； Ra和Rb独立地为氢、环烷基、卤代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基； E为N、S、SO或SO2，条件是如果同时满足以下三种条件则E不为N不存在Qa、不存在Qb，并且R3为氨基或连接到E的点为N的环氨基； Qa为不存在、-CH2-、-CH2CH2-或C(O)； Qb为不存在、-NH-、-CH2-、-CH2CH2-或C(O)，条件是如果Qa为C(O)则Qb可不是C(O)，并且此外的条件是如果E为N并且不存在Qa则Qb可不是-NH-，另外的条件是如果R3为氨基或连接到Qb的点为N的环氨基时则Qb可不是-NH-； R3为氢、苯基、羟基烷氨基(包括2-羟基乙氨基)、(羟烷基)2氨基、羟烷基(烷基)氨基(包括1-羟基乙-2-基(甲基)氨基)、烷氨基(包括甲氨基)、氨基烷基(包括2-氨基异丙基)、二羟烷基(包括1，3-二羟基异丙基、1，2-二羟基乙基)、烷氧基(包括乙氧基)、二烷氨基(包括二甲氨基)、羟烷基(包括1-羟基乙-2-基)、-COOH、-CONH2、-CN、-SO2-烷基-R4(包括-SO2CH3)、-NH2、或为含有至少一个杂原子N并可任选含有选自S、SO2、N和O的其它杂元部分的五元或六元环，并且该五元或六元环可以饱和、部分不饱和或为芳香族(包括哌啶基、吗啉基、咪唑基和吡啶基)，其中五元或六元环中的芳香氮可以N-氧化物(包括吡啶基N-氧化物)的形式存在，并且该五元或六元环可任选被甲基、卤素、烷氨基或烷氧基(包括1-甲基咪唑基)取代；R3还可不存在，条件是当E为氮原子时R3不存在； R4为氢、-OH、烷氧基、羧基、羧酰胺基或氨基甲酰基。
此后使用的术语“式I′化合物”还意图包括其溶剂化物、水合物、互变异构体或其药学上可接受的盐。
式I′FLT3抑制剂的实施方案 本发明FLT3抑制剂的实施方案包括以下式I′化合物，其中 a)A为苯基或吡啶基，两者任一可被氯、氟、甲基、-N3、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-S(烷基)、-O(烷基)或4-氨基苯基中一个取代； b)A为苯基； c)W为吡咯基(包括1H-吡咯-2-基)、咪唑基(包括1H-咪唑-2-基)、异噁唑基、噁唑基、1，2，4-三唑基或呋喃基(包括呋喃-2-基)，其中任何一个可通过任一碳原子连接，其中吡咯基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、1，2，4-三唑基或呋喃基可含有连接到任一其它碳原子上的-Cl、-CN、-NO2、-OMe或-CF3取代基； d)W为呋喃-2-基、1H-吡咯-2-基或1H-咪唑-2-基，其中任何一个可以在4或5碳上被-CN取代； e)W为3H-2-咪唑基-4-腈或5-氰基-1H-吡咯-2-基； f)W为3H-2-咪唑基-4-腈； g)R2为环烷基(包括环己烯基、环戊烯基)、噻吩基、二氢磺酰基吡喃基、苯基、呋喃基、四氢吡啶基或二氢吡喃基，其中任何一个可被一个或两个以下取代基独立取代氯、氟和C(1-3)烷基(包括4，4-二甲基环己烯基、4-甲基环己烯基、2-甲基噻吩基、3-甲基噻吩基)，条件是四氢吡啶基通过碳碳键连接到环A； h)R2为环烷基(包括环己烯基、环戊烯基)，其可被一个或两个C(1-3)烷基(包括4，4-二甲基环己烯基、4-甲基环己烯基)取代； i)R2为环己烯基，其可被一个或两个C(1-3)烷基取代； j)R2为环己烯基、4，4-二甲基环己烯基或4-甲基环己烯基； k)R2为环己烯基； l)X为
m)X为
n)X为
o)Z为CH或N； p)Z为CH； q)D1和D2每个为氢或一起形成连接到氧的双键； r)D1和D2每个为氢； s)D3和D4每个为氢或一起形成连接到氧的双键； t)D3和D4每个为氢； u)D5为氢或-CH3，其中所述-CH3可以相对顺式或反式取向； v)Ra和Rb独立地为氢、环烷基、卤代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基； w)E为N、S、SO或SO2，条件是如果同时满足以下三种条件则E不为NQa不存在、Qb不存在，并且R3为氨基或连接到E的点为N的环氨基； x)E为N，条件是如果同时满足以下三种条件则E不为NQa不存在、Qb不存在，并且R3为氨基或连接到E的点为N的环氨基； y)Qa为不存在、-CH2-、-CH2CH2-或C(O)； z)Qa为不存在、-CH2CH2-或C(O)； aa)Qa为不存在或C(O)； bb)Qa为C(O)； cc)Qb为不存在、-NH-、-CH2-、-CH2CH2-或C(O)，条件是如果Qa为C(O)则Qb可不是C(O)，并且此外的条件是如果E为N并且Qa不存在则Qb可不是-NH-，另外的条件是如果R3为氨基或连接到Qb的点为N的环氨基时则Qb可不是-NH-； dd)Qb为不存在、-CH2CH2-或C(O)，条件是如果Qa为C(O)则Qb可不是C(O)； ee)Qb为不存在，条件是如果Qa为C(O)则Qb可不是C(O)； ff)R3为氢、苯基、羟基烷氨基(包括2-羟基乙氨基)、(羟烷基)2氨基、羟烷基(烷基)氨基(包括1-羟基乙-2-基(甲基)氨基)、烷氨基(包括甲氨基)、氨基烷基(包括2-氨基异丙基)、二羟烷基(包括1，3-二羟基异丙基、1，2-二羟基乙基)、烷氧基(包括甲氧基)、二烷氨基(包括二甲氨基)、羟烷基(包括1-羟基乙-2-基)、-COOH、-CONH2、-CN、-SO2-烷基-R4(包括-SO2CH3)、-NH2，或为含有至少一个杂原子N并可任选含有选自S、SO2、N和O的其它杂元部分的五元或六元环，并且该五元或六元环可以饱和、部分不饱和或为芳香族(包括哌啶基、吗啉基、咪唑基和吡啶基)，其中五元或六元环中的芳香氮可以N-氧化物(包括吡啶基N-氧化物)的形式存在，并且该五元或六元环可任选被甲基、卤素、烷氨基或烷氧基(包括1-甲基咪唑基)取代；R3还可不存在，条件是当E为氮原子时R3不存在； gg)R3为氢、苯基、2-羟基乙氨基、1-羟基乙-2-基(甲基)氨基、甲氨基、2-氨基异丙基、1，3-二羟基异丙基、1，2-二羟基乙基、甲氧基、二甲氨基、1-羟基乙-2-基、-COOH、-CONH2、-CN、-SO2-、-SO2CH3)、-NH2、哌啶基、吗啉基、咪唑基、吡啶基、吡啶基N-氧化物)或1-甲基咪唑基； hh)R3为烷氨基(包括甲氨基)、二烷氨基(包括二甲氨基)，或-SO2-烷基-R4(包括-SO2CH3) ii)R3为甲氨基、二甲氨基或-SO2CH3； jj)R3为二甲氨基； kk)R4为氢、-OH、烷氧基、羧基、羧酰胺基或氨基甲酰基；和 ll)R4为氢； 以及此处上面a)至ll)的全部组合都包括在内。
本发明优选的FLT3抑制剂包括W被一个-CN取代的式I′化合物。
本发明其它优选的FLT3抑制剂包括如下式I′化合物，其中 A为吡啶基，其可被氯、氟、甲基、-N3、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-S(烷基)、-O(烷基)或4-氨基苯基中一个取代； W为咪唑基(包括1H-咪唑-2-基)，其可含有一个-CN；并且 R2为环烷基。
另外优选的式I′FLT3抑制剂化合物为如下，其中 A为苯基，其可被氯、氟或甲基中一个取代； X为
并且如式II
所示，连接到氮取代基对位的苯基A环上； D3和D4为氢； E为N或SO2，条件是如果同时满足以下三种条件则E可不为NQa不存在、Qb不存在，并且R3为氨基或连接到E的点为N的环氨基； 并且 R3为氢、哌啶基、烷氨基、二烷氨基、羟基烷氨基、(羟烷基)2氨基、咪唑基、1-甲基咪唑基、吡啶基、吡啶基N-氧化物、羟烷基、-COOH、-CONH2、-CN、-SO2CH3、-NH2、吗啉基；R3也可以不存在，条件是当E为氮时R3不存在。
更优选的式I′FLT3抑制剂化合物为如下，其中 A为苯基； W为呋喃-2-基、1H-吡咯-2-基或1H-咪唑-2-基，其中任何一个可在4个或5个碳原子上被-CN取代； R2为环烷基二氢磺酰基吡喃基、苯基、呋喃基、四氢吡啶基或二氢吡喃基，其中任何一个可以独立地被一个或两个以下取代基取代氯、氟和C(1-3)烷基，条件是四氢吡啶基必须通过碳碳键连接到环A。
更优选的式I′FLT3抑制剂化合物为如下，其中 W为3H-2-咪唑基-4-腈或5-氰基-1H-吡咯-2-基； R2为环己烯基或环戊烯基，每个可被氯、氟或一个或两个C(1-3)烷基取代； E为N，条件是如果同时满足以下三种条件则E可不为NQa不存在、Qb不存在，并且R3为氨基或连接到E的点为N的环氨基；并且 Z为CH。
尤其优选的式I′FLT3抑制剂化合物为如下，其中W为咪唑基(包括1H-咪唑-2-基)、1，2，4-三唑基或呋喃基(包括呋喃-2-基)，其中任何一个可通过任一碳原子连接，其中咪唑基、1，2，4-三唑基或呋喃基可含有连接到任一其它碳原子上的-Cl或-CN； R2为环烷基(包括C(1-3)烷基取代的环烷基，另外包括C(1-3)烷基取代的环戊烯基和C(1-3)烷基取代的环己烯基，另外包括4-甲基环己烯基)、C(1-3)二烷基取代的环烷基(包括4，4-二甲基环己烯基)、噻吩基(包括C(1-3)烷基取代的噻吩基，另外包括2-甲基噻吩基和3-甲基噻吩基)、C(1-3)烷基取代的苯基(包括甲基苯基)、二氢吡喃基和1，1-二氧代-四氢噻喃基； X为
E为N或SO2，条件是如果同时满足以下三种条件则E可不为NQa不存在、Qb不存在，并且R3为氨基或连接到E的点为N的环氨基；并且 R3为氢、苯基、羟基烷氨基(包括2-羟基乙氨基)、羟烷基(烷基)氨基(包括1-羟基乙-2-基(甲基)氨基)、烷氨基(包括甲氨基)、氨基烷基(包括2-氨基异丙基)、二羟烷基(包括1，3-二羟基异丙基、1，2-二羟基乙基)、烷氧基(包括甲氧基)、二烷氨基(包括二甲氨基)、羟烷基(包括1-羟基乙-2-基)、-COOH、-CONH2、-CN、-SO2CH3、-NH2，或为选自括哌啶基、吗啉基、咪唑基和吡啶基的五元或六元环，其中该五元或六元环可任选被甲基、卤素、烷氨基或烷氧基(包括1-甲基咪唑基)取代；R3还可不存在，条件是当E为氮原子时R3不存在。
最优选的式I′FLT3抑制剂化合物为如下，其中 W为3H-2-咪唑基-4-腈； Qa为CO；并且 R3为氢、哌啶基、羟基烷氨基、(羟烷基)2氨基、烷氨基、二烷基氨基、咪唑基、1-甲基咪唑基、吡啶基、吡啶基N-氧化物、羟烷基、-COOH、-CONH2、-CN、-SO2CH3、-NH2、吗啉基。
式I′FLT3抑制剂化合物的实例包括 5-氰基-呋喃-2-羧酸[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(3-甲基-噻吩-2-基)-苯基]-酰胺； 5-氰基-呋喃-2-羧酸[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(2-甲基-噻吩-2-基)-苯基]-酰胺； 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
式I′FLT3抑制剂化合物的其它实例包括 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-(1，2，5，6-四氢-吡啶-3-基)-苯基]-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯基]-酰胺； 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-酰胺； 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯基]-酰胺； 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2′-甲基-5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-联苯基-2-基]-酰胺；和 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2′-氟-5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-联苯基-2-基]-酰胺； 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
式I′FLT3抑制剂化合物的其它实例为 (4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-基)-乙酸； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-氨基甲酰基甲基-哌啶-4-基)-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(4-甲基-环己-1-烯基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-羟基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(4-甲基-环己-1-烯基)-4-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-羟基-1-羟甲基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(2-氰基-乙基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吗啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲磺酰基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环戊-1-烯基-4-[1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基甲基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环戊-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺； 4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(3，4，5，6-四氢-2H-[1，2′]联吡啶-4-基)-苯基]-酰胺，和 4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺， 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
式I′FLT3抑制剂化合物的其它实例为 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(1-氧-吡啶-3-羰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(1-氧-吡啶-4-羰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(3-吗啉-4-基-丙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-羧酸酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(吡啶-3-羰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-3H-咪唑-4-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吡啶-4-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-{1-[2-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-苯基)-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吡啶-3-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲磺酰基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-哌啶-2-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺，和 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺， 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
另一式I′FLT3抑制剂化合物的实例为 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1-{2-[(2-羟基-乙基)-甲基-氨基]-乙酰基}-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺， 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
另一式I′FLT3抑制剂化合物为 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-二甲氨基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺， 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
另一式I′FLT3抑制剂化合物为 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吗啉-4-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺， 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
其它的式I′FLT3抑制剂化合物为 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(3-氨基-3-甲基-丁酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺三氟乙酸盐； 4H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺双三氟乙酸盐； 5-氯-4H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐； 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(顺式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐； 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(反式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐； 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(R)-(+)-(2，3-二羟基-丙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺三氟乙酸盐； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐； 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(2-氨基-2-甲基-丙酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺三氟乙酸盐，和 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-环己-1-烯基-1′-(2-甲磺酰基-乙基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺， 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
其它式I′FLT3抑制剂化合物为 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲氨基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺； 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[1′-(2-二甲氨基-乙酰基)-6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐，和 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′-(2-甲磺酰基-乙基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐， 以及其溶剂化物、水合物、互变异构体及其药学上可接受的盐。
定义&缩写 仅仅对于式I′的FLT3抑制剂化合物，以下术语具有以下意义 ATP 三磷酸腺苷 Boc或BOC 叔丁氧羰基 DCM 二氯甲烷 DMF 二甲基甲酰胺 DMSO 二甲亚砜 DIEA 二异丙基乙胺 EDCI 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 EDTA 乙二胺四乙酸 EtOAc 乙酸乙酯 FBS 胎牛血清 FP荧光偏振 GM-CSF粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子 HOBT或HOBt1-羟基苯并三唑水合物 HPβCD羟丙基β-环糊精 HRP 辣根过氧化物酶 LC/MS(ESI)液相色谱/质谱(电喷雾离子化) MeOH 甲醇 NMR 核磁共振 PBS 磷酸盐缓冲溶液 RPMI Rosewell Park Memorial Institute RT室温 RTK 受体酪氨酸激酶 SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 TFA 四氟乙酸 THF 四氢呋喃 TLC 薄层色谱 (在说明书中需要之处提供其它缩写。) 定义 除非另有说明，术语“烷基”指的是最多具有12个碳原子，优选最多6个碳原子的直链和支链基团，并且包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。
术语“羟烷基”指的是最多具有6个碳原子的直链和支链基团，其中一个氢原子已经被OH基取代。
术语“羟烷基氨基”指的是碳链中一个氢原子已经被氨基取代的羟烷基，其中氮原子为连接到分子其余部分的点。
术语“环烷基”指的是由3-8个碳原子组成的饱和或部分不饱和环。最多四个烷基取代基可任选存在于环上。实例包括环丙基、1，1-二甲基环丁基、1，2，3-三甲基环戊基、环己基、环戊烯基、环己烯基和4，4-二甲基环己烯基。
术语“二氢磺酰吡喃基(dihydrosulfonopyranyl)”指的是以下基团
术语“羟烷基”指的是至少一个羟基沿着烷基链键合到任一碳原子上。
术语“氨基烷基”指的是至少一个伯或仲氨基沿着烷基链键合到任一碳原子上，其中烷基为连接到分子其余部分的点。
术语“烷基氨基”指的是具有一个烷基取代基的氨基，其中氨基为连接到分子其余部分的点。
术语“二烷基氨基”指的是具有两个烷基取代基的氨基，其中氨基为连接到分子其余部分的点。
术语“杂芳香基”或“杂芳基”指的是5-7元单环或8-10元双环芳环体系，其中任何一个环可包括1-4个选自N、O或S的杂原子，其中氮和硫原子可以任何容许氧化态存在。实例包括苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、呋喃基、咪唑基、异噻唑基、异噁唑基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、噻唑基和噻吩基。
术语“杂原子”指的是氮原子、氧原子或硫原子，其中氮和硫可以以任何容许氧化态存在。
除非另有说明，术语“烷氧基”指的是连接到氧原子上的最多具有12个碳原子的直链或支链基团。实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和丁氧基。
术语“芳基”指的是在环中具有6-12个碳原子的单环或二环芳香环系。烷基取代基可任选存在环上。实例包括苯、联苯和萘。
术语“芳烷基”指的是含有芳基取代基的C1-6烷基。实例包括苄基、苯乙基或2-萘甲基。
术语“磺酰基”指的是基团-S(O)2Ra，其中Ra为氢、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。“磺化剂”向分子中加入-S(O)2Ra基。
式I′的FLT3抑制剂还可以药学上可接受的盐的形式存在。
为了医药应用，式I′的FLT3抑制剂化合物的盐指的是无毒“药学上可接受的盐”，FDA批准的药学上可接受的盐形式(参见InternationalJ.Pharm.1986，33，201-217；J.Pharm.Sci.，1977年1月，66(1)，第1页)包括药学上可接受的酸/阴离子或碱/阳离子盐。
药学上可接受的酸/阴离子盐包括并且不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐(edisylate)、estolate、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、glyceptate、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘铋胂(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐和三乙基碘。有机或无机酸包括并且不限于氢碘酸、高氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羟基乙磺酸、草酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷磺酸、糖精酸或三氟乙酸。
药学上可接受的碱/阳离子盐包括并且不限于铝、2-氨基-2-羟甲基-丙-1，3-二醇(还称为三(羟甲基)氨基甲烷、氨基丁三醇或“TRIS”)、氨、苄星、叔丁胺、钙、葡糖酸钙、氢氧化钙、氯普鲁卡因、胆碱、胆碱碳酸氢盐、氯化胆碱、环己胺、二乙醇胺、乙二胺、锂、LiOMe、L-赖氨酸、镁、葡甲胺、NH3、NH4OH、N-甲基-D-葡糖胺、哌啶、钾、叔丁醇钾、氢氧化钾(水溶液)、普鲁卡因、奎宁、钠、碳酸钠、2-乙基己酸钠(SEH)、氢氧化钠、三乙醇胺(TEA)或锌。
本发明FLT3抑制剂包括式I′化合物的前药。这些前药通常为在体内易于转化为活性化合物的该化合物的功能性衍生物。因此在本发明治疗方法中，术语“给药”将包括使用特别公开的化合物、化合物或其前药治疗、改善或预防此处所述综合症、病症或疾病的方法，虽然没有具体公开某些直接化合物，其将显然包括在本发明范围之内。选择和制备合适的前药衍生物的常规方法例如公开在“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard编，Elsevier，1985。
本领域熟练技术人员将认识到I′的FLT3抑制剂可在其结构中具有一个或多个不对称碳原子。本发明意图包括化合物单一对映体形式、外消旋混合物，以及存在过量对映体的对映体混合物。
此处使用的术语“单一对映体”定义为I′化合物及其N-氧化物、加成盐、季铵或生理功能衍生物可能具有的所有可能的纯手性形式。
立体化学纯同分异构形式可通过本领域已知方法得到。非对映体可通过例如分级结晶和色谱技术的物理分离方法分离，并且对映体可通过非对映体盐与光学活性酸或碱的选择结晶或者通过手性色谱分离彼此分离。纯立体异构体还可由合适的立体化学纯起始物料，或者使用立体选择反应合成制备。
术语“异构体”指的是具有相同组成和分子量而具有不同物理和/或化学性质的化合物。这些物质具有相同的原子数和原子种类而结构不同。结构差异可为结构(几何异构体)或者偏振光平面旋转的能力(对映体)。
术语“立体异构体”指的是具有相同结构而具有不同原子空间排列的异构体。对映体和非对映体为立体异构体的实例。
术语“手性”指的是使分子不能重叠到其镜像上的结构特性。
术语“对映体”指的是彼此为镜像然而不能重叠的一对分子中的一个。
术语“非对映体”指的是不互为镜像的立体异构体。
符号“R”和“S”表示手性碳原子周围取代基的构型。
术语“外消旋体”或“外消旋混合物”指的是由等量两种对映体组成而不具有光学活性的组合物。
术语“纯手性”指的是对映体纯度状态。
术语“光学活性”指的是纯手性分子或手性分子的非外消旋混合物旋转偏振光平面的程度。
术语“几何异构体”指的是与碳碳双键有关的取代基原子相对于环烷基环或桥接双环体系取向不同的异构体。碳碳双键各侧的取代基原子(氢原子除外)可处于E或Z构型。在“E”(处于对侧位置)构型中，与碳碳双键有关的取代基处于对侧；在“Z”(处于同侧位置)构型中，与碳碳双键有关的取代基处于同侧。连接到碳环的取代基原子(氢原子除外)可为顺式或反式构型。在“顺式”构型中，取代基位于环平面的同侧；在“反式”构型中，取代基位于环平面的对侧。具有“顺式”和“反式”混合物的化合物标记为“顺式/反式”。
能够理解的是，用于制备本发明化合物的各种取代基立体异构体、几何异构体以及其混合物可以购自市场，也可以由市售起始物料合成制备，或者可以以同分异构混合物形式制备然后使用本领域熟练技术人员公知的技术以拆分的异构体得到。
同分异构标记“R”、“S”、“E”、“Z”、“顺式”和“反式”此处用于指示相对于主体分子的原子构型并且意图如文献中定义的那样使用(IUPAC Recommendations for Fundamental Stereochemistry(Section E)，PureAppl.Chem.，1976，4513-30)。
式I′的FLT3抑制剂可通过特异性异构体合成或者从同分异构混合物中拆分制备为单一异构体。常规拆分技术包括使用光学活性盐形成同分异构体对的每个异构体的游离碱(然后分级结晶并且再生游离碱)、形成同分异构体对的每个异构体的酯或酰胺(然后色谱分离并且除去手性助剂)，或者使用制备TLC(薄层色谱)或手性HPLC柱拆分起始物料或最终产物的同分异构体混合物。
此外，式I′的FLT3抑制剂可具有一种或多种多晶型或无定形晶形，并包括在本发明范围之内。此外，某些化合物可与水(即，水合物)或普通有机溶剂形成溶剂化物，因而溶剂化物也意图包括在本发明范围之内。
式I′的FLT3抑制剂可根据本领域将三价氮转化为其N-氧化物的已知方法转化为相应的N-氧化物形式。所述N-氧化反应通常可通过将I′起始物料与合适的有机或无机过氧化物反应进行。合适的无机过氧化物包括例如过氧化氢、碱金属或碱土金属过氧化物，例如过氧化钠、过氧化钾；合适的有机过氧化物可包括过氧酸，例如过氧化苯甲酸或卤代过氧化苯甲酸，如3-氯过氧化苯甲酸，过氧烷酸例如过氧乙酸，烷基过氧化氢如丁基过氧化氢。合适的溶剂例如为水、低级醇如乙醇等、烃类如甲苯、酮例如2-丁酮、卤代烃例如二氯甲烷，以及这些溶剂的混合物。
某些式I′的FLT3抑制剂还可以其互变异构形式存在。这些形式虽然没有明确地在本申请中指出，然而也包括在本发明范围之内。
式I′的FLT3抑制剂的制备 在制备式I′的FLT3抑制剂的任意方法期间，可能需要和/或希望保护任一涉及分子上敏感或活性的基团。这可通过常规保护基实现，例如Protecting Groups，P.Kocienski，Thieme Medical Publishers，2000；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley Interscience，1999中所述的那些。这些保护基可使用本领域已知的方法以方便的后续步骤除去。
制备方法 方案1
方案1说明了制备式I′的FLT3抑制剂化合物的一般方法。式1-2化合物可通过式1-1氨基化合物的邻位-卤化，优选溴化，然后通过使用硼酸或硼酸酯(Suzuki反应，其中R2M为R2B(OH)2或硼酸酯)或者锡试剂(Stille反应，其中R2M为R2Sn(烷基)3)的金属-催化偶联反应得到(综述参见N.Miyaura，A.Suzuki，Chem.Rev.，952457(1995)，J.K.Stille，Angew.Chem，Int.Ed.Engl，25508024(1986)和A.Suzuki，Metal-Catalyzed Coupling Reactions，F.Deiderich，P.Stang，Eds.，Wiley-VCH，Weinheim(1988))。式1-1化合物可以购自市场，或者上述钯介导的交叉偶联反应可用于从起始物料1-0产生式1-1化合物。
1-1溴化的优选条件为合适溶剂中的N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，合适的溶剂例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)或乙腈。金属-催化偶联反应，优选Suzuki反应，可根据标准方法进行，优选在例如四(三苯膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)的钯催化剂的存在下，在例如碳酸钠水溶液的碱溶液中，以及例如甲苯、乙醇、二甲氧基乙烷(DME)或DMF的合适的溶剂中进行。
式I′的FLT3抑制剂化合物可根据酰胺键形成的标准方法通过式1-2化合物与羧酸WCOOH(综述参见M.Bodansky和A.Bodansky，ThePractice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，NY(1984))或通过与酰基氯WCOCl或活性酯WCO2Rq(其中Rq为例如五氟苯基或N-琥珀酰亚胺的离去基团)的反应制备。与WCOOH偶联优选的反应条件为当W为呋喃时，DCM中的草酰氯与作为催化剂的DMF形成酰基氯WCOCl，然后在例如DIEA的三烷基胺的存在下偶联；当W为吡咯时，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑-6-磺酰胺甲基盐酸盐(HOBt)；并且当W为咪唑时，优选条件为DCM中的三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(PyBrOP)和二异丙基乙胺(DIEA)。
能够理解的是，式I′的FLT3抑制剂化合物中环A上存在的任选的取代基可存在于起始物料1-1或1-3中，并且在这些情况下，将通过方案1列出的合成进行。或者，式I′化合物上的各种取代基可通过多种如下所述方法引入以为式I′的FLT3抑制剂化合物提供任选的取代基。式1-0或1-3中环A上的离去基团“L1”可在方案1的任何步骤中或者之前取代。当这些离去基团(优选氟或氯)通过用于亲核进攻的式1-3的硝基活化时，其可以通过氨和叠氮化物阴离子、或者在例如碳酸钾、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)或NEt3的合适的碱的存在下通过胺、醇、硫醇以及其它亲核基团进行直接亲核芳基取代。当离去基团适于金属催化偶联(优选溴或三氟甲烷磺酰氧基)时，可以进行多个交叉偶联反应(例如上述用于引入R2的Suzuki或Stille反应)。其它可以使用的金属催化的偶联反应包括芳香族和杂芳香族胺化和酰胺化。综述参见S.L.Buchwald等人，Top.Curr.Chem.，219131-209(2001)和J.F.Hartwig，″Organopalladium Chemistry for Organic Synthesis，″Wiley Interscience，NY(2002)。如果L1是通过硝基活化以产生任选的甲基取代基的溴、碘或氯，可使用具有2，4，6-三甲基环硼三氧烷的金属催化交叉偶联反应。参见M.Gray等人，Tetrahedron Lett.，416237-40(2000)。
在某些情况下，初始取代基可如下所述另外衍生化以提供式I′的FLT3抑制剂化合物的最终取代基。
用于向环A引入含氮杂环取代基的另一方法是由环A上的氨基形成杂环。氨基可以保护或未保护形式初始存在于起始物料中，或者可通过硝基的还原产生，硝基也可初始存在于起始物料中或者可通过硝化反应引入。此外，氨基可通过叠氮基的还原形成，叠氮基可存在于起始物料中，或者可由如上所述的活化卤通过叠氮阴离子的亲核芳香取代得到。氨基还可通过氨或保护的氨等价物，例如叔丁基氨基甲酸酯的阴离子由活化卤化物(例如硝基卤化物)的亲核芳基取代产生。如果以保护形式引入，胺可根据标准文献方法脱保护。例如胺保护基和脱保护方法，参见Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，John Wiley and Sons，Inc.，NY(1991)。成环反应包括使用合适任选取代的二亲电试剂，优选二卤化物或二羰基化合物处理苯胺氨基，其导致氨基上的两个取代基形成任选取代的杂环。在二卤化物的情形下，可以作为除酸剂加入任意多种合适的碱，例如碳酸钾、氢氧化钠或三烷基胺，例如三乙胺。因此，使用双(2-卤代乙基)胺例如双(2-氯乙基)胺或双(2-溴甲基)胺处理将得到哌嗪环(参见例如J.Med.Chem.，29640-4(1986)和J.Med.Chem.，462837(2003))。反应试剂的胺氮原子上任选的取代基将并入哌嗪末端胺上任选的取代基上。例如，使用N，N-双(2-氯乙基)苯胺的处理将得到N-苯基哌嗪子基。使用双(2-卤乙基)醚或双(2-卤乙基)硫醚的处理将分别得到吗啉或硫代吗啉环。
直接取代以向环A上引入杂环取代基的另一方法是由醛(即，由环A上的甲酰基)形成杂环。甲酰基可以保护或未保护形式存在于起始物料中，或可由文献中已知的方法由多种甲酰化反应的一种形成，包括Vilsmeier-Haack反应，甲酰化的综述参见G.A.Olah等人，Chem Rev.，87(1987)，或通过硝基芳香化合物的对-甲酰化形成，参见例如A.Katritsky and L.Xie，Tetrahedron Lett.，37347-50(1996)。
最后可以理解的是，式I′的FLT3抑制剂化合物可另外衍生化。式I′的FLT3抑制剂化合物上的保护基可根据标准合成方法除去(例如参见Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，John Wiley and Sons，Inc.，NY(1991))并且然后可以进行此外的衍生作用。式I′的FLT3抑制剂化合物此外的衍生作用的实例包括但不限于当式I′化合物含有伯胺或仲胺时，胺可以与醛或酮在例如三乙酰氧基硼氢化钠的还原剂的存在下反应(参见Abdel-MagidJ.Org.Chem.61，第3849-3862页，(1996))以还原烷基化；与酰基氯或羧酸和如上所述酰胺键形成反应物以形成酰胺；与磺酰氯形成磺酰胺；与异氰酸酯形成脲；如上所述与芳基或杂芳基卤化物在钯催化剂的存在下(参见上述Buchwald和Hartwig参考文献)以形成芳基和杂芳基胺。此外当式I′的FLT3抑制剂化合物含有芳基卤或杂芳基卤时，这些化合物可以与硼酸(例如上述Suzuki或Stille偶合)、或胺，或醇(Buchwald或Hartwig型偶合，参见上述Buchwald和Hartwig参考文献)进行金属催化反应。当式I′的FLT3抑制剂化合物含有氰基时，该基团可以在酸或碱性条件下水解成酰胺或酸。碱性胺可氧化成N-氧化物，反之N-氧化物可还原成碱性胺。当式I′化合物含有非环状或环状硫醚时，硫醚可另外氧化成相应的亚砜或砜。亚砜可使用合适的氧化剂例如1当量(间氯过苯甲酸)MCPBA通过氧化得到，或者通过使用NaIO4(例如参见J.Regan等，J.Med.Chem.，464676-86(2003))处理得到，并且砜可使用2当量MCPBA得到，或通过使用4-甲基吗啉N-氧化物和催化四氧化锇处理得到(例如参见PCT申请WO 01/47919)。
方案2a
方案2a说明了合成式I′的FLT3抑制剂化合物的路线。F表示-NQaQbR3-、-O-、S、SO或SO2，并且AA表示-NH2或-NO2。D1和D2仅仅用于说明目的表示；本领域技术人员认识到还可存在D5D6D7D8。通过使用例如LDA的非亲核碱处理然后使用例如三氟甲磺酸酐的三氟甲磺酸酯或优选N-苯基三氟甲磺酰亚胺捕获所得烯醇盐，式2-1的酮可转化为式2-2的三氟甲磺酸乙烯酯。式2-3的硼酸或硼酸酯到式2-2的三氟甲磺酸乙烯酯的Suzuki偶合可提供式2-4的化合物，其中Z为C(Synthesis，993(1991))。
式2-4化合物使用Pd/C的处理可同时将烯烃和硝基(如果AA为NO2)还原以得到Z为CH，AA为NH2。F表示-SO2的式2-4化合物可通过使用MCPBA氧化或方案1所述的其它方法由AA为-NO2并且F为硫醚(F为-S-)的式2-4化合物制备。硝基然后可使用Pd/C还原以还原硝基和烯烃。
然后式2-4化合物如方案1所述转化为式2-5化合物(如果不需要进一步修饰，其还表示式I′的FLT3抑制剂化合物)。
式2-5化合物还可进一步修饰以提供其它式I′的FLT3抑制剂化合物。例如在F为-NQaQbR3-、QaQb为直接键并且R3表示BOC保护基(CO2tBu)的情形，BOC基可根据标准方法除去，例如DCM中的三氟乙酸(TFA)(Greene和Wuts，ibid.)以产生仲胺，其可然后进一步衍生化以提供式I′的FLT3抑制剂化合物。进一步的衍生化包括但不限于在例如三乙酰氧基硼氢化钠的还原剂的存在下与醛或酮反应以提供其中F为-NCH2R3的式II′的FLT3抑制剂化合物(A.F.Abdel-Magid，同上)；与酰基氯或羧酸和酰胺键形成试剂(如方案1所述)以提供其中F为-NCOR3的式II′的FLT3抑制剂化合物；与磺酰氯(如方案1所述)以提供其中F为-NSO2Ra的式I′的FLT3抑制剂化合物；与异氰酸酯(如方案1所述)以提供其中F为-NCONRaRb的式II′的FLT3抑制剂化合物；或进行方案1中列出的金属催化取代反应以提供其中F为-NR3的式I′的FLT3抑制剂化合物(S.L.Buchwald等人，同上；J.H.Hartwig，同上)。对于上述实例，Ra和Rb独立地为氢、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。
方案2b
方案2b说明了方案2a的改进以合成部分不饱和的式I′的FLT3抑制剂化合物。E表示-NQaQbR3-、-O-(D1和D2为H)、-S-(D1和D2-为H)、-(D1和D2-为H)或-SO2-(D1和D2-为H)，并且RAA表示-NH2或-NO2。式2-4化合物如方案2所述制备。如果RAA表示-NO2，硝基必须通过不还原烯烃的方法进行还原，例如铁和氯化铵。如果式2-4化合物为氨基则不需要所述步骤，并且式2-4化合物也就是式2-7化合物。为了制备其中E为-SO2-或-SO-的式2-7化合物，硫醚的氧化必须在RAA为-NO2的式2-4化合物上进行，然后进行硝基还原。
方案3
方案3说明了用于合成式I′的FLT3抑制剂化合物的中间体的制备，其中环A为吡啶基，并且R5为环A上任选的取代基或为式I′中定义的杂环取代基中的一个。K为NH2，或例如NO2、COOH或COOR的可最终通过已知文献方法转化为氨基的其它官能团，例如NO2还原(如方案1所述)或COOH的Curtius重排(综述参见Organic Reactions，3337(1947))。L3和L4为卤素。(K为COOH，还可通过简单的碱或酸催化水解由K为COOR形成)。
引入R2和R3的选择性和顺序通常可通过卤素L3和L4在化合物(3-1)中的相对反应性、杂环的内在选择性和/或使用的反应条件实现。在选择性引入R2和R3中使用卤素L3和L4相对选择性的实例将包括式3-1化合物中L3为氟和L4为溴的位置，可在通过金属催化取代化学取代剩余的溴之后实现氟基被亲核基团的选择性置换(例如以下另外列出的Suzuki或Stille交叉偶联反应)。类似地，在L3和L4中一个为碘并且另一个为溴基或氯基的式3-1化合物中，碘基上的选择性金属催化取代化学(例如Suzuki or Stille交叉偶联反应或如下进一步所述的Buchwald/Hartwig胺化反应)可在通过另一种金属催化的取代反应取代剩余的溴或氯基之后进行。如方案3所示，可以首先取代式3-1中的离去基团L3以得到式3-3化合物，或者首先取代离去基团L4以得到式3-2化合物。然后化合物3-2或3-3可以反应以置换L3或L4以提供式3-4化合物。
因此，使用仲胺、氨或保护的胺例如叔丁基氨基甲酸酯直接亲核置换或金属催化胺化式3-1化合物(综述参见Modern Amination MethodsRicci，A.，编辑；Wiley-VCHWeinheim，2000)可用于在式3-2或3-3中引入R5，其中R5为伯胺或仲胺、氨基(NH2)，以及胺等价物或保护的氨基。如方案1所示，使用硼酸或硼酸酯(Suzuki反应，M为硼酸基或硼酸酯基)，或使用有机锡化合物(Stille反应，M为SnR3，其中R3为烷基并且其它取代基如上所定义)金属催化偶联化合物3-1，可提供式3-2或3-3化合物。
通过如上所述金属催化Suzuki或Stille偶联，化合物3-2可另外转化为化合物3-4。此外，通过使用亲核基团直接亲核取代或金属催化反应，或通过如上所述相同的金属催化交叉偶联反应，化合物3-3中的L4随后还可被R5取代以得到式3-4化合物。当式(3-2、3-3或3-4)中的R5为保护的胺并且K不是氨基时，其可被脱保护以暴露氨基官能团。氨基官能团然后可另外如方案1所述衍生化。当式3-4中的K基不是氨基时(例如如上所述官能团)，其可根据已知文献方法转化为氨基(例如参见Comprehensive Organic TransformationsLarock，R.S.；Wiley andSons Inc.，USA，1999)，并且所得胺3-5可如方案(1)所述用于酰胺键形成反应以得到式I′的FLT3抑制剂化合物。当式3-4中的K基为氨基时，其可直接用于如上所述的酰胺偶联。
方案4a
方案4b
方案4a和4b说明由式4-1和4-5单卤素取代化合物开始通过已经完成第一取代后引入第二离去基团得到根据方案3进一步修饰的中间体的制备。这些还可用于合成环A为吡啶并且R5为环A上任选的取代基或者杂环取代基中一个的式I′的FLT3抑制剂化合物。如方案3所述，吡啶环上的剩余位置可如式I′所述被取代。K为NH2，或例如N02、COOH或COOR的可最终通过已知文献方法，例如通过还原或如方案3所述的Curtius重排转化为氨基的其它官能团。L3和L4为卤素。在这些化合物中，T为H或者可以通过文献已知方法转变为离去基团L3和L4的官能团，例如卤素、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯(例如参见Nicolai，E.等人，J.Heterocyclic Chemistry，31，(73)，(1994))。通过方案3所述方法置换式4-1化合物中的L3或者式4-5化合物中的L4，可得到式4-2和4-6化合物。在这一点，化合物4-2或4-6的取代基T可通过标准方法转变为离去基团L4或L3(优选卤素)以提供式4-3和4-5化合物。例如当T为OH时，进行该转化的优选的反应物为硫酰氯、PCl5、POCl3或PBr3(例如参见Kolder，den Hertog.，Reel.Trav.Chim.Pays-Bas；285，(1953)，和Iddon，B等人，Chem.Soc.Perkin Trans.1.，1370，(1980))。当T为H时，其可以直接卤化(优选溴化)以提供式4-3和4-7化合物(例如参见Canibano，V.等人，Synthesis，14，2175，(2001))。优选的溴化条件为合适的溶剂中的NBS，合适的溶剂例如为DCM或乙腈。
通过如上所述方法分别引入剩余的基团R2或R5，式4-3和4-7化合物可转变为式4-4和4-8化合物，然后通过方案3所述用于将式3-4和3-5化合物转化为式I′的FLT3抑制剂化合物的方法，转化为式I′的FLT3抑制剂化合物。
代表性式I′的FLT3抑制剂 通过上述方法合成的代表性式I′的FLT3抑制剂如以下图表和实施例所示。以下仅仅用于说明性目的，并且不以任何方式视为本发明的限制。本发明优选的化合物为实施例5、17、23、34、38和51。












实施例1 5-氰基-呋喃-2-羧酸
在氩气气氛下向具有搅拌棒和维格勒(vigreaux)柱的烧瓶中加入2-甲酰基-5-糠酸(2.8克，20毫摩尔)、盐酸羟胺(2.7克，40毫摩尔)和无水吡啶(50毫摩尔)。将混合物加热到85℃，加入乙酸酐(40毫升)并将混合物搅拌3小时。冷却到60℃后加入水(250毫升)，并将混合物在室温下搅拌70小时。使用浓盐酸将混合物酸化至pH为2并用3∶1的二氯甲烷-异丙醇(8×100毫升)萃取。合并的有机层用水(100毫升)、盐水(100毫升)洗涤、使用无水硫酸钠干燥并真空浓缩，以黄褐色固体得到标题化合物(1.26克，46％)。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ14.05(br s，1H)，7.74(d，1H，J＝3.8Hz)，7.42(d，1H，J＝3.8Hz)。
实施例2 4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸
通过文献步骤制备标题化合物(Loader和Anderson，Canadian J.Chem.592673(1981))。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ12.70(br s，1H)，7.78(s，1H)，7.13(s，1H)。
实施例3 4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐
a)1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈
装有咪唑-4-腈(0.5克，5.2毫摩尔)(Synthesis，677，2003)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯化物(SEMCl)(0.95毫升，5.3毫摩尔)、碳酸钾(1.40克，10.4毫摩尔)和丙酮(5毫升)的烧瓶在室温下搅拌10小时。将混合物用乙酸乙酯(20毫升)稀释并用水(20毫升)和盐水(20毫升)洗涤，并将有机层使用硫酸镁干燥。将粗产物使用30％乙酸乙酯/己烷从20克SPE柱(二氧化硅)洗脱，以无色油状物得到0.80克(70％)标题化合物。质谱(CI(CH4)，m/z)，C10H17N3Osi计算值224.1(M+H)，实测值224.1。
b)2-溴-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈
向1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈(0.70克，3.1毫摩尔)(在前面步骤中制备)在CCl4(10毫升)中的溶液中加入NBS(0.61克，3.4毫摩尔)和AIBN(催化量)，并将混合物在60℃加热4小时。反应用乙酸乙酯(30毫升)稀释并用碳酸氢钠(2×30毫升)和盐水(30毫升)洗涤，并将有机层使用硫酸镁干燥并浓缩。标题化合物使用30％乙酸乙酯/己烷从20克SPE柱(二氧化硅)洗脱，以得到0.73克(77％)黄色固体。质谱(CI(CH4)，m/z)，C10H16BrN3Osi计算值302.0/304.0(M+H)，实测值302.1/304.1。
c)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸乙酯
在-40℃向2-溴-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈(0.55克，1.8毫摩尔)(在前面步骤中制备)在THF(1毫升)中的溶液中滴加2M异丙基氯化镁在THF(1毫升)中的溶液。将反应在-40℃搅拌10分钟然后冷却到-78℃，并且加入氰基甲酸乙酯(0.3克，3.0毫摩尔)。将反应达到室温并搅拌1小时。反应使用饱和氯化铵淬灭、使用乙酸乙酯(20毫升)稀释并用盐水(2×20毫升)洗涤，并将有机层使用硫酸钠干燥然后浓缩。标题化合物使用30％乙酸乙酯/己烷从20克SPE柱(二氧化硅)洗脱，以得到0.4克(74％)无色油状物。质谱(ESI，m/z)C13H21N3O3Si的计算值296.1(M+H)，实测值296.1。
d)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐
向4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸乙酯(0.4克，1.3毫摩尔)(在前面步骤中制备)在乙醇(3毫升)中的溶液中加入6M氢氧化钾溶液(0.2毫升)，并将反应搅拌10分钟然后浓缩，以黄色固体得到0.40克(100％)标题化合物。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ7.98(s，1H)，5.92(s，2H)，3.62(m，2H)，0.94(m，2H)，0.00(s，9H)。质谱(ESI-neg，m/z)C11H17N3O3Si的计算值266.1(M-H)，实测值266.0。
实施例4 5-氰基-呋喃-2-羧酸[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(3-甲基-噻吩-2-基)-苯基]-酰胺
a)1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪 在0℃分两部分将2-溴-4-氟硝基苯(949毫克，4.31毫摩尔)加入到纯N-甲基哌嗪(8毫升)并加热至室温。将反应加热到60℃1小时，然后使用50毫升乙酸乙酯稀释并倒入水(50毫升)中。分层，并将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤、干燥(硫酸钠)并真空浓缩，以黄色固体得到580毫克(45％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C11H14BrN3O2，300.0(M+H)，实测值300.1。
b)4，4，5，5-四甲基-2-(3-甲基-噻吩-2-基)-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷
在-40℃向2-溴-3-甲基噻吩(337毫克，1.9毫摩尔)在8毫升THF的溶液中加入正丁基锂(0.8毫升，2.5M/己烷)，并将反应搅拌30分钟。此时加入2-异丙氧基-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷(775微升，3.8毫摩尔)，并将反应加热至环境温度，并继续搅拌1小时。将反应冷却至0℃并使用饱和碳酸氢钠水溶液(10毫升)淬灭。将混合物倒入乙酸乙酯(100毫升)，用水洗涤(2×50毫升)，干燥(硫酸钠)并真空浓缩。通过硅胶制备性薄层色谱法(20％EtOAc-己烷)纯化残余物以油状物得到224毫克(53％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ1.36(s，12H)，2.5(s，3H)，6.99(d，1H，J＝4.8Hz)，7.50(d，1H，J＝4.8Hz)。
c)1-甲基-4-[3-(3-甲基-噻吩-2-基)-4-硝基-苯基]-哌嗪
向含有1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪(68毫克，0.2毫摩尔，实施例步骤(a)制备)、4，4，5，5-四甲基-2-(3-甲基-噻吩-2-基)-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷(61毫克，0.27毫摩尔，前面步骤制备)和Pd(PPH3)4(14毫克，6摩尔％)的烧瓶中加入甲苯(3毫升)、乙醇(3毫升)和2M碳酸钠(4毫升)。将所得混合物在80℃加热2小时然后倒入乙酸乙酯(25毫升)。分离有机层，干燥(硫酸钠)并真空浓缩。通过硅胶制备性薄层色谱法(EtOAc)纯化以浅黄色固体得到40毫克(63％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C16H19N3O2S计算值，318.1(M+H)，实测值318.2。
d)5-氰基-呋喃-2-羧酸[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(3-甲基-噻吩-2-基)-苯基]-酰胺
1-甲基-4-[3-(3-甲基-噻吩-2-基)-4-硝基-苯基]-哌嗪(60毫克，0.18毫摩尔，前面步骤中制备)与甲醇(5毫升)中的40毫克5％Pd/C在氢气(1大气压)气氛下搅拌2小时。反应通过硅藻土过滤并真空浓缩，以褐色固体得到40毫克(72％)4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(3-甲基-噻吩-2-基)-苯胺，其无须进一步纯化立刻使用。以类似于实施例9步骤(c)的方法，4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(3-甲基-噻吩-2-基)-苯胺(40毫克，0.13毫摩尔)与5-氰基-呋喃-2-碳酰氯(30毫克，0.19毫摩尔，实施例9步骤(c)制备)反应，以黄色固体得到18.9克(36％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ2.13(s，3H)，2.38(s，3H)，2.59-2.62(m，4H)，3.24-3.27(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.8Hz)，7.06(d，1H，J＝5.1Hz)，7.15(d，1H，J＝3.7Hz)，7.19＜d，1H，J＝3.7Hz)，7.02(dd，1H，J＝2.8，9.0Hz)，7.42(d，1H，J＝5.1Hz)，8.11(s，1H)，8.34(d，1H，J＝9.0Hz)；质谱(ESI，m/z)C22H22N4O2S计算值407.1(M+H)，实测值407.1。
实施例5 5-氰基-呋喃-2-羧酸[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(4-甲基-噻吩-3-基)-苯基]-酰胺
a)4，4，5，5-四甲基-2-(2-甲基-噻吩-3-基)-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷
使用类似于实施例4步骤(b)的方法，3-溴-4-甲基噻吩(571毫克，3.2毫摩尔)使用正丁基锂(1.41毫升，2.5M/己烷)处理，然后与2-异丙氧基-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷(775微升，3.8毫摩尔)反应，以无色油状物得到189毫克(26％)标题化合物。
b)1-甲基-4-[3-(4-甲基-噻吩-3-基)-4-硝基-苯基]-哌嗪
使用类似于实施例4步骤(c)的方法，1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪(162毫克，0.54毫摩尔)、4，4，5，5-四甲基-2-(2-甲基-噻吩-3-基)-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷(145毫克，0.64毫摩尔)和Pd(PPh3)4(37毫克，6摩尔％)反应，以黄色固体得到108毫克(71％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ2.02＜s，3H)，2.37(s，3H)，2.55-2.57(m，4H)，3.42-3.45(m，4H)，6.66(d，1H，J＝2.8Hz)，6.87(s，1H)，6.99-7.00(m，1H)，7.09(d，1H，J＝3.2Hz)，8.13(d，1H，J＝9.2Hz)。
c)4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(4-甲基-噻吩-3-基)-苯胺
使用类似于实施例4步骤(d)的方法，1-甲基-4-[3-(4-甲基-噻吩-3-基)-4-硝基-苯基]-哌嗪(100毫克，0.32毫摩尔)与80毫克5％Pd/C在氢气气氛下搅拌，以黑色油状物得到82毫克(89％)标题化合物，其无须纯化立即使用。质谱(ESI，m/z)C16H21N3S计算值，288.15(M+H)，实测值288.1。
d)5-氰基-呋喃-2-羧酸[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(4-甲基-噻吩-3-基)-苯基]-酰胺
以类似于实施例9步骤(c)的方法，5-氰基-呋喃-2-碳酰氯(64毫克，0.41毫摩尔，实施例9步骤(c)制备)与4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-(4-甲基-噻吩-3-基)-苯胺(80毫克，0.27毫摩尔，上一步骤制备)在DIEA(0.10毫升，0.59毫摩尔)的存在下反应，以黄色固体得到25.8毫克(24％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ2.09(s，3H)，2.37(s，3H)，2.59-2.60(m，4H)，3.24-3.26(m，4H)，6.83(d，1H，J＝2.9Hz)，6.98-7.06(m，2H)，7.14-7.21(m，3H)，7.96(s，1H)，8.32(d，1H，J＝9.0Hz)。质谱(ESI，m/z)C22H22N4O2S计算值407.1(M+H)，实测值407.1。
实施例6 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-羟基-1-羟甲基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
a)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2，2-二甲基-[1，3]二氧杂环己烷-5-基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺 向二氯甲烷(3毫升)中的4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(81毫克，0.16毫摩尔，如实施例14步骤(b)制备)的浆液中加入NEt3(33微升，0.24毫摩尔)。溶液然后使用2，2-二甲基-[1，3]二氧杂环己烷-5-酮(31毫克，0.24毫摩尔)处理并将反应搅拌3小时。此时一次性加入NaBH(OAc)3(51毫克，0.24毫摩尔)，并将反应另外搅拌4小时。反应使用水(10毫升)稀释并用EtOAc(2×25毫升)萃取。有机萃取物干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过硅胶制备性薄层色谱法(10％MeOH-CHCl3)纯化，以灰白色半固体得到22毫克(28％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C28H35N5O3计算值490.2(M+H)，实测值490.6。
b)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-羟基-1-羟甲基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐 向4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2，2-二甲基-[1，3]二氧杂环己烷-5-基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺(22毫克，0.04毫摩尔，在前面步骤制备)在THF-H2O(1毫升，4∶1v/v)的溶液中加入TFA(0.4毫升)，并将反应搅拌1小时。真空除去溶剂，以琥珀色泡沫得到14毫克(60％)标题化合物。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ1.78-1.90(m，4H)，2.03-2.16(m，3H)，2.29(br s，4H)，2.88-2.96(m，1H)，3.37-3.40(m，1H)，3.46-3.53(m，2H)，3.74-3.78(m，3H)，5.83(s，1H)，7.13(d，1H，J＝2.O HZ)，7.22(dd，1H，J＝2.0，8.4Hz)，8.03(s，1H)，8.17(d，1H，J＝8.4Hz)；质谱(ESI，m/z)C25H31N5O3计算值450.2(M+H)，实测值450.2。
实施例7 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吗啉-4-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基)-酰胺
向吗啉-4-基-乙酸乙酯(117毫克，0.67毫克)在乙醇(4毫升)的溶液中通过注射器加入6N氢氧化钾(110微升，0.67毫摩尔)并且连续搅拌3小时。真空浓缩得到122毫克(100％)吗啉-4-基-乙酸钾盐。向吗啉-4-基-乙酸钾盐(29毫克，0.15毫摩尔)、4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(65.1毫克，0.13毫摩尔，如实施例14步骤(b)制备)和PyBroP(93毫克，0.19毫摩尔)在CH2Cl2(4毫升)的混合物中加入DIEA(51微升，0.29毫摩尔)并将反应付搅拌整夜。反应用CH2Cl2(50毫升)稀释，用H2O(2×25毫升)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。粗产物通过硅胶制备TLC纯化，以白色固体得到8.1毫克(12％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ1.68-2.04(m，5H)，2.20-2.29(m，4H)，2.53-2.78(m，5H)，3.09-3.23(m，6H)，3.35-3.40(m，1H)，3.72(br s，4H)，4.16-4.22(m，1H)，4.73-4.77(m，1H)，5.82(s，1H)，7.00(s，1H)，7.12(dd，1H，J＝0.6，8.0Hz)，7.73(s，1H)，8.27(d，1H，J＝8.1Hz)，9.48(s，1H)；质谱(ESI，m/z)C28H34N6O3计算值503.27(M+H)，实测值503.1。
实施例8 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(3-吗啉-4-基-丙酰基)-哌啶-4-基]苯基}-酰胺
向含有3-吗啉-4-基-丙酸钾盐(94毫克，0.47毫摩尔，如实施例7所述由3-吗啉-4-基-丙酸乙酯制备)、4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(179毫克，0.36毫摩尔，如实施例14(b)制备)、EDCI(83毫克，0.43毫摩尔)和HOBT(68毫克，0.5毫摩尔)的烧瓶中加入DMF(4毫升)。向搅拌悬浮液中加入DIEA(157微升，0.9毫摩尔)并将反应搅拌整夜。反应用水(10毫升)稀释并用乙酸乙酯(2×25毫升)萃取。合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)、真空浓缩，并将粗产物通过硅胶制备性TLC纯化，以白色固体得到10.4毫克(6％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ1.49-1.93(m，5H)，2.22-2.31(m，3H)，2.52(br s，4H)，2.58-2.63(m，3H)，2.74-2.76(m，4H)，3.10-3.17(m，2H)，3.72(br s，4H)，3.97-4.02(m，2H)，4.76-4.81(m，2H)，5.81-5.82(m，1H)，6.81-6.82(m，1H)，6.99-7.00(m，1H)，7.09-7.13(m，1H)，7.70(s，1H)，8.26(d，1H，J＝8.2Hz)，9.51(s，1H)；质谱(ESI，m/z)C29H36N6O3计算值517.28M+H)，实测值517.3。
实施例9 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2′-甲基-5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-联苯-2-基]-酰胺
a)1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪
向1.00克(4.55毫摩尔)2-溴-4-氟硝基苯(Oakwood)于12毫升EtOH中的冷却(0℃)溶液中加入1.52毫升(13.7毫摩尔)哌啶。将溶液在0℃搅拌0.5小时然后在60℃搅拌4小时。将混合物真空浓缩、溶于EtOAc(60毫升)、用水(3×100毫升)和盐水(100毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。真空浓缩并使用1-3％甲醇-二氯甲烷在50克二氧化硅SPE柱上色谱分离，以浅黄褐色固体得到1.06克(77％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C11H14BrN3O2计算值300.0(M+H，＜79＞Br)，实测值300.1。
b)1-甲基-4-(2′-甲基-6-硝基-联苯-3-基)-哌嗪
200毫克(0.666毫摩尔)1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪(前面步骤制备)、136毫克(0.999毫摩尔)和77.0毫克(0.0666毫摩尔)四(三苯基膦)钯(0)的混合物在氩气气氛下加入4.0毫升脱气二甲氧基乙烷(DME)和400微升(0.799毫摩尔)2.0M Na2CO3水溶液。混合物在氩气气氛下在80℃搅拌加热14小时。将冷却(室温)的混合物浓缩并且使用二氯甲烷-己烷(1∶1)中1-5％的甲醇在10克二氧化硅SPE柱上色谱分离。粗级分使用80毫克脱色炭处理、过滤、浓缩，并且然后使用1-3％乙醇-二氯甲烷在类似柱上再次色谱分离，以265毫克黄色树脂得到标题化合物(作为与三苯膦的混合物通过1H-NMR测量为75％的纯度)，其无须进一步纯化用于以下反应质谱(ESI，m/z)C11H21N3O3的计算值312.2(M+H)，实测值312.2。
c)5-氰基-呋喃-2-羧酸[2′-甲基-5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-联苯-2-基]-酰胺
140毫克(0.337毫摩尔，纯度75％)1-甲基-4-(2′-甲基-6-硝基-联苯-3-基)-哌嗪(前面步骤制备)和70毫克10％Pd/C(Degussa E101-NE/W，Aldrich，50重量％水)在5毫升THF中的混合物在氢气球下剧烈搅拌1小时。将混合物过滤(硅藻土)、用二氯甲烷洗涤(2×2毫升)，并将所得苯胺溶液置于氩气气氛并立即用于下面反应。
与上述还原同时，在CaSO4干燥管下2.5毫升无水二氯甲烷中的55.4毫克(0.404毫摩尔)5-氰基呋喃-2-羧酸(如实施例1制备)使用52.9微升(0.606毫摩尔)草酰氯处理然后用10微升无水DMF处理。溶液搅拌25分钟并在20-25℃真空浓缩。所得5-氰基-呋喃-2-碳酰氯置于高真空下2-3分钟然后立即放置在氩气气氛，在冰浴中冷却至0℃，并用以上制备的苯胺溶液处理，然后加入141微升(0.808毫摩尔)N，N-二异丙基乙胺(DIEA)。在室温下搅拌30分钟后将混合物真空浓缩，并将所得残余物使用2-10％乙醇-二氯甲烷在20克二氧化硅SPE柱上色谱分离以产生黄色树脂(其从乙酸乙酯-己烷中结晶)，以黄色固体得到17.2毫克(13％)纯标题化合物和70.3毫克不纯标题化合物。将不纯组分溶于50毫升EtOAc，用饱和NaHCO3水溶液-1M K2CO3(1∶1，2×20毫升)和盐水(20毫升)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，以黄色结晶固体另外得到43.4毫克(32％)标题化合物(总收率45％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.32(d，1H，J＝9.0Hz)，7.73(br s，1H)，7.34-7.54(m，3H)，7.25(d，1H，J＝7.7Hz)，7.12，7.14(AB q，2H，J＝3.7Hz)，7.01(dd，1H，J＝9.0，2.8Hz)，3.25-3.27(m，4H)，2.59-2.62(m，4H)，2.38(s，3H)，和2.15(s，3H)。质谱(ESI，m/z)C21H24N4O3计算值401.2(M+H)，实测值401.1。
实施例10 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2′-氟-5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-联苯-2-基]-酰胺
a)1-(2′-氟-6-硝基-联苯-3-基)-4-甲基-哌嗪
除了混合物加热22小时以外，使用75.0毫克(0.250毫摩尔)1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪(如实施例9步骤(a)制备)、136毫克(0.999毫摩尔)2-氟苯基硼酸、26.8毫克(0.0232毫摩尔)四(三苯膦)钯(0)和400微升(0.799毫摩尔)Na2CO3在DME中2.0M的溶液，重复实施例9步骤(b)的过程。使用二氯甲烷-己烷(1∶1)中的1-5％甲醇在5克二氧化硅SPE柱上色谱分离，以黄色树脂得到95.0毫克标题化合物(作为与三苯膦的混合物，通过1H-NMR测量为76％的纯度)，其无须纯化用于以下反应。质谱(ESI，m/z)C17H18FN3O3计算值316.1(M+H)，实测值316.2。
b)5-氰基-呋喃-2-羧酸[2′-氟-5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-联苯-2-基]-酰胺
使用93.2毫克(0.225毫摩尔，纯度为76％)的1-(2′-氟-6-硝基-联苯-3-基)-4-甲基-哌嗪(如前面步骤制备)、46毫克10％Pd/C、37.0毫克(0.270毫摩尔)5-氰基呋喃-2-羧酸(如实施例1制备)、35.3微升(0.405毫摩尔)草酰氯、5.0微升无水DMF和94.1微升(0.540毫摩尔)DIEA，重复实施例9步骤(c)的过程。使用1-4％甲醇-二氯甲烷在5克二氧化硅SPE柱上色谱分离，以黄色树脂得到69.8毫克(77％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.04(d，1H，J＝9.0Hz)，7.93(brs，1H)，7.434-7.48(m，1H)，7.37(td，1H，J＝7.5，1.8Hz)，7.22-7.31(m，2H)，7.13，7.18(AB q，2H，J＝3.7Hz)，7.02(dd，1H，J＝9.0，2.9Hz)，6.88(d，1H，J＝2.9Hz)，3.24-3.27(m，4H)，2.57-2.60(m，4H)，和2.36(s，3H)。质谱(ESI，m/z)C23H21FN4O2计算值405.2(M+H)，实测值405.2。
实施例11 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-酰胺
a)1-(3-环己-1-烯基-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪
102毫克(0.340毫摩尔)1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪(如实施例9步骤(a)备)、59.7毫克(0.474毫摩尔)环己烯-1-基硼酸、43.8毫克(0.0379毫摩尔)四(三苯膦)钯(0)的混合物在氩气气氛下使用206微升(0.412毫摩尔)2.0M脱气Na2CO3溶液、0.6毫升脱气无水甲苯和0.2毫升脱气无水乙醇处理，并将混合物在100℃加热21小时。冷却至室温后，将混合物倒入乙酸乙酯(10毫升)，用盐水洗涤(10毫升)，干燥(硫酸钠)并真空浓缩。使用二氯甲烷中1-3％乙醇在5克二氧化硅SPE柱上色谱分离，以黄色油状物得到126毫克标题化合物(作为与三苯膦的混合物，通过1H-NMR测量为74％的纯度)，其无须纯化用于随后的反应。质谱(ESI，m/z)C17H23N3O3计算值302.2(M+H)，实测值302.2。
b)5-氰基-呋喃-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-酰胺
向5.0毫升EtOH-水(2∶1)中的122毫克(0.299毫摩尔，纯度为74％)的1-(3-环己-1-烯基-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪(如前面步骤制备)中加入83.8毫克(1.50毫摩尔)铁粉和160毫克(2.99毫摩尔NH4Cl，并将混合物在氩气下回流12小时。另外加入83.8毫克(1.50毫摩尔)铁粉，并将混合物回流1小时。混合物倒入EtOAc(12毫升)、过滤(硅藻土)、用EtOAc(2×4毫升)洗涤，真空浓缩并溶于无水THF(4.0毫升)。将所得苯胺溶液置于氩气气氛下并立即用于以下反应。在CaSO4干燥管下2.5毫升无水二氯甲烷中的61.6毫克(0.449毫摩尔)5-氰基呋喃-2-羧酸(如实施例1制备)使用60.0微升(0.688毫摩尔)草酰氯处理然后用10微升无水DMF处理。溶液搅拌25分钟并在20-25℃快速真空浓缩。残余物置于高真空下2-3分钟并且然后立即放置在氩气气氛，在冰浴中冷却至0℃，并用以上制备的苯胺溶液处理，然后加入104微升(0.598毫摩尔)DIEA。在室温下搅拌30分钟后，混合物真空浓缩、溶于乙酸乙酯(20毫升)、用1M碳酸钾溶液(2×10毫升)和盐水(10毫升)洗涤，干燥(硫酸钠)并真空浓缩。所得残余物使用1-4％甲醇-二氯甲烷在10克二氧化硅SPE柱上色谱分离以得到黄色树脂，然后从乙醚-己烷中结晶，以结晶黄色固体得到84.7毫克(72％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.57(br s，1H)，8.26(d，1H，J＝9.0Hz)，7.20，7.23(AB q，2H，J＝3.7Hz)，6.86(dd，1H，J＝9.0，2.9Hz)，6.74(d，1H，J＝2.9Hz)，5.84-5.85(m，1H)，3.20-3.22(m，4H)，2.57-2.59(m，4H)，2.36(s，3H)，2.23-2.30(m，4H)，和1.79-1.84(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C23H26N4O2计算值391.2(M+H)，实测值391.2。
实施例12 5-氰基-呋喃-2-羧酸[2-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-酰胺
a)1-[3-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4-硝基-苯基]-4-甲基-哌嗪
在氩气气氛下，1-(3-溴-4-硝基-苯基)-4-甲基-哌嗪(如实施例9步骤(a)制备)(225.1毫克，0.79毫摩尔)、K2CO3(310.9毫克，2.25毫摩尔)和4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷-2-基)-3，6-二氢-2H-吡喃(Murata，M.等人，Synthesis，778，(2000))(157毫克，0.75毫摩尔)在二氧杂环己烷(5毫升)中在80℃加热整夜。将反应混合物冷却至室温、浓缩，并将所得残余物在二氧化硅(10％EtOAc/己烷-20％MeOH/EtOAc)上色谱分离以得到标题化合物(82毫克，36％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.04(d，＝1H，J＝9.4Hz)，6.78(dd，1H，J＝9.4，2.6Hz)，6.58(m，1H，J＝2.6Hz)，5.58(m，1H)，4.34(m，2H)，3.95(t，2H，J＝5.3Hz)，3.46(m，4H)，2.57(m，4H)，2.38(s，3H)。
b)5-氰基-呋喃-2-羧酸[2-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-酰胺
1-[3-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4-硝基-苯基]-4-甲基-哌嗪(如前面步骤制备)(80毫克，0.26毫摩尔)使用类似于实施例4步骤(d)的步骤转化为相应的胺，并与如实施例9步骤(c)制备的5-氰基-呋喃-2-碳酰氯(由137毫克，1.00毫摩尔5-氰基-呋喃-2-羧酸如实施例1制备)在CH2Cl2(2毫升)中在0℃偶联。产物通过快速色谱在二氧化硅(50％EtOAc/己烷-10％MeOH/EtOAc)上分离以得到标题化合物(62.2毫克，60％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.35(br s，1H)，8.12(d，每个1H，J＝-8.76Hz)，7.24(d，1H，J＝5.08Hz)，7.19(d，1H，J＝5.08Hz)，6.88(dd，1H，J＝8.76，2.7Hz)，6.73″(d″″，1H，J＝2.7Hz)，5.88(br s，1H)，4.34(m，2H)，3.94(t，2H，J＝5.3Hz)，3.23(m，4H)，2.59(m，4H)，2.38(br s，5H)。LC-MS(ESI，m/z)C22H24N4O3计算值393.1(M+H)，实测值393.2。
实施例13 4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
a)4-(4-氨基-苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯
根据实施例35步骤(b)的过程，标题化合物通过4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂戊烷-2-基)-苯胺与4-三氟甲磺酰氧基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(Synthesis，993，(1991))的Suzuki偶联制备。质谱(ESI，m/z)C16H22N2O2计算值275.2(M+H)，实测值275.1。
b)4-(4-氨基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯
4-(4-氨基-苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(0.35克，1.2毫摩尔)(根据前面步骤制备)在甲醇中的溶液使用10％Pd/C以20psi氢化1小时。将溶液过滤并浓缩，以黄色固体得到0.35克(100％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C16H24N2O2计算值277.2(M+H)，实测值277.1。
c)4-(4-氨基-3-溴-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯
向4-(4-氨基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(0.20克，0.71毫摩尔)(根据前面步骤制备)在DCM(3毫升)的溶液中加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(0.13克，0.71毫摩尔)，并在室温下搅拌反应10小时。反应用EtOAc(10毫升)稀释并用NaHCO3(2×10毫升)和盐水(10毫升)洗涤。将有机层浓缩，以黄色泡沫得到0.26克(100％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C16H23BrN2O2计算值355.1(M+H)，实测值355.1。
d)4-(4-氨基-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯
装有4-(4-氨基-3-溴-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(0.13克，0.36毫摩尔)(根据前面步骤制备)、环己-1-烯基硼酸(0.060克，0.48毫摩尔)、Pd(PPh3)4(0.04克，10摩尔％)、2M Na2CO3水溶液(1.5毫升)、乙醇(1.5毫升)和甲苯(3毫升)的烧瓶在80℃加热3小时。反应用EtOAc(10毫升)稀释，用NaHCO3(2×10毫升)和盐水(10毫升)洗涤，并将有机层通过Na2SO4干燥然后浓缩。标题化合物使用30％EtOAc/己烷从20克SPE柱(二氧化硅)洗脱，以黄色油状物得到0.10克(85％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C22H32N2O2计算值357.2(M+H)，实测值357.1。
e)4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐 将烧瓶装有4-(4-氨基-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(0.050克，0.14毫摩尔)(根据前面步骤制备)、4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸(0.019克，0.14毫摩尔)(如实施例2制备)、EDCI(0.040克，0.21毫摩尔)、HOBt(0.019克，0.14毫摩尔)、DIEA(0.073毫升，0.42毫摩尔)和DCM(0.5毫升)并在25℃搅拌10小时。反应直接装在10克固相萃取(SPE)柱(二氧化硅)并将所得中间体使用30％EtOAc/己烷洗脱。化合物在室温下在50％TFA/DCM(2毫升)中搅拌1小时，然后浓缩并通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化12分钟，以得到标题化合物(0.052克，77％)。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ7.59(s，1H)，7.50(d，1H)，7.22(d，1H)，7.16(m，2H)，5.74(m，1H)，3.54.(m，2H)，3.16(m，2H)，2.94(m，1H)，2.29(m，2H)，2.15(m，4H)，1.92(m，2H)，1.72(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C23H26N4O计算值375.2(M+H)，实测值375.1。
实施例14 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
a)4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯
向4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(3.34克，10.9毫摩尔)(如实施例3步骤(d)制备)在20毫升DCM中的溶液中加入DIEA(3.8毫升，21.8毫摩尔)和PyBroP(5.6克，12.0毫摩尔)，并将反应在25℃搅拌15分钟。加入4-(4-氨基-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.9克，10.9毫摩尔)(如实施例13步骤(d)制备)在10毫升DCM中的溶液并将反应在25℃搅拌8小时。反应用EtOAc(60毫升)稀释，用NaHCO3(2×60毫升)和盐水(100毫升)洗涤，并将有机层通过Na2SO4干燥然后浓缩。标题化合物通过快速色谱(硅胶，2％EtOAc/DCM)纯化，以黄色油状物得到5.5克(85％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C33H47N5O4Si计算值606.2(M+H)，实测值606.2。
b)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐 向4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.5克，2.5毫摩尔)(根据前面步骤制备)在10毫升DCM和0.3毫升EtOH的溶液中加入3毫升TFA并将溶液在25℃搅拌3小时。反应用5毫升乙醇稀释然后浓缩。残余物从甲醇和乙醚中结晶，以白色固体得到0.85克(70％)标题化合物。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.18(d，1H)，8.04(s，1H)，7.22(dd，1H)，7.12(d，1H)，5.76(m，1H)，3.54.(m，2H)，3.16(m，2H)，2.92(m，1H)，2.30(m，4H)，2.10(m，2H)，1.75(m，6H)。质谱(ESI，m/z)C22H25N5O计算值376.2(M+H)，实测值376.2。
实施例15 4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺
根据实施例37的方法由4-氰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例13步骤(e)制备)制备标题化合物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ10.82(s，1H)，8.28(d，1H)，8.18(s，1H)，7.48(d，1H)，7.16(dd，1H)，7.02(s，1H)，6.72(s，1H)，5.88(m，1H)，4.82(m，1H)，3.98.(m，1H)，3.20(m，1H)，2.70＜m，2H)，2.29(m，4H)，2.18(s，3H)，1.80(m，8H)。质谱(ESI，m/z)C25H28N4O2计算值417.2(M+H)，实测值417.1。
实施例16 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺
根据实施例37的方法由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例13步骤(b)制备)制备标题化合物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ13.12(br s，1H)，9.58(s，1H)，8.34(d，1H)，7.76(s，1H)，7.21(dd，1H)，7.05(d，1H)，5.86(s，1H)，4.84(m，2H)，4.00(m，1H)，3.22(m，1H)，2.72(m，2H)，2.30(m，4H)，2.21(s，3H)，1.80(m，8H)。质谱(ESI，m/z)C24H27N5O2计算值418.2(M+H)，实测值418.1。
实施例17 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(4-甲基-环己-1-烯基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例14的方法，由4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(如实施例3步骤(d)制备)和4-(4-氨基-3-(4-甲基-环己-1-烯基)-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例13步骤(d)制备，用4-甲基-1-环己-1-烯基硼酸代替环己-1-烯基硼酸)制备标题化合物。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.18(d，1H)，8.04(s，1H)，7.22(dd，1H)，7.12(d，1H)，5.80(m，1H)，3.54.(m，2H)，3.18(m，2H)，2.94(m，1H)，2.30(m，3H)，2.12(m，2H)，1.92(m，5H)，1.54(m，1H)，1.12(d，3H)。质谱(ESI，m/z)C23H27N50计算值390.2(M+H)，实测值390.2。
实施例18 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环戊-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例14的方法，由4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(如实施例3步骤(d)制备)和4-(4-氨基-3-环戊-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例13步骤(d)制备，用环戊烯-1-基硼酸代替环己-1-烯基硼酸)制备标题化合物。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ14.25(br s，1H)，10.00(s，1H)，8.36(s，1H)，7.72(d，1H)，7.18(m，2H)，6.06(s，1H)，4.12(m，1H)，3.42(m，2H)，3.18(m，2H)，3.00(m，3H)，2.80(m，2H)，1.92(m，5H)。质谱(ESI，m/z)C21H23N5O计算值362.2(M+H)，实测值362.2。
实施例19 用于合成实施例所述中间体的其它方法如下所述。
5-氰基-呋喃-2-羧酸
向装有机械搅拌器、加热罩和冷凝器的250毫升三颈圆底烧瓶中加入5-甲酰基-2-呋喃甲酸(9.18克，65.6毫摩尔)和吡啶(60毫升)。加入盐酸羟胺(5.01克，72.2毫摩尔)并将混合物加热到85℃。加入乙酸酐(40毫升)并将反应在85℃搅拌3小时，然后在40℃减压蒸发溶剂。将残余物溶于水，使用2.0N氢氧化钠碱化至pH为9，并使用4∶1的二氯甲烷/2-丙醇萃取(5×200毫升)直到彻底除去吡啶。然后使用2.0N盐酸将水溶液酸化至pH为2，使用固体NaCl饱和，并使用4∶1的二氯甲烷/2-丙醇萃取(5×200毫升)。合并的有机萃取物通过硫酸钠干燥，并真空浓缩至干燥。残余物从二氯甲烷中结晶，以白色固体得到6.80克标题化合物(76％)。质谱(ESI-neg，m/z)C6H3NO3计算值为136.0(M-H)，实测值136.1。1H NMR光谱与指定结构一致。
实施例20 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲磺酰基-乙酰基)-哌啶-4-基]苯基}-酰胺
向烧瓶中加入甲磺酰基乙酸(14毫克，0.10毫摩尔)、EDCI(30毫克，0.15毫摩尔)、HOBt(14毫克，0.10毫摩尔)、DIEA(36微升，0.20毫摩尔)和0.5毫升DCM并在25℃搅拌。10分钟后，加入含有4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(40毫克，0.08毫摩尔)(如实施例20步骤(b)制备)和NEt3(14微升，0.09毫摩尔)在0.5毫升DCM中的溶液并将反应在25℃进行10小时。将反应混合物装入5克SPE柱(二氧化硅)，并将标题化合物使用10％EtOH/EtOAc洗脱以得到10毫克(25％)白色固体。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ11.60(br s，1H)，9.52(s，1H)，8.30(d，1H)，7.74(s，1H)，7.60(dd，1H)，7.03(d，1H)，5.86(m，1H)，4.84(m，1H)，4.18(s，2H)，4.12(m，1H)，3.32(m，1H)，3.20(s，3H)，2.82(m，2H)，2.30(m，4H)，1.98(m，2H)，1.84(m，5H)，1.72(m，1H)。质谱(ESI，m/z)C25H29N5O4S计算值496.2(M+H)，实测值496.2。
实施例21 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-[1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)苯基]-酰胺三氟乙酸盐
向烧瓶中加入4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(88毫克，0.18毫摩尔)(如实施例14步骤(b)制备)、吡啶-2-甲醛(17微升，0.21毫摩尔)、NEt3(30微升，0.21毫摩尔)、三乙酰氧基硼氢化钠(56毫克，0.25毫摩尔)和0.8毫升1，2-二氯乙烷并在25℃搅拌10小时。蒸发溶剂，并且标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化20分钟以得到81毫克(78％)白色固体。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ14.25(brs，1H)，9.90(br s，1H)，9.79(s，1H)，8.72(s，1H)，8.36(s，1H)，7.98(m，1H)，7.88(dd，1H)，7.58(d，1H)，7.52(m，1H)，7.20(m，1H)，7.12(d，1H)，5.76(m，1H)，4.56(s，2H)，3.40(m，2H)，3.18(m，2H)，2.88(m，1H)，2.20(m，4H)，2.00(m，4H)，1.72(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C28H30N60计算值467.2(M+H)，实测值467.2。
实施例22 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(4-甲基-环己-1-烯基)-4-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基)苯基}-酰胺三氟乙酸盐
此化合物根据实施例21的方法由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(4-甲基-环己-1-烯基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺(如实施例17制备)和吡啶-2-甲醛制备。1-NMR(400MHz，DMSOd6)δ14.25(br s，1H)，9.90(br s，1H)，9.79(s，1H)，8.72(s，1H)，8.36(s，1H)，7.98(m，1H)，7.86(dd，1H)，7.54(d，1H)，7.52(m，1H)，7.20(m，1H)，7.12(d，1H)，5.74(m，1H)，4.56(s，2H)，3.40(m，2H)，3.18(m，2H)，2.88(m，1H)，2.48-2.22(m，3H)，2.18-2.06(m，4H)，1.98-1.82(m，3H)，1.52(m，1H)，1.02(s，3H)。质谱(ESI，m/z)C28H32N60计算值481.2(M+H)，实测值481.2。
实施例23 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环戊-1-烯基-4-[1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基甲基)-哌啶-4-基]苯基}-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例21的方法，该化合物由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环戊-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(如实施例18制备)和1-甲基-1H-咪唑-2-甲醛制备。1H-NMR(400MHz5CD3OD)δ8.03(m，2H)，7.50(d，1H)，7.42(s，1H)，7.20(m，2H)，6.02(m，1H)，4.22(s，2H)，3.96(s，3H)，3.30(m，2H)，2.82-2.40(m，7H)，2.13-1.84(m，6H)。光谱(ESI，m/z)C26H29N70计算值456.2(M+H)，实测值456.2。
实施例24 4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-羧酸酰胺
向烧瓶中加入4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(51毫克，0.10毫摩尔)(如实施例14步骤(b)制备)、NEt3(22微升，0.15毫摩尔)、三甲基甲硅烷基异氰酸酯(16微升，0.11毫摩尔)和1.0毫升DCM并在25℃搅拌10小时。蒸发溶剂，并且标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中35-60％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化11分钟以得到30毫克(70％)白色固体。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ14.28(br s，1H)，9.76(s，1H)，8.34(s，1H)，7.84(d，1H)，7.18(dd，1H)，7.08(d，1H)，6.00(br s，2H)，5.72(m，1H)，4.18(m，2H)，2.80-2.60(m，3H)，2.24-2.10(m，4H)，1.80-1.60(m，6H)，1.50(m，2H)。质谱(ESI，m/z)C23H26N60计算值419.2(M+H)，实测值419.0。
实施例25 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(3，4，5，6-四氢-2H-[1，2′]联吡啶-4-基)-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
向烧瓶中加入4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(75毫克，0.15毫摩尔)(如实施例14步骤(b)制备)、K2CO3(84毫克，0.60毫摩尔)、2-氟吡啶(27微升，0.30毫摩尔)和0.3毫升N，N-二甲基乙酰胺并在120℃搅拌8小时。反应用3毫升水稀释，并且标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化9分钟以得到50毫克(75％)白色固体。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.18(d，1H)，8.06(m，1H)，8.02(s，1H)，7.94(dd，1H)，7.48(d，2H)，7.22(dd，1H)，7.12(d，1H)，6.98(t，1H)，5.82(m，1H)，4.32(m，2H)，3.46(m，2H)，3.00(m，1H)，2.30(m，4H)，2.18(m，2H)，1.96-1.74(m，6H)。质谱(ESI，m/z)C27H28N60计算值453.2(M+H)，实测值453.2。
实施例26 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-羟乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例21的方法，标题化合物由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(如实施例14步骤(b)制备)和羟基乙醛制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.18(d，1H)，8.02(s，1H)，7.22(dd，1H)，7.14(d，2H)，5.82(m，1H)，3.94(m，2H)，3.74(m，2H)，3.30(m，2H)，3.18(t，2H)，2.92(m，1H)，2.30(m，4H)，2.20-1.98(m，4H)，1.96-1.74(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C24H29N5O2计算值420.2(M+H)，实测值420.2。
实施例27 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(2-氰基-乙基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
向烧瓶中加入4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(77毫克，0.16毫摩尔)(如实施例14步骤(b)制备)、NEt3(24微升，0.16毫摩尔)、丙烯腈(12毫克，0.18毫摩尔)、0.1毫升甲醇和1.0毫升1，2-二氯乙烷并在80℃搅拌1小时。将反应浓缩，并且标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化12分钟以得到83毫克(95％)白色固体。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.18(d，1H)，8.06(m，1H)，7.22(dd，1H)，7.12(d，1H)，5.82(m，1H)，3.76(m，2H)，3.60(m，2H)，3.28(t，2H)，3.12(t，2H)，2.92(m，1H)，2.30(m，4H)，2.18-1.98(m，4H)，1.92-1.74(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C25H28N60计算值429.2(M+H)，实测值429.2。
实施例28 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-氨基甲酰基甲基-哌啶-4-基)-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
向烧瓶中加入4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(50毫克，0.10毫摩尔)(如实施例14步骤(b)制备)、NEt3(32微升，0.23毫摩尔)、2-溴乙酰胺(16毫克，0.12毫摩尔)和0.5毫升DCM并在25℃搅拌4小时。将反应浓缩，并且标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化12分钟以得到42毫克(75％)白色固体。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ14.28(br s，1H)，9.78(s，1H)，9.50(br s，1H)，8.34(s，1H)，8.00(s，1H)，7.88(d，1H)，7.72(s，1H)，7.18(dd，1H)，7.10(d，1H)，5.76(m，1H)，3.94(s，2H)，3.58(m，2H)，3.12(m，2H)，2.80(m，1H)，2.20(m，4H)，1.98(m，4H)，1.80(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C24H28N6O2计算值433.2(M+H)，实测值433.2。
实施例29 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吡啶-2-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
向烧瓶中加入4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(25毫克，0.05毫摩尔)(如实施例14步骤(b)制备)、吡啶-2-基乙酸盐酸盐(10毫克，0.06毫摩尔)、EDCI(12毫克，0.06毫摩尔)、HOBt(8.0毫克，0.06毫摩尔)、DIEA(36微升，0.20毫摩尔)和0.2毫升DMF并在25℃搅拌10小时。将反应用2毫升水稀释，并且标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化9分钟以得到22毫克(70％)白色固体。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.82(d，1H)，8.52(t，1H)，8.14(d，1H)，8.04(s，1H)，7.96(m，3H)，7.20(dd，1H)，7.10(d，1H)，5.82(m，1H)，4.68(m，1H)，4.32(m，2H)，4.18(m，1H)，3.40(m，1H)，2.88(m，2H)，2.30(m，4H)，2.06-1.60(m，8H)。质谱(ESI，m/z)C29H30N6O2计算值495.22(M+H)，实测值495.2。
实施例30 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吡啶-3-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例29中的方法，标题化合物由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(如实施例14步骤(b)制备)使用吡啶-3-基-乙酸制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.80(m，2H)，8.54(d，1H)，8.10(d，1H)，8.06(t，1H)，7.98(s，1H)，7.18(dd，1H)，7.08(d，1H)，5.78(m，1H)，4.68(m，1H)，4.20(m，1H)，4.18(s，2H)，3.36(m，1H)，2.84(m，2H)，2.28(m，4H)，2.06-1.70(m，7H)，1.62(m，1H)。质谱(ESI，m/z)C29H30N6O2计算值495.2(M+H)，实测值495.2。
实施例31 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吡啶-4-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例29中的方法，标题化合物由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(如实施例14步骤(b)制备)使用吡啶-4-基-乙酸制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.78(d，2H)，8.12(d，1H)，8.00(m，3H)，7.18(dd，1H)，7.08(d，1H)，5.80(m，1H)，4.66(m，1H)，4.22(s，2H)，4.18(m，1H)，3.34(m，1H)，2.84(m，2H)，2.24(m，4H)，2.00-1.70(m，7H)，1.64(m，1H)。质谱(ESI，m/z)C29H30N6O2计算值495.2(M+H)，实测值495.2。
实施例32 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-{1-[2-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例29中的方法，标题化合物由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(如实施例14步骤(b)制备)使用(1-甲基-1H-咪唑-4-基)-乙酸制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.82(s，1H)，8.10(d，1H)，8.00(s，1H)，7.42(s，1H)，7.16(dd，1H)，7.06(d，1H)，5.80(m，1H)，4.66(m，1H)，4.12(m，1H)，4.04(m，2H)，3.92(s，3H)，3.28(m，1H)，2.82(m，2H)，2.26(m，4H)，2.00-1.70(m，7H)，1.64(m，1H)。质谱(ESI，m/z)C28H31N7O2计算值498.2(M+H)，实测值498.2。
实施例33 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-1H-咪唑-4-基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
根据实施例29中的方法，标题化合物由4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(如实施例14步骤(b)制备)使用(1-甲基-1H-咪唑-4-基)-乙酸制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.88(s，1H)，8.12(d，1H)，8.02(s，1H)，7.44(s，1H)，7.20(dd，1H)，7.10(d，1H)，5.82(m，1H)，4.70(m，1H)，4.18(m，1H)，4.06(m，2H)，3.36(m，1H)，2.84(m，2H)，2.30(m，4H)，2.00-1.70(m，7H)，1.64(m，1H)。质谱(ESI，m/z)C27H29N7O2计算值484.2(M+H)，实测值484.2。
实施例34 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吗啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺二-三氟乙酸盐
a)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吗啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
向烧瓶中加入4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(830毫克，1.34毫摩尔)(如实施例39步骤(a)制备)、K2CO3(600毫克，4.34毫摩尔)、碘化钠(40毫克，0.27毫摩尔)、4-(2-氯-乙基)-吗啉盐酸盐(260毫克，1.40毫摩尔)和5.0毫升N，N-二甲基乙酰胺并在80℃搅拌8小时。将反应用EtOAc(50毫升)稀释并用NaHCO3(2×50毫升)、盐水(50毫升)洗涤并浓缩。标题化合物通过快速色谱(硅胶，5％MeOH/DCM)纯化以得到650毫克(78％)白色固体。质谱(ESI，m/z)C34H50N6O3Si计算值619.4(M+H)，实测值619.3。
b)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吗啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺三氟乙酸盐 向4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-吗啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺(650毫克，1.05毫摩尔)(如前面步骤制备)在10毫升DCM的溶液中加入0.3毫升EtOH和3.0毫升TFA，并将反应在25℃进行2小时。反应使用10毫升EtOH稀释并浓缩。标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化9分钟以得到600毫克(80％)白色固体。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.18(d，1H)，8.04(s，1H)，7.24(dd，1H)，7.14＜d，1H)，5.84(m，1H)，3.84(m，4H)，3.76(m，2H)，3.50(m，2H)，3.30-3.10(m，4H)，2.92(m，5H)，2.30(m，4H)，2.20-2.00(m，4H)，1.90-1.74(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C28H36N6O2计算值489.2，实测值489.2。
实施例35 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺
a)三氟甲磺酸3，6-二氢-2H-噻喃-4-基酯
在-78℃和氩气气氛下将四氢-噻喃-4-酮(1.00克，8.61毫摩尔)在10毫升THF中的溶液加入到LDA(2.0M，4.52毫升，9.04毫摩尔)在20毫升THF的溶液中。将溶液加热至室温并搅拌0.5小时，然后再次冷却到-78℃。加入N-苯基三氟甲磺酰亚胺(3.42克，9.47毫摩尔)在10毫升THF中的溶液。将所得混合物加热至室温并在氩气气氛下搅拌0.5小时。用200毫升EtOAc处理，所得混合物用H2O(3×50毫升)、盐水(50毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(己烷-3％EtOAc/己烷)进行快速色谱，以无色油状物得到810毫克(38％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ6.01(m，1H)，3.30(m，2H)，2.86(dd，2H，J＝5.7，5.7Hz)，2.58-2.64(m，2H)。质谱(ESI，m/z)C6H7F3O3S2计算值249.0(M+H)，实测值249.3。
b)4-(4-硝基-苯基)-3，6-二氢-2H-噻喃
向4-硝基苯基硼酸(418毫克，2.50毫摩尔)、三氟-甲磺酸3，6-二氢-2H-噻喃-4-基酯(如前面步骤制备，931毫克，3.75毫摩尔)、Pd(PPh3)4(433毫克，0.375毫摩尔)和氯化锂(LiCl)(212毫克，5.0毫摩尔)在20毫升1，4-二氧杂环己烷的混合物中加入2.0M Na2CO3水溶液(3.13毫升，6.25毫摩尔)。将所得混合物在80℃搅拌2小时然后冷却至室温。使用200毫升EtOAc处理，所得混合物用H2O(2×30毫升)、盐水(30毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(1-3％EtOAc/己烷)进行快速色谱，以浅褐色油状物得到470毫克(85％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.19(d，2H，J＝9.1Hz)，7.48(d，2H，J＝9.1Hz)，6.36(m，1H)，3.39(m，2H)，2.91(t，2H，J＝5.7Hz)，2.72(m，2H)。质谱(ESI，m/z)C11H11NO2S计算值222.1(M+H)，实测值222.3。
c)4-(4-硝基-苯基)-3，6-二氢-2H-噻喃1，1-二氧化物
在-78℃和氩气气氛下将3-氯过氧苯甲酸(1.04克，4.62毫升，77％)在15毫升二氯甲烷(DCM)中的溶液缓慢加入到4-(4-硝基-苯基)-3，6-二氢-2H-噻喃(如前面步骤制备，465毫克，2.10毫摩尔)在15毫升DCM的溶液中。混合物在-78℃搅拌0.5小时，然后加热至室温。用100毫升EtOAc处理，混合物用10％Na2SO3(2×15毫升)、饱和NaHCO3水溶液(20毫升)、H2O(20毫升)、盐水(20毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(2-5％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以白色固体得到518毫克(97％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.23(d，2H，J＝9.0Hz)，7.52(d，2H，J＝9.0Hz)，6.04(m，1H)，3.86(m，2H)，3.26-3.31(m，2H)，3.18-3.23(m，2H)。
d)4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯胺
4-(4-硝基-苯基)-3，6-二氢-2H-噻喃1，1-二氧化物(如前面步骤制备，502毫克，1.98毫摩尔)和10％Pd/C(250毫克，50重量％)在15毫升MeOH中的混合物在室温下在氢气气氛(气球压力)下搅拌2小时。通过在硅藻土上过滤除去Pd催化剂，并将滤液浓缩以略微黄色的固体得到314毫克(70％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ7.03(d，2H，J＝8.3Hz)，6.67(d，2H，J＝8.3Hz)，3.51-3.79(br s，2H)，3.11-3.17(m，4H)，2.70(dddd，1H，J＝12.3，12.3，2.9，2.9Hz)，2.31-2.43(m，2H)，2.15-2.23(m，2H)。
e)2-溴-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯胺
在0℃，在氩气气氛下向4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯胺(如前面步骤制备，174毫克，0.77毫摩尔)在20毫升3∶1DCM/甲醇的悬浮液中加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(137毫克，0.77毫摩尔)在5毫升DCM中的溶液。将混合物加热至室温并在氩气气氛下搅拌1小时。用100毫升EtOAc处理，混合物用H2O(2×20毫升)、盐水(20毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(2-3％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以白色固体得到155毫克(66％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ7.28(d，1H，J＝2.0Hz)，6.97(dd，1H，J＝8.3，2.0Hz)，6.73(d，1H，J＝8.3Hz)，4.07(br s，2H)，3.09-3.14(m，4H)，2.66(dddd，1H，J＝12.1，12.1，3.3，3.3Hz)，2.26-2.39(m，2H)，2.12-2.21(m，2H)。质谱(ESI，m/z)C11H14BrNO2S计算值304.0(M+H)实测值304.1。
f)2-环己-1-烯基-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯胺
向2-溴-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯胺(如前面步骤制备，150毫克，0.493毫摩尔)、环己烯-1-基硼酸(70毫克，0.542毫摩尔)和Pd(PPh3)4(57毫克，0.0493毫摩尔)在5毫升1，4-二氧杂环己烷的溶液中加入2.0M Na2CO3水溶液(2.0毫升，4.0毫摩尔)。所得混合物在氩气气氛下在80℃搅拌8小时，然后冷却至室温。用50毫升EtOAc处理，混合物用H2O(3×15毫升)、盐水(20毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(2-5％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以褐色固体得到130毫克(86％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ6.89(dd，1H，J＝8.4，2.3Hz)，6.84(d，1H，J＝2.3Hz)，6.65(d，1H，J＝8.4Hz)，5.74(m，1H)，3.74(br s，2H)，3.08-3.17(m，4H)，2.66(dddd，1H，J＝12.1，12.1，3.1，3.1Hz)，2.29-2.42(m，2H)，2.13-2.25(m，6H)，1.73-1.81(m，2H)，1.65-1.73(m，2H)。质谱(ESI，m/z)C17H23NO2S计算值306.1(M+H)，实测值306.1。
g)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯基]-酰胺
向2-环己-1-烯基-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯胺(如前面步骤制备，122毫克，0.50毫摩尔)、4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾(如实施例3步骤(d)制备，134毫克，0.44毫摩尔)和溴代三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸酯(PyBroP)(205毫克，0.44毫摩尔)在5毫升DMF的混合物中加入DIEA(209微升，1.20毫摩尔)。所得混合物在氩气气氛下在室温搅拌18小时，然后冷却至室温。用50毫升EtOAc处理，混合物用H2O(3×10毫升)、盐水(10毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(1-3％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以无色油状物得到161毫克(73％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.69(s，1H)，8.29(d，1H，J＝8.4Hz)，7.78(s，1H)，7.14(dd，1H，J＝8.4，2.2Hz)，7.04(d，1H，J＝2.2Hz)，5.95(s，2H)，5.83(m，1H)，3.66(t，2H，J＝8.2Hz)，3.11-3.20(m，4H)，2.77(dddd，1H，J＝12.1，12.1，3.2，3.2Hz)，2.35-2.47(m，2H)，2.17-2.33(m，6H)，1.74-1.89(m，4H)，0.97(t，2H，J＝8.2Hz)，0.00(s，9H)。质谱(ESI，m/z)C28H38N4O4Ssi计算值555.2(M+H)，实测值555.3。
h)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯基]-酰胺
向4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1，1-二氧代-六氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯基]-酰胺(如前面步骤制备，145毫克，0.261毫摩尔)在6毫升DCM的溶液中加入0.20毫升EtOH然后加入2毫升TFA。将所得溶液在室温下搅拌3小时。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(20-25％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以白色固体得到83毫克(90％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ12.34(s，1H)，9.60(s，1H)，8.35(d，1H，J＝8.4Hz)，7.75(s，1H)，7.30(dd，1H，J＝8.4，2.2Hz)，7.08(d，1H，J＝2.2Hz)，5.86(m，1H)，3.11-3.23(m，4H)，2.80(dddd，1H，J＝12.2，12.2，2.8，2.8Hz)，2.40-2.57(m，2H)，2.17-2.35(m，6H)，1.74-1.91(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C22H24N4O3S计算值425.2(M+H)，实测值425.6。
实施例36 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
a)2-(3，6-二氢-2H-噻喃-4-基)-5，5-二甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环己烷
三氟甲磺酸3，6-二氢-2H-噻喃-4-基酯(如实施例35步骤(a)制备，500毫克，2.01毫摩尔)、双(新戊基乙醇酸根合(glycolato)二乙酯)二硼(478毫克，2.11毫摩尔)、Pd(dppf)Cl2(147毫克，0.20毫摩尔)和KOAc(592毫克，6.03毫摩尔)在8毫升1，4-二氧杂环己烷中的混合物在80℃在氩气气氛下搅拌8小时，然后冷却至室温。用50毫升EtOAc处理，混合物用H2O(2×10毫升)、盐水(10毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂然后残余物在硅胶上(0-5％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以无色油状物得到351毫克(82％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ6.62(m，1H)，3.63(s，4H)，3.21(m，2H)，2.68(t，2H，J＝5.8Hz)，2.37(m，2H)，0.96(s，6H)。质谱(ESI，m/z)C10H17BO2S计算值213.1(M+H)，实测值213.1。
b)4-[4-氨基-3-(3，6-二氢-2H-噻喃-4-基)-苯基]-哌啶-1-羧酸叔丁酯
向4-(4-氨基-3-溴-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例13步骤(c)制备，200毫克，0.563毫摩尔)、2-(3，6-二氢-2H-噻喃-4-基)-5，5-二甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环己烷(如前面步骤制备，131毫克，0.619毫摩尔)和Pd(PPh3)4(65毫克，0.056毫摩尔)在5毫升1，4-二氧杂环己烷的混合物中加入2.0M Na2CO3水溶液(2.25毫升，4.5毫摩尔)。所得混合物在氩气气氛下在80℃搅拌7小时，然后冷却至室温。用50毫升EtOAc处理，混合物用H2O(3×15毫升)、盐水(20毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂，然后残余物在硅胶上(15-30％EtOAc/己烷)进行快速色谱，以无色油状物得到141毫克(67％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ6.91(dd，1H，J＝8.2，2.2Hz)，6.81(d，1H，J＝2.2Hz)，6.65(d，1H，J＝8.2Hz)，5.91(m，1H)，4.22(br s，2H)，3.66(br s，2H)，3.29-3.31(m，2H)，2.87(dd，2H，J＝5.7，5.7Hz)，2.77(m，2H)，2.47-2.56(m，3H)，1.78(d，2H，J＝12.6Hz)，1.50-1.63(m，2H)，1.48(s，9H)。质谱(ESI，m/z)C21H30N2O2S计算值375.2(M+H)，实测值375.2。
c)4-[4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-(3，6-二氢-2H-噻喃-4-基)-苯基]-哌啶-1-羧酸叔丁酯
向4-[4-氨基-3-(3，6-二氢-2H-噻喃-4-基)-苯基]-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，45毫克，0.12毫摩尔)、4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾(如实施例3步骤(d)制备，44毫克，0.144毫摩尔)和PyBroP(67毫克，0.144毫摩尔)在2毫升DMF中的溶液的混和物中加入DIEA(42微升，0.24毫摩尔)。所得混合物在氩气气氛下在室温搅拌4小时。用30毫升EtOAc处理，混合物用H2O(3×10毫升)、盐水(10毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂，然后残余物在硅胶上(1-2％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以浅黄色油状物得到64毫克(85％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.51(s，1H)，8.21(d，1H，J＝8.5Hz)，7.78(s，1H)，7.16(dd，1H，J＝8.5，2.1Hz)，7.02(d，1H，J＝2.1Hz)，6.00(m，1H)，5.92(s，2H)，4.25(br s，2H)，3.66(t，2H，J＝8.2)，3.42(m，2H)，2.93(dd，2H，J＝5.7，5.7Hz)，2.79(m，2H)，2.63(dddd，1H，J＝12.3，12.3，3.3，3.3Hz)，2.49-2.56(m，2H)，1.82(d，2H，J＝12.8Hz)，1.56-1.66(m，2H)，1.49(s，9H)，0.97(t，2H，J＝8.2Hz)，0.00(s，9H)。
d)4-[4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基-3-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1δ6-噻喃-4-基)-苯基]-哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-78℃在氩气气氛下，将3-氯过氧苯甲酸(91毫克，0.404毫摩尔，77％)在1毫升DCM的溶液缓慢加入到3毫升DCM中的4-[4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-(3，6-二氢-2H-噻喃-4-基)-苯基]-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，120毫克，0.192毫摩尔)中。所得混合物在-78℃搅拌15分钟，然后加热至室温。用40毫升EtOAc处理，将混合物用15％Na2SO3(5毫升)、饱和NaHCO3水溶液(2×10毫升)、H2O(10毫升)、盐水(10毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂，然后残余物在硅胶上(2-10％EtOAc/DCM)进行快速色谱，以无色油状物得到85毫克(67％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.23(s，1H)，8.03(d，1H，J＝8.3Hz)，7.80(s，1H)，7.21(dd，1H，J＝8.3，2.0Hz)，7.06(d，1H，J＝2.0Hz)，5.93(s，2H)，5.75(t，1H，J＝4.1Hz)，4.25(br s，2H)，3.86(br s，2H)，3.66(t，2H，J＝8.2Hz)，3.29(t，2H，J＝6.3Hz)，3.03(t，2H，J＝5.4Hz)，2.74-2.86(m，2H)，2.64(dddd，1H，J＝12.3，12.3，3.3，3.3Hz)，1.82(d，2H，J＝12.3Hz)，1.55-1.65(m，2H)，1.49(s，9H)，0.98(t，2H，J＝8.2Hz)，0.01(s，9H)。质谱(ESI，m/z)C32H45N5O6SSi计算值656.3(M+H)，实测值656.7。
e)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
向4-[4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯基]-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，81毫克，0.123毫摩尔)在6毫升DCM的溶液中加入0.20毫升EtOH，然后加入2毫升TFA。所得溶液在室温下搅拌3小时。减压下除去溶剂，以白色固体得到64毫克(96％)标题化合物。1H-NMR(CD3OD；400MHz)68.02(s，1H)，7.78(d，1H，J＝8.3Hz)，7.29(dd，1H，J＝8.3，2.0Hz)，7.21(d，1H，J＝2.0Hz)，5.71(t，1H，J＝4.2Hz)，3.83(br s，2H)，3.51(d，2H，J＝12.4Hz)，3.33(t，2H，J＝6.0Hz)，3.15(td，2H，J＝13.1，2.6Hz)，3.01(m，2H)，2.94(dddd，1H，J＝12.2，12.2，3.5，3.5Hz)，2.08(d，2H，J＝12.9Hz)，1.91(m，2H，J＝13.3，13.3，13.3，3.8Hz)。质谱(ESI，m/z)C21H23N5O3S计算值426.2(M+H)，实测值426.2。
实施例37 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-苯基]-酰胺
在室温下向4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-(1，1-二氧代-1，2，3，6-四氢-1λ6-噻喃-4-基)-4-哌啶-4-基-苯基]-酰胺三氟乙酸盐(如实施例36步骤(e)制备，62毫克，0.115毫升)在4毫升1∶1的DCM/DMF的悬浮液中加入DIEA(60微升，0.345毫摩尔)。将混合物搅拌5分钟，然后向混合物中缓慢加入乙酸酐(11微升，0.121毫摩尔)，并将所得混合物在室温下搅拌0.5小时。用40毫升EtOAc处理，混合物用H2O(2×20毫升)洗涤。水层用EtOAc(4×10毫升)萃取。合并的有机层真空浓缩。残余物在硅胶(1-4％MeOH/DCM)上快速色谱纯化，以白色固体得到50.9毫克(95％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ13.0(s，1H)，9.10(s，1H)，8.13(d，1H，J＝8.4Hz)，7.77(d，1H，J＝2.3Hz)，7.26(dd，1H，J＝8.4，2.0Hz)，7.08(d，1H，J＝2.0Hz)，5.77(t，1H，J＝4.3Hz)，4.84(dt，1H，J＝13.3，2.1Hz)，4.00(dt，1H，J＝13.3，2.1Hz)，3.89(br s，2H)，3.31(t，2H，J＝6.2Hz)，3.23(td，1H，J＝13.2，2.5Hz)，3.02(m，2H)，2.77(dddd，1H，J＝11.9，11.9，3.4，3.4Hz)，2.68(ddd，1H，J＝12.6，12.6，2.9Hz)，2.18(s，3H)，1.70-1.97(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C23H25N5O4S计算值468.2(M+H)，实测值468.1。
实施例38 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-二甲氨基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例14步骤(b)制备，655毫克，1.30毫升)在DCM(15毫升)的混合物冷却至0℃并加入DIEA(0.92毫升，5.2毫摩尔)。然后在10分钟内分批加入二甲氨基乙酰基氯盐酸盐(211毫克，1.3摩尔)。反应混合物在0℃搅拌30分钟，加热至室温并搅拌2小时。真空除去溶剂并将所得残余物在盐水和DCM之间分配。分离有机层、干燥(Na2SO4)并浓缩。所得残余物在二氧化硅(5％MeOHDCM)上纯化，以白色固体得到432毫克(70％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.49(s，1H)，8.24(d，1H，J＝2.3Hz)，7.70(s，1H)，7.12(dd，1H，J＝8.4，2.1Hz)，7.01＜s，1H)，5.82(m，1H)，4.75(d，1H，J＝13.4Hz)，4.13(d，1H，J＝13.4Hz)，3.57(d，1H，J＝14.2Hz)，3.18(d，1H，J＝14.2Hz)，3.12(td，1H，J＝13.3，2.4Hz)，2.73(dddd，1H，J＝11.9，11.9，3.8，3.8Hz)，2.65(ddd，1H，J＝13.3，13.3，2.4Hz)，2.40(s，6H)，2.18-2.32(m，4H)，1.60-1.98(m，8H)。质谱(ESI，m/z)C26H32N6O2计算值461.3(M+H)，实测值461.2。
实施例38b 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲氨基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
实施例38a的HPLC纯化还得到少量4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲氨基-乙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.02(d，1H，J＝8.4Hz)，7.92(s，1H)，7.07(dd，1H，J＝8.4Hz，J＝2.4Hz)，6.98(d，1H，J＝2.4Hz)，5.73-5.68(m，1H)，4.60-4.51(m，1H)，3.76-3.68(m，1H)，3.20-3.11(m，1H)，2.81-2.70(m，2H)，2.67(s，3H)，2.22-2.13(m，4H)，1.88-1.66(m，6H)，1.66-1.46(m，2H)。质谱(ESI，m/z)C25H30N6O2计算值447.2(M+H)，实测值447.3。
实施例39 4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺
a)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
在0℃向4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例14步骤(a)备，81毫克，0.123毫摩尔)在18毫升DCM的溶液中加入1毫升EtOH然后加入5毫升TFA。所得溶液在室温搅拌0.5小时，先后使用20毫升EtOH、20毫升正丙醇和5毫升H2O处理，然后将混合物减压浓缩以得到略微黄色的固体。化合物在硅胶(2-4％MeOH/DCM)上的快速色谱以白色固体得到0.87克(85％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.70(s，1H)，9.66(br s，1H)，9.15(br s，1H)，8.29(d，1H，J＝8.3Hz)，7.78(s，1H)，7.13(dd，1H，J＝8.3，2.2Hz)，7.03(d，1H，J＝2.2Hz)，5.95(s，2H)，5.83(m，1H)，3.66(t，2H，J＝8.4Hz)，3.55(d，2H，J＝12.3Hz)，2.95-3.11(m，2H)，2.76(m，1H)，2.18-2.33(m，4H)，1.99-2.15(m，4H)，1.82(m，4H)，0.97(t，2H，J＝8.3Hz)，0.00(s，9H)。质谱(ESI，m/z)C28H39N5O2Si计算值506.3(M+H)，实测值506.1。
b)4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺
在-78℃在氩气气氛下将4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如前面步骤制备，116毫克，0.192毫摩尔)和DIEA(134微升，0.770毫摩尔)在4毫升DCM中的溶液缓慢加入到三光气(23毫克，0.0768毫摩尔)在4毫升DCM的溶液中。混合物在-78℃搅拌15分钟，加热至室温并搅拌15分钟，并再次冷却到-78℃。加入2-氨基-乙醇(350微升，5.77毫摩尔)在4毫升THF中的悬浮液，并将所得混合物加热至室温并在氮气气氛下搅拌20小时。用100毫升EtOAc处理，混合物用H2O(3×15毫升)、盐水(20毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。真空除去溶剂，残余物在硅胶上(10％EtOAc/DCM然后是5％MeOH/DCM)快速色谱纯化，以无色油状物得到95毫克(83％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.68(s，1H)，8.25(d，1H，J＝8.4Hz)，7.77(s，1H)，7.12(dd，1H，J＝8.4，2.2Hz)，7.01(d，1H，J＝2.2Hz)，5.94(s，2H)，5.83(m，1H)，4.96(t，1H，J＝5.6Hz)，4.11(d，2H，J＝13.3Hz)，3.75(ddd，2H，J＝4.4Hz)，3.66(t，2H，J＝8.3Hz)，3.44(ddd，2H，J＝5.0Hz)，3.36(t，1H，J＝4.6Hz)，2.91(ddd，2H，J＝13.0，2.2Hz)，2.66(dddd，1H，J＝12.2，12.2，3.3，3.3Hz)，2.18-2.33(m，4H)，1.75-1.91(m，6H)，1.67(dddd，2H，J＝12.9，12.9，12.9，4.0Hz)，0.97(t，2H，J＝8.3Hz)，0.00(s，9H)。质谱(ESI，m/z)C31H44N6O4Si计算值593.3(M+H)，实测值593.1。
c)4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺
向4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺(如前面步骤制备，95毫克，0.16毫摩尔)在3毫升DCM的溶液中加入0.10毫升EtOH然后加入1.0毫升TFA。所得溶液在室温下搅拌6小时。减压除去溶剂，残余物在硅胶(2-8％MeOH/DCM)上快速色谱纯化，以白色固体得到68毫克(92％)标题化合物。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.09(d，1H，J＝8.4Hz)，8.00(s，1H)，7.15(dd，1H，J＝8.4，2.2Hz)，5.79(m，1H)，4.15(dd，2H，J＝13.3，1.1Hz)，3.61(t，2H，J＝5.9Hz)，3.27-3.32(m，2H)，2.90(ddd，2H，J＝13.0，13.0，2.5Hz)，2.73(dddd，1H，J＝12.1，12.1，2.6，2.6Hz)，2.26(m，4H)，1.73-1.88(m，6H)，1.62(dddd，2H，J＝12.6，12.6，12.6，4.0Hz)。质谱(ESI，m/z)C25H30N6O3计算值463.2(M+H)，实测值463.2。
实施例40 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲磺酰基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
a)甲磺酸2-甲磺酰基-乙酯
在0℃和氩气气氛下向甲磺酰氯(484毫克，4.23毫摩尔)在15毫升DCM的溶液中加入2-甲磺酰基-乙醇(500毫克，4.03毫摩尔)在10毫升DCM的溶液，然后加入DIEA(1.05毫升，6.05毫摩尔)。将混合物加热至室温并在氩气气氛下搅拌20小时。混合物用100毫升EtOAc处理，并用H2O(3×20毫升)、盐水(20毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。真空除去溶剂以褐色油状物得到534毫克(66％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ4.67(d，2H，J＝5.5Hz)，3.46(d，2H，J＝5.5Hz)，3.11(s，3H)，3.04(s，3H)。
b)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(2-甲磺酰基-乙基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
在室温下向4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例14步骤(b)制备，85毫克，0.174毫摩尔)和DIEA(91微升，0.521毫摩尔)在3毫升DCM的溶液中加入2-甲磺酸2-甲磺酰基-乙酯(如前面步骤制备，42毫克，0.208毫摩尔)。所得混合物在室温搅拌3小时。用50毫升EtOAc处理，混合物用H2O(2×20毫升)、盐水(10毫升)洗涤并干燥(Na2SO4)。真空除去溶剂，然后残余物在硅胶(1-3％MeOH/DCM)上快速色谱纯化，以白色固体得到54毫克(65％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.54(s，1H)，8.25(d，1H，J＝8.4Hz)，7.72(s，1H)，7.15(dd，1H，J＝8.4，2.0Hz)，7.04(d，1H，J＝2.0Hz)，5.85(m，1H)，3.21(t，1H，J＝6.5Hz)，3.09(s，3H)，3.02-3.11(m，2H)，2.92(t，2H，J＝6.5Hz)，2.52(dddd，1H，J＝12.1，12.1，3.3，3.3Hz)，2.18-2.34(m，4H)，2.18(t，2H，J＝10.8Hz)，1.64-1.94(m，8H)。质谱(ESI，m/z)C25H31N5O3S计算值482.2(M+H)，实测值482.2。根据所示实施例已经制备了以下化合物 质谱 实施例结构[M+H]+ 实测值 分子式 实施例方法 计算值 41

497.2 497.2 C28H28N6O3 29 42

497.2 497.3 C28H28N6O3 29 实施例43 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(吡啶-3-羰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例14步骤(b)制备，75.0毫克，0.15毫摩尔)在CH2Cl2(10毫升)的溶液用Et3N(64.1微升，0.46毫摩尔)处理并冷却至0℃。混合物用烟酰氯盐酸盐(0.030克，0.17毫摩尔)处理并在0℃搅拌15分钟，然后在室温下搅拌17小时。反应混合物直接吸附在硅胶上。硅胶色谱分离(EtOAc中10％MeOH)以白色固体得到标题化合物(61.0毫克，83％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.51(br s，1H)，8.77(s，1H)，8.70-8.66(m，1H)，8.32(d，1H，/＝8.4 Hz)，7.86-7.8 1(m，1H)，7.70(s，1H)，7.42-7.37(m，1H)，7.17(d，1H，J＝8.4Hz)，7.06-7.04(m，1H)，5.87-5.82(m，1H)，4.98-4.87(m，1H)，3.94-3.84(m，1H)，3.29-3.18(m，1H)，2.98-2.86(m，1H)，2.86-2.76(m，1H)，2.34-2.20(m，4H)，1.94-1.72(m，9H)。LC-MS(ESI，m/z)C28H28N6O2计算值481.2(M+H)，实测值481.3。
实施例44 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-{1-[2-(2-羟基乙氨基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
a)[2-(4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-基)-2-氧代-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
N-BOC-甘氨酸(0.29克，1.63毫摩尔)在CH2Cl2(10毫升)中的溶液使用DIEA(0.85毫升，4.90毫摩尔)、HOBt(0.26克，1.96毫摩尔)和EDCI(0.38克，1.96毫摩尔)处理。将混合物在室温下搅拌10分钟并加入到4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例14步骤(b)制备，0.80克，1.63毫摩尔)于CH2Cl2(20毫升)中的溶液中。溶液在室温下搅拌17小时。真空蒸发溶剂。硅胶色谱分离(己烷中50％EtOAc)以白色固体得到标题化合物(0.41克，47％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.53(s，1H)，8.26(d，1H，J＝8.4Hz)，7.80-7.78(m，1H)，7.71(s，1H)，7.45-7.43(m，1H)，7.06(d，1H，J＝8.4Hz)，7.00(s，1H)，5.83(br s，
PdCl2dppf(0.16克，0.22毫摩尔)、KOAc(2.18克，22.2毫摩尔)、4，4，5，5，4′，4′，5′，5′-八甲基-[2，2′]双[[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷](2.07克，8.13毫摩尔)和dppf(0.12克，0.22毫摩尔)放入圆底烧瓶中，并使用氩气充满烧瓶。5-三氟甲磺酰氧基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，2.45克，7.40毫摩尔)在二氧杂环己烷(70毫升)中的脱气溶液加入到烧瓶并加热到80℃16小时。混合物通过玻璃抽气漏斗以除去固体KOAc，并将滤液真空浓缩。硅胶色谱分离(己烷中5％EtOAc)以无色油状物得到标题化合物(1.62克，71％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ6.69-6.60(m，1H)，3.98(br s，2H)，3.49-3.42(m，2H)，2.24-2.16(m，2H)，1.47(s，9H)，1.27(s，12H)。LC-MS(ESI，m/z)C18H28BNO4计算值310.2(M+H)，实测值311.0。
c)4-(4-硝基-苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯
使用4-硝基苯基硼酸(167毫克，1.00毫摩尔)和4-三氟甲磺酰氧基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例13步骤(a)制备，295毫克，1.00毫摩尔)通过实施例35步骤(b)的Suzuki偶联方法制备标题化合物。硅胶色谱分离(己烷中10％EtOAc)以油状物得到标题化合物(273毫克，90％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.19(d，2H，J＝8.8Hz)，7.50(d，2H，J＝8.8Hz)，6.23(m，1H)，4.12(m，2H)，3.66(m，2H)，2.54(m，2H)，1.49(s，9H)。
d)1-[4-(4-氨基-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮 5.76(br s，1H)，4.78-4.68(m，1H)，3.96-3.85(m，2H)，3.17-3.03(m，1H)，2.78-2.63(m，2H)，2.29(br s，2H)，2.22(br s，2H)，1.95-1.87(m，2H)，1.86-1.72(m，4H)，1.70-1.55(m，2H)，1.44(s，9H)。LC-MS(ESI，m/z)C29H36N6O4计算值533.3(M+H)，实测值532.9。
b)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(2-氨基-乙酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
[2-(4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-基)-2-氧代-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(如前面步骤制备，0.41克，0.77毫摩尔)在CH2Cl2(20毫升)的溶液使用EtOH(0.2毫升)和TFA(6毫升)处理。混合物在室温下搅拌45分钟，并将溶剂真空蒸发。粗原料直接用于下一步。LC-MS(ESI，m/z)C24H28N6O2计算值433.2(M+H)，实测值433.2。
c)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-{1-[2-(2-羟基-乙氨基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(2-氨基-乙酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基]-酰胺三氟乙酸盐(如前面步骤制备，0.42克，0.77毫摩尔)在CH2Cl2(20毫升)中的溶液使用Na(OAc)3BH(0.33克，1.54毫摩尔)和固体乙二醛(44.6毫克，0.77毫摩尔)处理。混合物在室温下搅拌1小时，并将溶剂真空蒸发。残余物吸收在甲醇中并滤出固体，并将滤液真空浓缩。反相HPLC(C-18柱)(具有0.1％TFA的水中20-60％乙腈，30分钟)以白色固体得到标题化合物(83毫克，两步内19％)。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.16-8.09(m，1H)，8.05-8.01(m，1H)，7.22-7.15(m，1H)，7.11-7.06(m，1H)，5.84-5.79(m，1H)，4.72-4.62(m，1H)，4.24-3.91(m，2H)，3.89-3.80(m，2H)，3.28-3.18(m，2H)，2.92-2.79(m，2H)，2.28(br s，4H)，1.98-1.89(m，2H)，1.89-1.76(m，4H)，1.76-1.57(m，2H)。LC-MS(ESI，m/z)C26H32N6O3计算值477.2(M+H)，实测值477.2。
实施例45 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-{1-[2-(2-羟基-乙基)-甲基-氨基-乙酰基]-哌啶-4-基}-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-{1-[2-(2-羟基-乙氨基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例44步骤(c)制备，50.0，毫克，0.085毫摩尔)在MeOH(3毫升)中的溶液使用Na(OAc)3BH(39.5毫克，0.19毫摩尔)和37％甲醛溶液(8.2微升，0.10毫摩尔)处理。混合物在室温下搅拌5.5小时，并且真空除去溶剂。反相HPLC(C-18柱)(具有0.1％TFA的水中10-50％乙腈，30分钟)以白色固体得到标题化合物(19.5毫克，47％)。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.12(d，1H，J＝8.4Hz)，8.02(s，1H)，7.19(dd，1H，/＝8.4，2.0Hz)，7.09(d，1H，J＝2.0Hz)，5.84-5.79(m，1H)，4.72-4.64(m，1H)，4.39-4.23(m，2H)，3.84-3.79(m，1H)，3.31-3.21(m，1H)，3.03-2.94(m，6H)，2.92-2.80(m，2H)，2.32-2.24(m，4H)，2.00-1.90(m，2H)，1.90-1.76(m，5H)，1.78-1.59(m，2H)。LC-MS(ESI，m/z)C27H34N6O3计算值491.3(M+H)，实测值491.2。
实施例46 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-(1，2，5，6-四氢-吡啶-3-基)-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
a)5-三氟甲磺酰氧基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯
在氩气气氛下将LDA(23.4毫升，35.1毫升，环己烯中1.5M)于THF(50毫升)中的溶液冷却至-78℃。将该溶液使用3-氧代-哌啶-1-羧酸叔丁酯(5.00克，25.1毫摩尔)于THF(15毫升)中的溶液逐滴加入并搅拌15分钟。混合物使用1，1，1-三氟-N-苯基-N-[(三氟甲基)磺酰基]甲磺酰亚胺(12.5克，35.1毫摩尔)于THF(40毫升)中的溶液处理。将混合物冷却至室温并搅拌2.5小时。将反应使用NaHCO3饱和水溶液淬灭，使用Et2O稀释并使用水洗涤。有机层在MgSO4中干燥，并在真空中进行浓缩。硅胶色谱分离(己烷中5％EtOAc)以无色油状物得到标题化合物(2.45克，30％)。1H-NMR (CDCl3；400MHz)δ5.97-5.89(m，1H)，4.09-4.01(m，2H)，3.54-3.45(m，2H)，2.36-2.26(m，2H)，1.48(s，9H)。LC-MS(ESI，m/z)C11H16F3NO5S计算值332.1(M+H)，实测值332.1。
b)5-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环己烷-2-基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羰酸叔丁酯
4-(4-硝基-苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，304毫克，1.00毫摩尔)在1∶1的DCM/TFA混合物(10毫升)中的溶液在室温下搅拌3小时并浓缩。残余物真空干燥整夜，在CH2Cl2(10毫升)中吸收并冷却到0℃。向此溶液中滴加Et3N(280微升，2毫摩尔)，然后滴加乙酸酐(102微升，1毫摩尔)。所得混合物在0℃搅拌1小时并加热至室温。将所得混合物用盐水洗涤，并将有机层分离、干燥并浓缩。使用类似于实施例4步骤(d)的方法将所得产物还原成标题化合物(143毫克，65％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ6.97(d，2H，J＝8.4Hz)，6.64(d，2H，J＝8.4Hz)，4.75(m，1H)，3.93(m，1H)，3.13(m，3H)，2.66(m，2H)，2.12(s，3H)，1.84(m，2H)，1.57(m，2H)。
e)1-[4-(4-氨基-3-溴-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮
1-[4-(4-氨基-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮(如前面步骤制备，0.36克，1.66毫摩尔)在CH2Cl2(10毫升)中的溶液冷却至-78℃并使用NBS(0.28克，1.58毫摩尔)在CH2Cl2(4毫升)中的悬浮液处理。将反应加热至室温并搅拌30分钟。反应使用CH2Cl2稀释并使用NaHCO3饱和水溶液洗涤。有机相在MgSO4中干燥，并在真空中进行浓缩。原料直接用于下一反应。LC-MS(ESI，m/z)C13H17BrN2O计算值297.1(M+H)，实测值297.1。
f)5-[5-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-氨基-苯基]-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯
5-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例46步骤(b)制备，0.62克，2.02毫摩尔)和1-[4-(4-氨基-3-溴-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮(如前面步骤制备，0.20克，0.67毫摩尔)在甲苯∶EtOH(2∶1，9毫升)中的溶液使用2.0M Na2CO3水溶液(2.7毫升，5.38毫摩尔)处理并在氩气气氛下使用超声脱气。混和物加热至80℃，使用Pd(PPh3)4(54毫克，0.05毫摩尔)处理并在80℃搅拌4.5小时。将反应冷却至室温，用EtOAc稀释，并使用NaHCO3饱和水溶液洗涤。有机层使用MgSO4干燥并真空浓缩，以灰白色固体得到标题化合物(0.25克，93％)。LC-MS(ESI，m/z)C23H33N3O3计算值422.2(M+Na)，实测值422.0。
g)5-(5-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯
5-[5-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-氨基-苯基]-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，0.25克，0.63毫摩尔)在CH2Cl2中的溶液使用PyBroP(0.44克，0.94毫摩尔)和4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(如实施例3步骤(d)制备，0.21克，0.69毫摩尔)处理。所得悬浮液冷却至0℃并使用DIEA(0.33毫升，1.88毫摩尔)处理。除去冰浴并将混合物在室温下搅拌18小时。反应使用CH2Cl2稀释并使用NaHCO3饱和水溶液洗涤。有机层使用MgSO4干燥并真空浓缩。硅胶色谱分离(己烷中25-45％EtOAc，然后100％EtOAc)以白色固体得到标题化合物(399毫克，98％)。LC-MS(ESI，m/z)C34H48N6O5Si计算值649.4(M+H)，实测值649.9。
h)4-氰基-1H-咪唑-1-羧酸[4-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-(1，2，5，6-四氢-吡啶-3-基)-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
5-(5-(1-乙酰基-哌啶-4-基)-2-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，0.40克，0.61毫摩尔)在CH2Cl2(20毫升)和EtOH(0.4毫升)中的溶液使用TFA(3毫升)处理。在室温下搅拌该溶液30分钟。真空蒸发溶剂，并且残余物立即在EtOH(25毫升)吸收并且在5℃储存11小时。溶液在真空浓缩，并且残余物在CH2Cl2(20毫升)和EtOH(0.4毫升)中吸收，然后使用TFA(6毫升)处理。反应在室温下搅拌2小时，并真空蒸发溶剂。反相HPLC(C-18柱)(具有0.1％TFA的水中10-80％乙腈，30分钟)以白色固体得到标题化合物(56.9毫克，22％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ8.06(s，1H)，7.81(d，1H，/＝8.4Hz)，7.32(d，1H，J＝8.4Hz)，7.22(s，1H)，6.10-6.03(m，1H)，4.74-4.64(m，2H)，4.11-4.02(m，1H)，3.95(s，2H)，3.50-3.37(m，2H)，3.29-3.20(m，1H)，2.93-2.82(m，1H)，2.80-2.69(m，1H)，2.62-2.53(m，2H)，2.16(s，3H)，1.98-1.84(m，2H)，1.78-1.54(m，2H)。LC-MS(ESI，m/z)C23H26N6O2计算值419.2(M+H)，实测值419.2。
实施例47 (4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-基)-乙酸三氟乙酸盐
向烧瓶中加入4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺TFA盐(33毫克，0.067毫摩尔)(如实施例14步骤(b)制备)、溴乙酸叔丁酯(10微升，0.067毫摩尔)、NEt3(20微升，0.135毫摩尔)和0.25毫升DCM并在25℃搅拌10小时。将反应混合物加载在5克SPE柱(二氧化硅)上，并且23毫克(70％)(4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-基)-乙酸叔丁酯使用25％EtOAc/DCM洗脱。将该化合物溶于1毫升DCM并且加入20微升EtOH和1毫升TFA，并将反应在25℃搅拌3小时。标题化合物通过使用0.1％TFA/H2O中30-50％CH3CN洗脱的RP-HPLC(C18)纯化12分钟以得到10毫克(40％)白色固体。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.16(d，1H)，8.02(s，1H)，7.22(dd，1H)，7.10(d，1H)，5.72(m，1H)，4.04.(s，2H)，3.76(m，2H)，3.22(m，2H)，2.90(m，1H)，2.29(m，4H)，2.10(m，4H)，1.82(m，4H)。质谱(ESI，m/z)C24H27N5O3计算值434.2(M+H)，实测值434.2。
实施例48 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(3-氨基-3-甲基-丁酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
a)[3-(4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-基)-1，1-二甲基-3-氧代-丙基]-氨基甲酸叔丁酯
向4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例14步骤(b)制备，40.0毫克，0.0818毫摩尔)、3-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸(J.Med.Chem.，34(2)，633-642，(1991)，21.4毫克，0.0981毫摩尔)和PyBroP(55.0毫克，0.0981毫摩尔)在二氯甲烷(2毫升)的溶液中加入DIEA(43微升，0.25毫摩尔)并将所得混合物在氩气气氛下室温搅拌1天。混合物使用EtOAc(30毫升)稀释并使用H2O(2×10毫升)、盐水(10毫升)洗涤，使用Na2SO4干燥并且然后真空浓缩。残余物通过快速色谱纯化(硅胶，10-40％EtOAc/己烷)，以无色油状物得到33.0毫克(70％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C32H42N6O4计算值575.3(M+H)，实测值574.8。
b)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(3-氨基-3-甲基-丁酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
在0℃向[3-(4-{4-[(4-氰基-1H-咪唑-2-羰基)-氨基]-3-环己-1-烯基-苯基}-哌啶-1-基)-1，1-二甲基-3-氧代-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(33.0毫克，0.0574毫摩尔)(如前面步骤制备)在3毫升DCM和0.10毫升EtOH的溶液中加入1.0毫升TFA，将混合物加热至室温并搅拌3小时。混合物用3毫升正丙醇稀释然后真空浓缩。残余物通过快速色谱纯化(硅胶，3-8％MeOH/DCM)，以白色固体得到33.5毫克(99％)标题化合物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ13.3(s，1H)，9.52(s，1H)，8.57(br s，3H)，8.26(d，1H，J＝8.6Hz)，7.69(s，1H)，7.02(dd，1H，J＝8.6，1.7Hz)，6.98(d，1H，J＝1.7Hz)，5.78(m，1H)，4.67(br d，1H，J＝13.4Hz)，3.88(br d，1H，J＝13.4Hz)，3.10(m，1H)，2.55-2.85(m，4H)，2.23(m，4H)，1.72-2.01(m，8H)，1.50(s，6H)。质谱(ESI，m/z)C27H34N6O2计算值475.3(M+H)，实测值475.1。
实施例49 4H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺双三氟乙酸盐
a)1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸甲酯
在0℃向NaH(60％分散体)(200毫克，5.00毫摩尔)在DMF(5毫升)的悬浮液中滴加甲基-1H-1，2，4-三唑羧酸酯(635毫克，5.00毫摩尔)在DMF(5毫升)的溶液。所得悬浮液在相同温度下搅拌30分钟并且用SEMCl(0.90毫升，5.0毫摩尔)处理。所得溶液在室温下搅拌30分钟并倒在冰上。产物用醚(3×20毫升)萃取。醚层合并、干燥(Na2SO4)并真空浓缩。所得残余物在二氧化硅(10％EtOAc/己烷)上色谱分离以得到标题化合物(530毫克，41％)。质谱(ESI，m/z)C10H19N3O3Si计算值258.1(M+H)，实测值258.2。
b)4-(3-环己-1-烯基-4-{[1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4-]三唑-3-羰基]-氨基}-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯
1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸甲酯(如前面步骤制备，257毫克，1.00毫摩尔)在EtOH(2毫升)的溶液中加入2N KOH(0.5毫升，1毫摩尔)。所得溶液在室温下搅拌20分钟并真空浓缩。所得残余物悬浮在醚中(10毫升)并超声处理5分钟。然后真空除去醚，并将所得残余物干燥4小时以得到1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸钾盐(273毫克，97％)，其无须进一步纯化直接用于下一步中。
1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸钾盐(如前面步骤制备，28毫克，0.10毫摩尔)、DIEA(34微升，0.20毫摩尔)、4-(4-氨基-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例14步骤(b)制备，35.6毫克，0.100毫摩尔)和PyBroP(69.9毫克，0.150毫摩尔)在DCM(2毫升)中的混合物在室温搅拌12分钟。反应混合物使用DCM(5毫升)稀释并使用NaHCO3饱和水溶液(10毫升)和水(10毫升)洗涤。有机层分离、干燥(Na2SO4)并真空浓缩。产物在二氧化硅(20-40％EtOAc/己烷)上色谱分离以得到标题化合物(31.9毫克，55％)。质谱(ESL m/z)C31H47N5O4Si计算值481.2(M-BOC+2H)，实测值481.2。
c)4H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺双三氟乙酸盐
向4-(3-环己-1-烯基-4-{[1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4-]三唑-3-羰基]-氨基}-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，81.9毫克，0.140毫摩尔)在DCM(0.4毫升)和EtOH(13微升)的溶液中加入TFA(0.13毫升)。所得溶液在室温下搅拌3小时并真空浓缩。所得残余物真空干燥1小时，悬浮在醚中(10毫升)并超声处理5分钟。形成的固体通过抽滤收集以得到标题化合物(56毫克，68％)。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.53(br s，1H)，8.20(d，1H，J＝8.4Hz)，7.21(dd，1H，J＝8.4，2.1Hz)，7.11(d，1H，J＝2.1Hz)，5.83(br s，1H)，3.45(m，2H)，3.19(m，2H)，2.98(m，1H)，2.28(m，4H)，2.14(m，2H)，和1.95-1.75(m，6H)。质谱(ESI，m/z)C20H25N5O计算值352.4(M+H)，实测值352.2。
实施例50 5-氯-4H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
a)5-氯-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸甲酯
在0℃向NaH(60％分散体，53.9毫克，1.34毫摩尔)在DMF(5毫升)的悬浮液中滴加5-氯-1H-[1，2，4]-三唑-3-羧酸甲酯(Bull.Pharm.Sci.，20(1)47-61，(1997)，218毫克，1.35毫摩尔)在DMF(10毫升)的溶液。所得悬浮液在相同温度下搅拌30分钟并且用SEMCl(0.24毫升，1.4毫摩尔)处理。所得溶液在室温下搅拌30分钟并倒在冰上。混合物用醚(3×20毫升)萃取并将醚层合并、干燥(Na2SO4)并真空浓缩。所得残余物在二氧化硅(10％EtOAc/己烷)上色谱分离以得到标题化合物(227毫克，58％)。质谱(ESI，m/z)C10H18ClN3O3Si计算值292.0和294.0(M+H)，实测值291.5和293.6。
b)4-(4-{[5-氯-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]-三唑-3-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯
向4-(4-{[5-氯-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸甲酯(如前面步骤所制备，227毫克，0.780毫摩尔)在EtOH(2毫升)的溶液中加入2N KOH(0.4毫升，0.8毫摩尔)。所得溶液在室温下搅拌20分钟并真空浓缩。所得残余物悬浮在醚中(10毫升)并超声处理5分钟。然后除去醚，并将所得残余物真空干燥4小时以得到4-(4-{[5-氯-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸钾盐(223毫克，91％)，其无须进一步纯化而直接用于下一步。
4-(4-{[5-氯-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸钾盐(如前面步骤所制备，35毫克，0.10毫摩尔)、DIEA(34微升，0.10毫摩尔)、4-(4-氨基-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如实施例14步骤(b)制备，35.6毫克，0.100毫摩尔)和PyBroP(69.9毫克，0.150毫摩尔)在DCM(2毫升)中的混合物在室温下搅拌12小时。反应混合物使用DCM(5毫升)稀释并使用NaHCO3饱和水溶液(10毫升)和水(10毫升)洗涤。有机层分离、干燥(Na2SO4)并真空浓缩。产物在二氧化硅(20-40％EtOAc/己烷)上色谱分离以得到标题化合物(52毫克，85％)。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ9.60(s，1H)，8.29(d，1H，J＝8.4Hz)，7.18(dd，1H，J＝8.4，2.2Hz)，7.13(d，1H，J＝2.2Hz)，5.99(s，2H)，5.84(br s，1H)，4.18-4.25(m，2H)，3.72-3.76(m，2H)，2.58-2.67(m，2H)，2.51-2.64(m，1H)，2.18-2.33(m，4H)，1.78-1.92(m，6H)，1.55-1.65(m，2H)，1.49(s，9H)，0.93-0.98(m，2H)，0.10(s，9H)。
c)5-氯-1H-[1，2，4-]-三唑-3-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐
向4-(4-{[5-氯-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-[1，2，4]-三唑-3-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，63.3毫克，0.102毫摩尔)在DCM(0.5毫升)和EtOH(11微升)的溶液中加入TFA(0.1毫升)。将所得混合物在室温下搅拌12小时后，另外加入0.1毫升TFA。反应混合物在室温下另外搅拌5小时，蒸发溶剂，并且标题化合物使用0.1％TFA/H2O中20-70％CH3CN通过RP-HPLC(C18)纯化20分钟以得到标题化合物(30毫克，58％)。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.14(d，1H，J＝8.4Hz)，7.20(dd，1H，J＝8.4，2.1Hz)，7.13(d，1H，J＝2.1Hz)，5.82(br s，1H)，3.45(m，2H)，3.19(m，2H)，2.98(m，1H)，2.28(m，4H)，2.14(m，2H)，和1.95-1.75(m，6H)。质谱(ESI，m/z)C20H24ClN5O计算值386.1和388.1(M+H)，实测值386.2和388.1。
实施例51 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(顺式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐，和 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(反式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐
a)顺式/反式2，6-二甲基-4-氧代-哌啶-1-羧酸叔丁酯
顺式/反式2，6-二甲基哌啶酮(Coll.Czech.Chem.Commun.31(11)，4432-41，(1966)，1.27克，10.0毫摩尔)在醚(100毫升)中的溶液使用1N NaOH(11毫升，11毫摩尔)和(BOC)2O(2.18克，10.0毫摩尔)处理。所得混合物在室温下搅拌48小时。将醚层分离、干燥并浓缩。在二氧化硅(10％EtOAc-己烷)上色谱分离以得到标题化合物(1.10克，50％)。LC-MS(ESI，m/z)C12H21NO3计算值128.1(M-BOC+2H)，实测值128.1。
b)4-(4-氨基-苯基)-顺式/反式2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯
顺式/反式N-Boc-2，6-二甲基哌啶酮(如前面步骤制备，1.14克，5.00毫摩尔)在THF(20毫升)中的溶液冷却至-78℃并且在氩气气氛下使用LDA(环己烯、THF和乙基苯中1.5M溶液，4.4毫升，6.5毫摩尔)处理。所得混合物在相同温度下搅拌30分钟并用THF(20毫升)中的N-苯基三氟甲磺酰亚胺(2.34克，6.55毫摩尔)处理。反应混合物另外搅拌30分钟并加热至室温。室温下30分钟后将反应混合物真空浓缩，并将残余物在醚中(20毫升)吸收并用冷水(2×10毫升)洗涤。醚层干燥(Na2SO4并浓缩以得到顺式/反式2，6-二甲基-4-三氟甲磺酰氧基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(890毫克，49％)，直接用于下一步。
然后根据实施例35的Suzuki偶联方法使用4-氨基苯基硼酸(219毫克，1.00毫摩尔)和顺式/反式-2，6-二甲基-4-三氟甲磺酰氧基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如上制备，321毫克，1.00毫摩尔)制备标题化合物。硅胶色谱分离(10-20％EtOAc/己烷)得到4-(4-氨基-苯基)-2，6-二甲基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(172毫克，57％)。质谱(ESI，m/z)C18H26N2O2计算值303.2(M+H)，实测值303.1。4-(4-氨基-苯基)-2，6-二甲基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(如上制备，380毫克，1.25毫摩尔)在甲醇(10毫升)中的溶液使用10％Pd/C(190毫克)以20psi氢化1小时。溶液通过硅藻土垫过滤并浓缩以得到标题化合物(360毫克，94％)。质谱(ESI，m/z)C18H28N2O2计算值305.2(M+H)，实测值305.6。
c)4-(4-氨基-3-环己-1-烯基-苯基)-顺式/反式2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯
向4-(4-氨基-苯基)-2，6-二甲基哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，334毫克，1.09毫摩尔)在DCM(10毫升)的溶液中加入NBS(195毫克，1.09毫摩尔)并将反应混合物在室温下搅拌12小时。反应混合物使用DCM(10毫升)稀释并使用NaHCO3饱和水溶液(10毫升)和水(10毫升)洗涤。有机层分离、干燥(Na2SO4)并真空浓缩以得到4-(4-氨基-3-溴-苯基)-顺式/反式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯(367毫克，87％)。质谱(ESI，m/z)C18H27BrN2O2计算值327.0和329.0(M-t-Bu+H)，实测值327.0和328.9。
然后根据实施例12步骤(d)的Suzuki偶联方法使用环己-1-烯基硼酸(157毫克，1.25毫摩尔)和4-(4-氨基-3-溴-苯基)-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前所制备，382毫克，1.00毫摩尔)制备标题化合物，并且在二氧化硅(20％EtOAc/己烷)上色谱分离以得到254毫克(66％)。质谱(ESI，m/z)C24H36N2O2计算值384.2(M+H)，实测值385.1。
d)4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-顺式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯和4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-反式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯
4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(如实施例3步骤(d)制备，384毫克，1.00毫摩尔)、DIEA(0.34微升，2.0毫摩尔)、4-(4-氨基-3-环己-1-烯基-苯基)-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备，384毫克，1.00毫摩尔)和PyBroP(699毫克，1.50毫摩尔)在DCM(20毫升)中的混合物在室温下搅拌12小时。反应混合物使用DCM(10毫升)稀释并使用NaHCO3饱和水溶液(10毫升)和水(10毫升)洗涤。有机层分离、干燥(Na2SO4)并真空浓缩以得到上述两种标题化合物的混合物(321毫克，50.7％)。混合物在二氧化硅(10-20％EtOAc/己烷)上色谱分离以得到分离的标题化合物。
4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-反式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯(31毫克)。质谱(ESI，m/z)C35H51N5O4Si计算值634.3(M+H)，实测值634.1。
含有10％的4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-反式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯的4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-顺式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯(290毫克)。质谱(ESI，m/z)C35H51N5O4Si计算值634.3(M+H)，实测值634.1。
e)5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(顺式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐和5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(反式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐
根据实施例14步骤(b)的方法由290毫克(0.457毫摩尔)4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-顺式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯和31毫克(0.048毫摩尔)4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-反式-2，6-二甲基-哌啶-1-羧酸叔丁酯制备标题化合物。
5-氰基-1H-咪唑-1-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(顺式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐(93毫克，32％)1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.17(d，1H，J＝8.4Hz)，8.03(s，1H)，7.22(d，1H，J＝8.4Hz)，7.11(s，1H)，5.72(br s，1H)，3.87(m，1H)，3.78(m，1H)，3.45(m，1H)，3.23(m，1H)，3.07(m，1H)，2.22(m，4H)，2.19(m，2H)，1.75-1.92(m，4H)，1.56(m，3H)，1.37(m，.6H)。质谱(ESI，m/z)C24H29N50计算值404.2(M+H)，实测值404.2。
5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(反式-2，6-二甲基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺双三氟乙酸盐(17.3毫克，56％)1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ13.9(br s，1H)，10.3(br s，1H)，9.98(s，1H)，8.41(d，1H，J＝8.4Hz)，7.75(br s，1H)，7.26(dd，1H，J＝8.4，2.0Hz)，7.15(d，1H，J＝2Hz)，5.92(br s，1H)，4.12(m，1H)，3.59(m，1H)，3.1-3.3(m，4H)，2.25-2.42(m，6H)，2.05-1.78(m，6H)，1.62(d，3H，J＝7.1Hz)，1.43(d，3H，J＝6.3Hz)。质谱(ESI，m/z)C24H29N5O计算值404.2(M+H)，实测值404.2。
实施例52 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(R)-(+)-(2，3-二羟基-丙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
a)5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(R)-(+)2，2-二甲基-[1，3]二氧戊环-4-羰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
向(R)-(+)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸甲酯(0.16毫升，1.0毫摩尔)在MeOH(2毫升)的溶液中加入2N KOH(0.5毫升，1毫摩尔)。所得溶液在室温下搅拌20分钟并真空浓缩。所得残余物悬浮在醚中(10毫升)并超声处理5分钟。然后除去醚并将所得残余物真空干燥4小时以得到(R)-(+)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸钾盐(173毫克，94％)，其无须纯化直接用于下一步。
向4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐(如实施例14步骤(b)制备，40毫克，0.08毫摩尔)在DCM(1.5毫升)的溶液中加入(R)-(+)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸钾盐(如上制备，18毫克，0.090毫摩尔)、EDCI(18.8毫克，0.0900毫摩尔)、HOBt(13.2毫克，0.0900毫摩尔)和DIEA(42微升，0.24毫摩尔)。所得混合物在室温下搅拌6小时。加入水(10毫升)并分离DCM层，干燥(硫酸钠)并浓缩。所得残余物在二氧化硅(2％MeOH/DCM)上色谱分离以得到标题化合物(47毫克，97％)。质谱(ESI，m/z)C28H33N5O4计算值504.2(M+H)，实测值503.9。
b)5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-[1-(R)-(+)-(2，3-二羟基-丙酰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺
向5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{2-环己-1-烯基-4-[1-(R)-2，2-二甲基-[1，3]二氧戊环-4-羰基)-哌啶-4-基]-苯基}-酰胺(如前面步骤制备，45毫克，0.090毫摩尔)在MeOH(1毫升)的溶液中加入2N盐酸(2毫升)。所得混合物在室温下搅拌12小时。真空除去溶剂并将所得残余物干燥4小时。加入醚(10毫升)并超声处理5分钟。真空除去醚并将残余物干燥12小时以得到标题化合物(21.3克，52％)。1H-NMR(DMSO；400MHz)δ14.1(br s，1H)，9.85(s，1H)，8.32(s，1H)，7.92(d，1H，J＝8.4Hz)，7.18(dd，1H，J＝8.4，2.1Hz)，7.13(d，1H，J＝2.1Hz)，5.72(br s，1H)，4.51(m，1H)，4.33(m，1H)，4.15(m，1H)，3.55(m，1H)，3.43(m，1H)，3.08(m，1H)，2.81(m，1H)，2.63(m，1H)，2.12-2.24(m，4H)，1.31-1.38(m，10H)。质谱(ESI，m/z)C25H29N5O4计算值464.2(M+H)，实测值464.1。
实施例53 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
a)4-(1-甲氧基-1，2，3，6-四氢-吡啶-4-基)-苯胺
N-甲氧基哌啶酮(J.Org.Chem.，26，1867，(1961)，650毫克，5.00毫摩尔)在THF(20毫升)中的溶液冷却至-78℃并在氮气气氛下使用LDA(环己烯、THF和乙基苯中1.5M溶液，4.3毫升，6.4毫摩尔)处理。所得混合物在相同温度下搅拌30分钟并使用THF(20毫升)中的N-苯基三氟甲磺酰亚胺(2.3克，6.4毫摩尔)处理。将反应混合物另外搅拌30分钟并加热至室温。在室温下30分钟后，反应混合物真空浓缩并将得到的残余物在EtOAc(20毫升)中吸收并使用冷水(2×10毫升)洗涤。EtOAc层干燥(硫酸钠)并浓缩以白色泡沫得到三氟甲磺酸1-甲氧基-1，2，3，6-四氢-吡啶-4-基酯(980毫克，71％)，其直接用于下一步。
根据实施例35步骤(b)的Suzuki偶联方法使用4-氨基苯基硼酸(219毫克，1.00毫摩尔)和三氟甲磺酸1-甲氧基-1，2，3，6-四氢-吡啶-4-基酯(如上制备，261毫克，1.00毫摩尔)制备标题化合物。硅胶色谱分离(20-50％EtOAc/己烷)得到60毫克(29％)。质谱(ESI，m/z)C12H16NaO计算值205.1(M+H)，实测值205.2。
b)2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯胺
4-(1-甲氧基-1，2，3，6-四氢-吡啶-4-基)-苯胺(如前面步骤制备)(40.8毫克，0.200毫摩尔)在MeOH(5毫升)中的溶液使用10％Pd/C(20.4毫克)以20psi氢化1小时。溶液通过硅藻土垫过滤并浓缩以得到4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯胺(38毫克，92％)，其无须进一步纯化直接用于下一步。
向4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯胺(如上制备，42毫克，0.20毫摩尔)在DCM(2毫升)的溶液中加入NBS(36.2毫克，0.20毫摩尔)并将反应混合物在室温下搅拌12小时。反应混合物使用DCM(10毫升)稀释并使用NaHCO3饱和水溶液(10毫升)和水(10毫升)洗涤。有机层分离、干燥(硫酸钠)并真空浓缩以得到2-溴-4-(1-甲氧基-1，2，3，6-四氢-吡啶-4-基)-苯胺(43毫克，74.5％)，其无须纯化用于下一步。然后根据实施例2，步骤(d)的suzuki偶联方法使用环己-1-烯基硼酸(27.9毫克，1.00毫摩尔)和2-溴-4-(1-甲氧基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯胺(如上制备，44毫克，0.15毫摩尔)制备标题化合物，并且在二氧化硅上经色谱分离(20-50％EtOAc/己烷)得到2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)苯胺(33毫克，74％)。质谱(ESI，m/z)C18H26N2O计算值287.2(M+H)，实测值286.8。
c)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺
4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(如实施例3步骤(d)制备，35.6毫克，0.100毫摩尔)、DIEA(0.34微升，0.20毫摩尔)、2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯胺(如前面步骤制备，28.6毫克，0.1毫摩尔)和PyBroP(69.9毫克，0.150毫摩尔)在DCM(2毫升)中的混合物在室温下搅拌12小时。反应混合物使用DCM(10毫升)稀释并使用NaHCO3饱和水溶液(10毫升)和水(10毫升)洗涤。有机层分离、干燥(硫酸钠)并真空浓缩。产物在二氧化硅(20-40％EtOAc/己烷)上色谱分离得到标题化合物(26毫克，48％)。质谱(ESI，m/z)C29H41N5O3Si计算值536.3(M+H)，实测值536.2。
d)5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺三氟乙酸盐
向4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸[2-环己-1-烯基-4-(1-甲氧基-哌啶-4-基)-苯基]-酰胺(如前面步骤制备，31毫克，0.020毫摩尔)在DCM(0.5毫升)和EtOH(11微升)的溶剂中加入TFA(0.1毫升)。所得溶液在室温下搅拌6小时。反应混合物真空浓缩并将所得残余物干燥1小时，悬浮在醚中(10毫升)并超声处理5分钟。形成的固体通过抽滤收集以得到标题化合物(17.3毫克，58％)。1H-NMR(DMSO；400MHz)δ9.70(s，1H)，8.30(s，1H)，7.83(d，1H，J＝8.4Hz)，7.14(d，1H，J＝8.4Hz)，7.05(s，1H)，5.71(br s，1H)，3.30-3.55(m，5H)，2.41-2.62(m，2H)，2.12-2.19(m，4H)，1.60-1.85(m，8H)。质谱(ESI，m/z)C23H27N5O2计算值406.2(M+H)，实测值406.1。
实施例54 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰酰胺三氟乙酸盐
a)5-硝基-3′，6′-二氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯
202毫克(0.994毫摩尔)2-溴-5-硝基吡啶在4毫升甲苯和2毫升EtOH中的溶液使用338毫克(1.09毫摩尔)4-三氟甲烷-磺酰氧基-3，6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(Synthesis，993，(1991))和1.49毫升(2.981毫摩尔)2M Na2CO3水溶液处理。混合物放置于氩气气氛下通过超声处理脱气、使用80.3毫克(0.00700毫摩尔)Pd(PPh3)4处理并加热到80℃下4小时。混合物使用EtOAc稀释并使用水洗涤。有机层使用硫酸镁干燥并真空浓缩。所得残余物在50-g二氧化硅Varian MegaBond Elut柱上使用10-25％EtOAc-己烷色谱分离，以浅黄色固体得到226毫克(75％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C15H19N3O4计算值306.1(M+H)，实测值305.7。
b)5-氨基-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯
226毫克(0.740毫摩尔)5-硝基-3′，6′-二氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备)在15毫升MeOH中的溶液使用110毫克10％Pd/C(Degussa型ElOl-NE/W，Aldrich，50％重量水)和1大气压氢气在室温下处理18小时。混合物通过硅藻土过滤，并且滤饼使用甲醇洗涤。浓缩，以无色玻璃状固体得到220毫克(107％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C15H23N3O2计算值278.2(M+H)，实测值278.0。
c)5-氨基-6-溴-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯
220毫克(0.793毫摩尔)5-氨基-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备)在10毫升CH2Cl2的溶液使用134毫克(0.753毫摩尔)N-溴琥珀酰亚胺在室温下处理20分钟。混合物使用二氯甲烷稀释并使用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。有机层使用硫酸镁干燥并真空浓缩。残余物在50-g二氧化硅Varian MegaBond Elut柱上使用10-35％EtOAc-己烷色谱分离，以无色玻璃状固体得到209毫克(74％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ6.97(d，1H，J＝8.0Hz)，6.91(d，1H，J＝8.0Hz)，4.28-4.15(br s，2H)，4.06-3.90(m，2H)，2.85-2.75(m，2H)，2.77-2.68(m，1H)，1.92-1.83(m，2H)，1.68-1.54(m，2H)，1.47(s，9H)。
d)5-氨基-6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯
209毫克(0.587毫摩尔)5-氨基-6-溴-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备)在5毫升甲苯和2.5毫升EtOH中的溶液使用99.3毫克(0.645毫摩尔)4，4-二环己-1-烯基硼酸和2.34毫升(4.69毫摩尔)2M Na2CO3水溶液处理。混合物通过放置于氩气气氛下通过超声处理脱气、使用47.4毫克(0.0410毫摩尔)Pd(PPh3)4处理并加热到80℃下16小时。混合物使用EtOAc稀释并使用水洗涤。水层另外使用EtOAc萃取，并将合并的有机层使用硫酸镁干燥并真空浓缩。所得残余物在50-g二氧化硅Varian MegaBond Elut柱上使用25％EtOAc-己烷色谱分离，以白色泡沫状固体得到150毫克(66％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C23H35N3O2计算值386.3(M+H)，实测值386.3。
e)5-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯
150毫克(0.389毫摩尔)5-氨基-6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备)在15毫升CH2Cl2中的溶液使用131毫克(0.428毫摩尔)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(如实施例3步骤(b)制备)、272毫克(0.584毫摩尔)PyBroP和203微升(1.17毫摩尔)DIEA在室温下处理3小时。混合物使用二氯甲烷稀释并使用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。有机层使用硫酸镁干燥并真空浓缩。残余物在50-g二氧化硅VarianMegaBond Elut柱上使用50％EtOAc-己烷色谱分离，以白色固体得到215毫克(87％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C34H50N6O4Si计算值635.4(M+H)，实测值635.3。
f)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐
215毫克(0.339毫摩尔)5-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(如前面步骤制备)在10毫升CH2Cl2中的溶液使用三滴MeOH和3毫升TFA在室温下处理4小时。加入MeOH(10毫升)并且真空蒸发溶剂。残余物在50-g二氧化硅VarianMegaBond Elut柱上使用10％MeOH-CH2Cl2色谱分离，以白色固体得到210毫克(97％)标题化合物。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.59(d，1H，J＝8.4Hz)，8.04(s，1H)，7.28(d，1H，J＝8.4Hz)，6.02-5.93(m，1H)，3.58-3.48(m，2H)，3.32-3.03(m，3H)，2.54-2.42(m，2H)，2.23-2.02(m，6H)，1.11(s，6H)。质谱(ESI，m/z)C23H28N6O计算值405.2(M+H)，实测值405.2。
实施例55 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[1′-(2-二甲氨基-乙酰基)-6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐
20.9毫克(0.203毫摩尔)N，N-二甲基甘氨酸在4毫升CH2Cl2中的悬浮液使用49.8毫克(0.197毫摩尔)双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOP-Cl)和75微升(0.54毫摩尔)Et3N在室温下处理1小时。混合物然后使用70.0毫克(0.135毫摩尔)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐(如实施例54步骤(f)制备)在室温下处理18小时。混合物使用二氯甲烷稀释并用水洗涤。有机层使用硫酸镁干燥并真空浓缩。残余物通过RP-HPLC(C18)使用0.1％TFA/H2O中的10-80％CH3CN纯化30分钟，以白色固体得到34.9毫克(53％)标题化合物。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.38(d，1H，J＝8.4Hz)，8.05(s，1H)，7.33(d，1H，J＝8.4Hz)，6.05-5.98(m，1H)，4.68(d，1H，J＝15.2Hz)，3.82(d，1H，J＝15.2Hz)，3.16-3.05(m，1H)，3.01-2.94(m，6H)，2.52-2.40(m，2H)，2.39(s，6H)，2.17-2.10(m，2H)，2.09-1.87(m，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.12(s，6H)。质谱(ESI，m/z)C27H35N7O2计算值490.3(M+H)，实测值490.4。
实施例56 4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′-(2-甲磺酰基-乙基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐
70.0毫克(0.135毫摩尔)4-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-(4，4-二甲基-环己-1-烯基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺三氟乙酸盐(如实施例54步骤(f)制备)在10毫升CH2Cl2中的溶液使用32.7毫克(0.162毫摩尔)甲磺酸2-甲磺酰基-乙酯(如实施例40步骤(a)制备)70.5微升(0.405毫摩尔)DIEA在室温下处理6小时。混合物使用二氯甲烷稀释并用水洗涤。有机层使用硫酸镁干燥并浓缩。残余物通过RP-HPLC(C18)使用0.1％TFA/H2O中20-60％CH3CN纯化30分钟，以白色固体得到48毫克(85％)标题化合物。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.65(d，1H，J＝8.4Hz)，8.05(s，1H)，7.34(d，1H，J＝8.4Hz)，6.05-5.98(m，1H)，3.85-3.66(m，6H)，3.29-3.21(m，2H)，3.20-3.01(m，1H)，3.14(s，3H)，2.53-2.45(m，2H)，2.30-2.15(m，4H)，2.15-2.10(m，2H)，1.62(t，2H，J＝6.4Hz)，1.11(s，6H)。质谱(ESI，m/z)C26H34N6O3S计算值511.2(M+H)，实测值511.3。
实施例57 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(2-氨基-2-甲基-丙酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺三氟乙酸盐
a){2-[4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-基]-1，1-二甲基-2-氧代-乙基}-氨基甲酸叔丁酯
向4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(231毫克，0.380毫摩尔)(如实施例14步骤(a)制备)在2.5毫升DCM和0.4毫升EtOH的溶液中加入700微升TFA并将溶液在25℃搅拌3小时。反应使用4毫升EtOH稀释然后浓缩，以得到5-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸(2-环己-1-烯基-4-哌啶-4-基-苯基)-酰胺三氟乙酸盐与原材料约2∶1(通过1H-NMR和LC/MS确定)的混合物，其无须进一步纯化用于下一步。3毫升DCM中的混合物加入到2-叔丁氧羰基氨基-2-甲基-丙酸(53毫克，0.70毫摩尔)、DIEA(122微升，0.700毫摩尔)和PyBroP(144毫克，0.300毫摩尔)在3毫升DCM的溶液中，并将反应在25℃搅拌整夜。反应用EtOAc(25毫升)稀释，用NaHCO3(1×25毫升)饱和水溶液和盐水(25毫升)洗涤，并将有机层通过Na2SO4干燥然后浓缩。残余物通过制备TLC(5％EtOAc-己烷)纯化，以白色固体得到40毫克(15％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C37H55N6O5Si计算值691.3(M+H)，实测值691.1。
b)5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸{4-[1-(2-氨基-2-甲基-丙酰基)-哌啶-4-基]-2-环己-1-烯基-苯基}-酰胺三氟乙酸盐 向{2-[4-(4-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-3-环己-1-烯基-苯基)-哌啶-1-基]-1，1-二甲基-2-氧代-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(40毫克，0.050毫摩尔)在2毫升DCM和20微升EtOH的溶液中加入1.5毫升TFA。将溶液在25℃搅拌3小时，使用2毫升乙醇稀释并真空浓缩。残余物使用醚研磨，以白色固体得到8.4毫克(29％)标题化合物。1H-NMR(CD3OD；400MHz)δ8.10(d，1H，J＝8.4Hz)，8.00(s，1H)，7.16(d，1H，J＝8.4Hz)，7.07(s，1H)，5.79(s，1H)，4.55-4.48(m，1H)，3.30(s，6H)，2.89-2.87(m，2H)，2.40-2.25(m，4H)，1.96-1.93(m，2H)，1.86-1.83(m，6H)，1.64-1.61(m，2H)。质谱(ESI，m/z)C26H33N6O2计算值461.2(M+H)，实测值461.3。
实施例58 5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-环己-1-烯基-1′-(2-甲磺酰基-乙基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺
a)5-氨基-6-环己-1-烯基-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯
向5-氨基-6-溴-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(331毫克，0.93毫摩尔)(如实施例54步骤(c)制备)和环己烯-1-基硼酸(141毫克，1.11毫摩尔)在5毫升EtOH、10毫升甲苯和5毫升2M Na2CO3的混合物中加入Pd(PPh3)4(107毫克，0.0930毫摩尔)并将产物在80℃加热16小时。反应使用100毫升醚和100毫升盐水稀释并分层。有机层干燥(硫酸钠)并真空浓缩。残余物通过柱色谱(硅胶，30-60％醚-己烷)纯化，以浅棕色油状物得到248毫克(74％)标题化合物。
b)5-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-6-环己-1-烯基-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯
向4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐(296毫克，0.970毫摩尔)(如实施例3步骤(d)制备)在8毫升DCM的溶液中加入DIEA(291微升，1.72毫摩尔)和PyBroP(512毫克，1.10毫摩尔)并且反应在25℃搅拌15分钟。加入5-氨基-6-环己-1-烯基-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(233毫克，0.65毫摩尔)(如前面步骤制备)在4毫升DCM中的溶液并将反应在25℃搅拌整夜。反应用EtOAc(25毫升)稀释，用NaHCO3(1×25毫升)和盐水(25毫升)洗涤，并将有机层通过Na2SO4干燥然后浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，5％MeOH-CHCl3)纯化，以白色固体得到167毫克(40％)标题化合物。质谱(ESI，m/z)C32H46N6O4Si计算值607.3(M+H)，实测值607.3。
c)5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(6-环己-1-烯基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基)-酰胺三氟乙酸盐
使用类似于实施例14步骤(b)的方法，标题化合物由5-{[4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羰基]-氨基}-6-环己-1-烯基-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[2，4′]联吡啶基-1′-羧酸叔丁酯(167毫克，0.27毫摩尔)制备，以白色固体得到57毫克(43％)标题化合物。LC-MS(ESI，m/z)C21H24N6O计算值377.2((M+H)，实测值377.2。
d)5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸[6-环己-1-烯基-1′-(2-甲磺酰基-乙基)-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基]-酰胺 向5-氰基-1H-咪唑-2-羧酸(6-环己-1-烯基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[2，4′]联吡啶-5-基)-酰胺三氟乙酸盐(57毫克，0.11毫摩尔)在5毫升DCM的溶液中加入DIEA(50.4微升，0.290毫摩尔)，然后加入30.5毫克(0.150毫摩尔)甲磺酸2-甲磺酰基-乙酯(如实施例40步骤(a)制备)。反应搅拌整夜，使用20毫升DCM稀释，使用NaHCO3饱和水溶液(1×20毫升)洗涤并使用Na2SO4干燥。通过制备TLC(硅胶，40％EtOAc-己烷)纯化，以白色固体得到22.3毫克(40％)标题化合物。1H-NMR(DMSO；400MHz)δ10.02(s，1H)，8.24(s，1H)，8.11(d，1H，J＝8.4Hz)，7.18(d，1H，J＝8.4Hz)，5.96(s，1H)，3.04(s，3H)，3.02-2.99(m，3H)，2.73(t，2H，J＝2.7Hz)，2.39-2.37(m，2H)，2.11-2.05(m，4H)，1.85-1.64(m，10H)。质谱(ESI，m/z)C24H31N6O3S计算值483.2(M+H)，实测值483.3。
实施例59 合成实施例3所述中间体的其它方法如下所述。
4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐
a)1H-咪唑-4-腈
装有机械搅拌器、温度探头、冷凝器和加液漏斗的具有氮气进口的22升四颈圆底烧瓶中装入1H-咪唑-4-甲醛(Aldrich，1.10千克，11.5摩尔)和吡啶(3.0升，3.0摩尔)。将反应烧瓶使用冰浴冷却至8℃并且分几份缓慢加入盐酸羟胺(871克，12.5摩尔)以将内部温度保持在30℃以下。将反应冷却至环境温度下并在环境温度下搅拌2小时。所得黄色浓溶液使用加热罩加热至80℃，并且在200分钟内滴加乙酸酐(2.04升，21.6摩尔)以在加入期间将温度保持在110℃以下。将反应混合物在100℃加热30分钟，然后将其冷却至环境温度，然后在冰浴中进一步冷却。通过以内部温度保持在30℃以下的速率加入25重量％NaOH(5.5升)以将pH调节至8.0(pH计)。然后将反应混合物转移至22升分液漏斗并使用乙酸乙酯(6.0升)萃取。合并的有机层使用盐水(2×4.0升)洗涤、使用MgSO4干燥、过滤，并且在减压下在35℃浓缩至干燥，以黄色半固体得到粗产物。将所得半固体悬浮在甲苯(3.0升)中并搅拌1小时，然后将其过滤以得到浅黄色固体，将其再悬浮在甲苯(3.0升)中并搅拌1小时。将所得悬浮液过滤并且将滤饼使用甲苯(2×500毫升)洗涤，以浅黄色固体得到标题化合物(870克，82％)。1H和13CNMR数据与指定结构一致。
b)1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈和3-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-3H-咪唑-4-腈
装有机械搅拌器、温度探头、冷凝器和加液漏斗的具有氮气进口的22升四颈圆底烧瓶装入1H-咪唑-4-腈(830克，8.91摩尔，如前面步骤制备)、碳酸钾(2.47千克，17.8摩尔)和丙酮(6.0升)。进行搅拌并使用冰浴将混合物冷却至10℃。通过加液漏斗在210分钟内加入SEMCl(1.50千克，9.00摩尔)以将内部温度保持在15℃以下。然后将反应加热至环境温度并在环境温度下搅拌整夜(20小时)。然后反应混合物在冰浴内冷却至10℃，并且通过在30分钟内缓慢加入水(8.0升)淬灭，以将内部温度保持在30℃以下。将所得混合物转移至22升分液漏斗并使用乙酸乙酯(2×7.0升)萃取。合并的有机层在减压下在35℃浓缩，以深褐色油状物得到粗产物，其通过硅胶短柱(16.5×20厘米，2.4千克硅胶)使用2∶1庚烷/乙酸乙酯(15升)作为洗脱液纯化。含有产品的组分合并并在35℃减压浓缩，以浅褐色油状物得到标题化合物的混合物(1785克，90％)。1H NMR数据与指定结构一致并且表明比例为64∶36的结构异构体的存在。
c)2-溴-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈
装有机械搅拌器、温度探头、冷凝器和加液漏斗的具有氮气进口的22升四颈圆底烧瓶装入1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈和3-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-3H-咪唑-4-腈(600克，2.69摩尔，如前面步骤制备)的混合物和四氯化碳(1.8升)。搅拌并将混合物加热至60℃。此时分几部分在30分钟内加入N-溴琥珀酰亚胺(502克，2.82摩尔)，这使得温度升至74℃。将反应冷却至60℃并在60℃另外搅拌1小时。将反应缓慢冷却至环境温度并将所得悬浆液过滤，并将滤液使用饱和NaHCO3水溶液(4.0升)洗涤。有机物通过使用2∶1庚烷/乙酸乙酯(6.0升)作为洗脱液的硅胶短柱(8×15厘米，600克硅胶)。合并含有产品的组分(基于TLC分析)并减压浓缩以得到浅黄色结晶固体，然后将其过滤并使用庚烷(500毫升)洗涤，以白色结晶固体得到标题化合物(593克，73％)。1H和13C NMR数据与指定结构一致，并且没有显示少量结构异构体的证据。
d)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸乙酯
装有机械搅拌器、温度探头和加液漏斗的具有氮气进口的12升四颈圆底烧瓶装入2-溴-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-4-腈[390克，1.29摩尔，如前面步骤制备)和无水四氢呋喃(4.0升)。搅拌并使用干冰/丙酮浴将反应混合物冷却至-50℃。通过加液漏斗在30分钟内加入异丙基氯化镁(THF中2.0M，760毫升，1.52摩尔)以将内部温度保持在-40℃以下。反应在-43℃另外搅拌30分钟，然后将其冷却至-78℃。通过加液漏斗在10分钟内加入氯甲酸乙酯(210毫升，2.20摩尔)以将内部温度保持在-60℃以下。反应在-70℃另外搅拌40分钟，在此温度除去干冰/丙酮浴并将反应在1.5小时内加热至环境温度。反应混合物在冰浴中冷却至0℃，并且通过以将内部温度保持在10℃以下的速率缓慢加入氯化铵饱和溶液(1.8升)淬灭。将反应混合物转移至12升分液漏斗，使用乙酸乙酯(4.0升)稀释并分层。合并的有机层使用盐水(2×2.0升)洗涤并且在35℃减压浓缩以得到褐色油状物。粗油状物溶于二氯甲烷(300毫升)并且通过色谱分离(15×22厘米，1.5千克硅胶，10∶1-4∶1己烷/乙酸乙酯)纯化以得到黄色油状物，将其溶于EtOAc(100毫升)，使用庚烷(2.0升)稀释并储存在冰箱中5小时。将所得悬浮液过滤，以白色结晶固体(141克，37％)得到标题化合物。1H和C NMR数据与指定结构一致。
e)4-氰基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-羧酸钾盐
装有机械搅拌器、温度探头和加液漏斗的具有氮气进口的5升三颈圆底烧瓶装入5(400克，1.35摩尔)和乙醇(4.0升)。搅拌并且在全部固体溶解后施加水浴。6N KOH溶液(214.0毫升，1.29摩尔)通过加液漏斗在15分钟内加入以将内部温度保持在25℃以下，并将反应在室温下搅拌5分钟。然后将溶液在减压下在20℃浓缩至干燥以得到白色固体。所得固体悬浮在甲基叔丁基醚(MTBE，4.0升)中并搅拌30分钟，然后将悬浮液过滤并使用MTBE(1.0升)洗涤滤饼以白色固体得到标题化合物，其另外在环境温度下真空干燥4天[366克，89％)。1HNMR、13C NMR和质谱与指定结构一致。C11H16KN3O3Si分析计算值C，43.25；H，5.28；N，13.76。实测值C，42.77；H，5.15；N，13.37。Karl Fisher1.3％H2O。
式I′FLT3抑制剂的生物学活性 进行以下代表性试验以确定式I′FLT3抑制剂的生物学活性。它们以非限制方式说明本发明。
体外试验 进行以下代表性体外试验以确定式I′化合物的FLT3生物学活性。它们以非限制方式给出以说明本发明。
对FLT3酶活性、MV4-11增殖和Baf3-FLT3磷酸化的抑制示例了FLT3酶特异性抑制和依赖于FLT3活性的细胞过程。Baf3细胞增殖的抑制用作与FLT3无关的细胞毒性测试。此处全部实施例显示FLT3激酶的显著和特异性抑制和FLT3依赖的细胞应答。本发明化合物还是细胞可渗透的。
FLT3荧光偏振激酶试验 为了测定本发明化合物在体外激酶试验中的活性，使用以下荧光偏振(FP)方案进行人FLT3受体(a.a.571-993)分离激酶区域的抑制。FLT3 FP试验使用荧光素标记的磷肽和包括在Invitrogen提供的Panvera磷酸-酪氨酸激酶试剂盒(panvera phosphor-Tyrosine kinase kit)(Green)内的抗磷酸酪氨酸抗体。当FLT3磷酸化polyGlu4Tyr时，该荧光素标记的磷肽通过磷酸化polyGlu4Tyr被从抗磷酸酪氨酸抗体置换，由此降低FP值。FLT3激酶反应在以下条件下室温培养30分钟10nM FLT3571-993、20微克/毫升poly Glu4Tyr、150μM ATP、5mM MgCl2、DMSO中1％化合物。通过加入EDTA中止激酶反应。加入荧光素标记的磷肽和抗磷酸酪氨酸抗体并在室温下培养30分钟。
数据点为三份样品的平均值。抑制和IC50数据分析通过使用多参数拟合的非线性回归和S形剂量-反应(变坡)方程式通过GraphPad Prism进行。激酶抑制的IC50表示与DMSO载体对照组相比产生激酶活性50％抑制的化合物的量。
MV4-11 Baf3细胞增殖的抑制 为了评价本发明化合物的细胞效力，FLT3特异性生长抑制在白血病细胞系MV4-11(ATCC号CRL-9591)中测量。MV4-11细胞得自患有具有11q23移位所致MLL基因重排并含有FLT3-ITD突变(AML亚型M4)(1，2)的幼年急性髓性单核细胞白血病的患者。在没有FLT3ITD的情况下，MV4-11细胞不能生长和生存。
IL-3依赖的鼠科b细胞淋巴瘤细胞系Baf3用作对照组，以通过测量本发明化合物的非特异性生长抑制来证实本发明化合物的选择性。
为了测量本发明化合物的增殖抑制，使用基于荧光素酶的CellTiterGlo试剂(Promega)，其基于总细胞ATP浓度量化总细胞数。将细胞以10000细胞/孔分布在含有penn/链球菌、10％FBS和分别对于MV4-11和Baf3细胞含有1纳克/毫升GM-CSF或1纳克/毫升IL-3的100微升RPMI培养基中。
将化合物稀释物或0.1％DMSO(载体对照组)加入到细胞并且使细胞在标准细胞生长条件下(37℃，5％CO2)生长72小时。对于50％血浆中MV4-11细胞生长中的活性测定，细胞以10000细胞/孔分布在生长培养基和人血浆1∶1的混合物中(最终体积为100微升)。为了测量总细胞生长，根据厂商说明书将等体积CellTiterGlo试剂加入到每个孔中，并且量化荧光。根据在第0天的细胞数与第3天(72小时的细胞生长和/或化合物处理)总细胞数的比较，以荧光计数(相对光单位，RLU)中的差异量化总细胞生长。百分之百的生长抑制定义为等于第0天读数的RLU。零百分数抑制定义为DMSO载体对照组在生长第3天的RLU信号。
数据点为三份样品的平均值。生长抑制的IC50表示在DMSO载体对照组第3天导致总细胞生长50％抑制的本发明化合物的量。抑制和IC50数据分析通过使用多参数拟合的非线性回归和S形剂量-反应(变坡)方程式通过GraphPad Prism进行。
MV4-11细胞表达FLT3内部连续重复突变，并且因此完全取决于FLT3生长活性。为了本发明所需质量，希望较强的抗MV4-11细胞活性。相反，Baf3细胞增殖由细胞因子IL-3驱动并因此用作非特异性毒性对照组。本发明FLT3抑制剂化合物#38在3μM剂量(未包括数据)显示小于50％的抑制，表明其不是细胞毒的并且对FLT3具有良好的选择性。
基于细胞的FLT3受体酶联免疫吸附测定 FLT配体诱导的野生型FLT3磷酸化作用的特异性细胞抑制通过以下方法测量过度表达FLT3受体的Baf3 FLT3细胞由Dr.MichaelHeinrich得到(Oregon Health and Sciences University)。Baf3 FLT3细胞系通过亲本Baf3细胞(生长依赖于细胞因子IL-3的鼠科B细胞淋巴瘤系)的稳定转染与野生型FLT3产生。细胞根据在不存在IL-3以及存在FLT3配体的情况下生长的能力选择。
Baf3细胞在具有10％FBS、penn/链球菌和10纳克/毫升FLT配体的RPMI 1640中在37℃、5％CO2保持。为了测量野生型FLT3受体活性和磷酸化作用的直接抑制，类似于对其它RTKs(3，4)研究的那些方法研究了复合ELISA方法。在1小时化合物或DMSO载体培养之前，200微升Baf3FLT3细胞(1×106/毫升)分布在96孔板中的具有0.5％血浆和0.01纳克/毫升IL-3的RPMI 1640中16小时。细胞用100纳克/毫升Flt配体(R&D Systems Cat#308-FK)在37℃处理10分钟。细胞颗粒化、洗涤并溶解在添加有磷酸酶(Sigma Cat#P2850)和蛋白酶抑制剂(Sigma Cat#P8340)的100微升雷瑟(lysis)缓冲剂(50mM Hepes、150mM NaCl、10％甘油、1％Triton-X-100、10mM NaF、1mM EDTA、1.5mM MgCl2、10mM焦磷酸钠)中。溶解产物通过在4℃在1000×克离心5分钟而澄清。细胞溶解产物转入到涂有50纳克/孔抗FLT3抗体(Santa Cruz Cat#sc-480)并使用SeaBlock试剂(Pierce Cat#37527)阻断的白色壁96孔微滴定(Costar#9018)板。溶解产物在4℃培养2小时。微滴定板使用PBS/0.1％Triton-X-100以200微升/孔洗涤3次。微滴定板然后使用1∶8000稀释度的HRP-共轭抗磷酸酪氨酸抗体(Clone4G10，Upstate Biotechnology Cat#16-105)在室温下培养1小时。微滴定板使用PBS/0.1％Triton-X-100以200微升/孔洗涤3次。使用超信号皮可试剂(super signal Pico reagent)(Pierce Cat#37070)的信号检测根据制造商说明书使用Bertho1d微板光度计进行。
数据点为三份样品的平均值。在0.1％DMSO对照组的存在下Flt配体刺激的FLT3磷酸化作用的总相对光单位(RLU)定义为0％抑制，并且100％抑制为溶解产物在基础状态时的总RLU。抑制和IC50数据分析通过使用多参数拟合的非线性回归和S形剂量-反应(变坡)方程式通过GraphPad Prism进行。
1.Drexler HG.The Leukemia-Lymphoma Cell Line Factsbook.Academic PresSan Diego，CA，2000。
2.Quentmeier H，Reinhardt J，Zaborski M，Drexler HG.FLT3mutations in acute myeloid leukemia cell lines.Leukemia.2003 Jan；17120-124。
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本发明选定化合物的活性如下所示。全部活性以μM给出并且具有以下不确定性FLT3激酶±10％；MV4-11和Baf3-FLT3±20％。






体内试验 本发明FLT3抑制剂化合物#38的口腔抗肿瘤效力在体内使用裸小鼠MV4-11人肿瘤异种移植物回归模型评价。实验步骤和结果在以下FLT3抑制剂化合物D单独抗肿瘤作用实验部分讨论(还参见图18-21)。注意化合物D与本发明上述式I′FLT3抑制剂的化合物#38对应。
制剂 本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可通过本领域已知和此处所述的方法制备和配制。除了此处所述制备和制剂之外，本发明法尼基转移酶抑制剂可通过本领域所述方法例如此处引用文献中所公开的方法制备并配制到药物组合物中。例如对于式(I)、(II)和(III)的法尼基转移酶抑制剂，合适的实施例可发现于WO-97/21701中。式(IV)、(V)和(VI)的法尼基转移酶抑制剂可使用WO 97/16443中所述的方法制备和配制，式(VII)和(VIII)的法尼基转移酶抑制剂可根据WO 98/40383和WO 98/49157中所述方法制备和配制，并且式(IX)的法尼基转移酶抑制剂可根据WO 00/39082中所述的方法制备和配制。Tipifarnib(R115777)以及其较差活性的对映体可通过WO97/21701中所述方法合成。Tipifarnib(R115777)预计近期可以ZARNESTRATM商购得到，并且当前根据需求从(通过合同)Johnson&Johnson Pharmaceutical Research&Development，L.L.C.(Titusville，NJ)可得到。
在使用分离的药物组合物的情形，作为活性组分的FLT3激酶抑制剂或法尼基转移酶抑制剂可根据常规药物混合技术与药物载体紧密混合，其中载体根据预期给药形式(例如口腔或肠胃外制剂，例如肌肉注射)可为多种形式。可以类似地制备同时具有作为活性组分的FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的单一药物组合物。
以口服剂型制备分离组合物或单一组合物中可使用任何常用药物介质。因此对于例如悬浮剂、酏剂和溶液的液体口服制剂，合适的载体和添加剂包括水、二醇、油类、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等等；对于例如粉剂、胶囊、囊片、胶囊锭(gelcap)和片剂的固体口服制剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。由于给药方便，片剂和胶囊代表最有利的口服单位剂型，在这种情况下显然应用固体药物载体。如果需要的话，片剂可通过标准技术包有糖衣或肠溶衣。对于肠胃外组合物，载体通常将包含无菌水，尽管还可包括其它成分如帮助溶解或保存的成分。还可制备可注射悬浮液，在这种情况下可以使用适当的液体载体、悬浮剂等等。在制备缓释剂型中，缓释载体(通常为聚合载体)和本发明化合物首先溶解或分散在有机溶剂中。获得的有机溶液然后加入到水溶液以得到水包油型乳剂。水溶液优选包括表面活性剂。随后有机溶剂从水包油型乳剂中蒸发以得到含有缓释剂型载体和本发明化合物的颗粒的胶态悬浮剂。
此处药物组合物在每单位剂型(例如片剂、胶囊、粉剂、注射剂、一茶匙容量(teaspoonful)等等)中将含有递送如上所述有效量的活性组分。此处药物组合物在每单位单位剂型(例如片剂、胶囊、粉剂、注射剂、栓剂、一茶匙容量等等)中将含有约0.01至约200毫克/千克体重/天的活性组分。该范围优选为约0.03至约100毫克/千克体重/天，最优选为约0.05至约10毫克/千克体重/天。该化合物可以以每天1-5次的方案给药。然而该剂量可以根据患者的需要、所治疗疾病的严重程度和使用的化合物改变。可以采用每日给药或者在定期给药后给药。
这些组合物优选处于单位剂型中，例如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、粒剂、无菌肠胃外溶液或悬浮液、计量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿剂、自动喷射器或栓剂；对于口服肠胃外、鼻内、舌下或直肠给药，通过吸入或吹入给药。或者，该组合物可以以适于每周给药一次或者每月给药一次的形式给药；例如可以使用活性化合物的不溶性盐，例如癸酸盐以产生适于肌肉内注射的贮存制剂(depot preparation)。对于制备例如片剂的固体组合物，主要活性组分与药物载体，例如常规片剂组分，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其它药物稀释剂例如水混合，以形成含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当涉及到这些均匀的预制剂组合物时，指的是活性组分均匀分散在组合物中以使得该组合物可容易地亚分成等效的剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。然后再将该固体预制剂组合物分成含有0.1至约500毫克本发明活性组分的上述单位剂型。新组合物的片剂或丸剂可以包衣或者另外复配以提供得到延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包括内部和外部药剂组分，后者以包层的形式在前者之外。这两个组分可通过肠溶衣层分隔，肠溶衣可用于防止在胃部崩解并且容许内部组分完好进入十二指肠或者延缓释放。各种材料可用于这种肠溶层或包衣，这些材料包括具有虫胶、乙酰基醇和乙酸纤维素的多种聚合酸。
FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可分别(或者在单一组合物的情况下同时)加入以口服或注射给药的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆剂、水或油悬浮液以及具有例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的食用油的可食用的乳剂，以及酏剂和类似药物载体。用于水悬浮液的合适的分散或悬浮剂包括合成和天然树胶，例如黄芪胶、阿拉伯胶、褐藻酸盐、右旋糖酐、右旋糖酐羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。以适当调味的悬浮或分散剂形式的液体形式还可包括合成天然树胶，例如黄芪胶、阿拉伯胶、甲基-纤维素等等。对于肠胃外给药，需要无菌悬浮液和溶液。当需要静脉注射给药时，使用通常含有合适的防腐剂的等渗制剂。
FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂可以有利地以单一日剂量(分别或单一组合物)给药，或者总日剂量以每天两次、三次或四次的分离剂量给药。此外，发明化合物(分离或单一组合物)可通过使用合适的鼻内载体以鼻内形式给药，或者经由本领域熟练技术人员熟知的透皮贴片的形式给药。以透皮递送系统的形式给药，在给药方案期间药剂给药自然连续而非间断形式。
例如对于以片剂或胶囊的形式口服给药，活性药物组分(FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂分别，或者在单一组合物的情况下一起)可以与口服、无毒药学上可接受的惰性载体一起给药，惰性载体例如乙醇、甘油、水等等。此外当需要或必要的时候，合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂还可以加入到混合物中。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然的和合成树胶例如阿拉伯胶、黄芪胶，或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等等。
本发明产品的日剂量可以在1-5000毫克/成年人/天的较宽范围内改变。为了口服给药，该组合物优选以症状调节剂量以含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250和500毫克活性成分的片剂的形式提供给治疗的患者。药物的有效量通常以约0.01至约200毫克/千克体重/天的剂量水平提供。该范围特别为约0.03至约15毫克/千克体重/天，最特别为约0.05至约10毫克/千克体重/天。FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂分别，或者在单一组合物的情况下一起以每天达四次或更多次，优选每天1-2次的方案给药。
给药的最佳剂量可通过本领域熟练技术人员容易地确定，并且将随着使用的具体化合物、给药模式、制剂浓度、给药模式以及病情的进展变化。此外，与治疗的特定患者有关的因素，包括患者年龄、体重、饮食和给药次数，也将产生调节剂量的需要。
本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制还可以脂质体递送系统，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的形式(分离或以单一组合物)给药。脂质体可以由各种脂质形成，包括但不限于两亲脂质，例如卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰肌醇、二酰基三甲基铵丙烷、二酰基二甲基甲基铵丙烷和硬脂酰胺；中性脂质，例如甘油三酯，以及其组合。其可含有胆固醇或者可以不含有胆固醇。
本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂还可以(分离或以单一组合物)局部给药。可以使用任何递送装置，例如血管内给药导管、线、药理学支架和管腔内敷膜术。用于这种装置的递送系统可包括以给药控制速率递送化合物的局部输液导管。
本发明提供一种给药装置，其中包括管腔内医学设备，优选支架(stent)，以及本发明治疗量的FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制。或者，本发明通过含有管腔内医学设备优选支架的给药设备保证了本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的一种或全部的治疗有效量的分离给药。
术语“支架”指的是能够通过导管给药的任何设备。支架通常用于预防由身体异常所致的血管闭合，身体异常例如手术创伤所致的有害的血管组织向内生长。其通常具有管状、扩展网格型结构，适于留在导管的管腔内部以减缓阻塞。支架具有管腔壁接触-表面和管腔暴露-表面。管腔-壁接触表面为管的外表面，并且管腔暴露-表面为管的内表面。支架可为聚合物、金属或聚合物和金属的，并且其可任选能够生物降解。
本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂还可以(分离或以单一组合物)以多种方式并且使用多种生物相容材料加入或固定在支架上。在一种示例性实施方案中，化合物直接加入到例如聚合物聚吡咯的聚合物基质中，然后涂布在支架的外表面上。化合物通过聚合物弥散从基质中流出。支架以及在支架上涂布药物的方法在本领域中详细公开。在另一典型实施方案中，支架首先使用含有所述化合物、乙烯-共-乙烯基乙酸酯和聚甲基丙烯酸丁酯的基质层涂布。然后，支架使用仅仅含有聚甲基丙烯酸丁酯的外层涂布。外层作为防止化合物过快流出并且进入周边组织的扩散屏障。外层或外涂保护层的厚度决定了化合物从基质中流出的速度。支架以及涂层方法详细公开在WO9632907、US公开2002/0016625以及其中公开的参考文献中。
为了更好地理解和说明本发明以及其典型实施方案和优点，参考以下试验部分。
试验 虽然上述说明书使用说明目的提供的实例教导了本发明原理，应当理解的是本发明的实施包括落入以下权利要求的全部常用的变型、改变和/或改进以及其等同体。
测试了使用FTI和FLT3抑制剂的组合对AML细胞生长的抑制。两种FTITipifarnib和FTI化合物176(″FTI-176)和八种新的FLT3抑制剂化合物A、B、C、D、E、F、G和H用于在体外抑制FLT3-依赖的细胞类型(参见描述测试化合物的图5)。注意化合物D与式I′FLT3抑制剂化合物#38一致。
测试的细胞系包括生长依赖于FLT3ITD变异体活性(MV4-11和Baf3-FLT3ITD)、FLT3wt活性(Baf3FLT3)并且生长与FLT3活性无关的那些(THP-I)。MV4-11(ATCC编号CRL-9591)细胞源于患有具有Ilq23移位产生MLL基因重排并且含有FLT3-ITD突变(AML亚型M4)的幼年急性髓单核细胞白血病的细胞(参见Drexler HG.TheLeukemia-Lymphoma Cell Line Factsbook.Academic PresSan Diego，CA，2000和Quentmeier H，Reinhardt J，Zaborski M，Drexler HG.FLT3mutations in acute myeloid leukemia cell lines.Leukemia.2003年1月；17120-124。)Baf3-FLT3和Baf3-FLT3ITD细胞系得自Dr.Michael Henrich和the Oregon Health Sciences University。Baf3FLT3细胞系通过亲本Baf3细胞(生长依赖于细胞因子IL-3的鼠科B细胞淋巴瘤系)的稳定转染与野生型FLT3或者在受体的juxatamembrane区域含有ITD插入物导致其组成活化的FLT3一起产生。以其在不存在IL-3和存在IL-3配体下或者与任何生长因子(Baf3-ITD)无关的生长的能力选择细胞。THP-1(ATCC编号TIB-202)细胞从具有N-Ras突变和没有FLT3异常的幼年AML患者中分离。虽然细胞表达功能性FLT3受体，THP-1细胞在生存和生长方面不依赖于FLT3活性(数据没有显示)。
各个化合物单独的剂量应答使用标准72-小时细胞增殖试验对每个细胞系进行确定(参见图6.1-6.8)。在全部试验中，标准化学疗法剂阿糖胞苷用作对照细胞毒素剂。根据细胞类型，FTI Tipifarnib具有较高纳摩尔至较高皮摩尔范围内的效力。在生长依赖于FLT3的细胞中，FLT3抑制剂、化合物A、B、C、D、E、F、G和H分别具有良好的抑制FLT3所致增殖的效力(微摩尔以下)(与第一细胞系细胞毒素剂阿糖胞苷和Tipifarnib相比)。这些化学性质不同的化合物每个都具有治疗与FLT3有关的疾病的潜力，例如FLT3阳性AML。增殖的阿糖胞苷抑制可以与其在MV4-11细胞中体内活性的早期报告相比拟(Levis，M.，等人，(2004)″In vitro studies of a FLT3 inhibitor combined with chemotherapysequenceof administration is important to achieve synergistic cytotoxic effects.″Blood.104(4)1145-50)。测试的FLT3抑制剂对THP-I增殖没有影响。每个细胞系中每个化合物的IC50计算随后用于组合试验以计算化合物组合在细胞增殖方面的协同作用(参见以下图10.1-10.8和表1-3)。
然后检查单一(亚-IC50)剂量的FLT3抑制剂化合物A对Tipifarnib效力的作用。每个细胞系同时用一剂FLT3抑制剂化合物A和变化剂量的Tipifarnib处理并且以标准72-小时细胞增殖方案评价细胞增殖。然后根据以下生物学活性部分所述的方法计算Tipifarnib的IC50(参见描述FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib组合结果的图7a-c)。测试的细胞系包括生长依赖于FLT3ITD变异体活性(MV4-11和Baf3-FLT3ITD)、FLT3wt生长活性(Baf3FLT3)和生长与FLT3活性无关的那些(THP-1)。
对于AML(MV4-11)和FLT3依赖性的(Baf3-ITD和Baf3-FLT3)细胞增殖的抑制，FLT3抑制剂化合物A显著地提高了FTI Tipifarnib的效力。在具有单一亚-IC50剂量的FLT3抑制剂化合物A的(a)MV4-11(50nM)；(b)BaO-ITD(50nM)和(c)Baf3-FLT3(100nM)细胞中，Tipifarnib在每个测试的细胞系中的效力增加3倍以上。这表现出显著的协同作用。
然后在MV4-11、BaO-ITD和Baf3-FLT3细胞系中评价FTI Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A的单一剂量组合。单一剂量组合方案更接近地代表临床应用中化学治疗组合的剂量策略。使用该方法，细胞同时使用单次亚-IC50的每种化合物或化合物的组合处理并且检测增殖的抑制。使用该方法人们注意到，在抑制AML细胞系MV4-11以及其它FLT3-依赖细胞生长中，亚-IC50剂量的FTI Tipifarnib和FLT3化合物A的组合超过添加物(参见图8a-d)。这种与Tipifarnib的协同作用没有在增殖不依赖于FLT3的细胞(THP-1)中观察到。这种协同作用还在FLT3抑制剂化合物A和阿糖胞苷的组合中观察到。
此外测试单个剂量的FLT3抑制剂和FTI的组合以确定这种活性是否是化合物特异性或基于机理的。测试单个亚-IC50剂量的FLT3抑制剂化合物B或D与Tipifarnib以确定其对MV4-11的增殖抑制。可以观察到与Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A的组合类似，FLT3抑制剂B或者D与Tipifarnib的组合以比添加物更大的效力抑制了FLT3-依赖的MV4-11细胞的增殖。说明，任一FLT3抑制剂和FTI的组合将协同抑制FLT3-依赖的AML细胞的增殖。这种观察是新的并且对本领域熟练技术人员并非显而易见。还可以在FLT3抑制剂化合物B或D与阿糖胞苷的组合中观察到这种协同作用。
为了统计上评价FLT3抑制剂与FTI在FLT3依赖的细胞系中的协同作用，给药组合通过Chou和Talalay的方法进行评价。参见Chou TC，Talalay P.(1984)″Quantitative analysis of dose-effect relationshipsthecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.″Adv EnzymeRegul.2227-55。使用这种方法，抑制剂以每种化合物单独使用的IC50剂量的比例同时加入到细胞中。收集数据并且如Chou和Talalay所述进行固定剂量比例组合的isobolar分析。这种分析用来产生复合指数或CI。CI值为1与化合物加和作用相对应；CI值小于0.9被认为是协同作用；CI值大于1.1被认为是拮抗作用。使用这种方法评价多个FTI和FLT3组合。对于每种实验性的组合，对于FLT3依赖细胞系中的每种化合物计算IC50值(参见图6.1-6.8)，然后在标准细胞增殖试验中进行固定比率给药(以包括9、3、1、1/3、1/9×每种化合物IC50值的剂量范围)。图10.1-10.8列出了根据Chou和Talalay方法从isobolar分析固定比率给药、使用Calcusyn软件(Biosoft)得到的原始数据。使用isobolar图，可以图解表示协同作用。作为添加剂的组合的数据点以给定剂量影响(CI＝1)沿着isobolar线分布。协同的组合物的数据点落在给定剂量作用isobolar线的左侧或者下侧。拮抗的组合物的数据点落在给定剂量作用isobolar线的右侧或者上侧(CI＞1.1)。图10.1a-c列出了FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib的组合在MV4-11、Baf3-ITD和Baf3-wtFLT3中的isobolar分析。根据isobolar分析，在全部实验测定的数据点观察到协同作用，包括导致细胞增殖50％抑制(ED50)、细胞增殖75％抑制(ED75)和细胞增殖90％抑制(ED90)的组合剂量。每个这些点明显落在isobolar(或添加物)线的左侧，表明显著的协同作用。FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib的组合在每个测试的FLT3依赖的细胞中产生增殖抑制的显著的协同作用。图10.1a-c中所述isobolar图的组合指标列于以下表1-3中。
此外，图10.2a-b列出了化学性质上不同的FLT3抑制剂、FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib的组合的isobolar分析。类似于FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib组合，FLT3抑制剂化合物H和Tipifarnib组合在测试的全部FLT3依赖的细胞系中在全部测试剂量抑制细胞增殖中具有协同作用。图5.2a-c中所述isobolar图的组合指标列于以下表1-3中。并且，图5.3a-c列出了Tipifarnib和另一在化学性质不同的FLT3抑制剂(FLT3抑制剂化合物E)的组合的isobolar分析。正如用其它受试组合的情况，FLT3抑制剂化合物E和Tipifarnib的组合在全部测试剂量的三种不同细胞系中协同抑制了FLT3依赖的增殖。图5.3a-c中所述isobolar图的组合指标列于以下表1-3中。
为了进一步扩展组合研究，证明与Tipifarnib协同作用的每种FLT3抑制剂还与另一法尼基转移酶抑制剂FTI-176组合测试。表1-3列出了上述三种FLT3依赖的细胞系中全部测试组合的结果。每种组合的组合指标列于表1-3。
表1 表1如复合指数(CI)所测量，FLT3抑制剂和FTI的组合(全部测试组合)协同抑制了MV4-11AML细胞的增殖。如概括于以下生物学活性测量部分的总结，组合以每种化合物对增殖的IC50的固定比例进行。通过Chou and Talalay方法使用Calcusyn软件(Biosoft)计算IC50和CI值。IC50和CI值为在每个数据点具有三次重复实验的三组独立试验的平均值。
表2 表2如复合指数(CI)所测量，FLT3抑制剂和FTI的组合(全部测试组合)协同抑制了用100纳克/毫升FLT配体刺激的Baf3-FLT3细胞的增殖。如概括于以下生物学活性测量部分所示，组合以每种化合物对于增殖的IC50的固定比例进行。通过Chou and Talalay方法使用Calcusyn软件(Biosoft)计算IC50和CI值。IC50和CI值为在每个数据点具有三次重复实验的三组独立试验的平均值。
表3 表3如复合指数(CI)所测量，FLT3抑制剂和FTI的组合(全部测试组合)协同抑制了Baf3-ITD细胞的增殖。如概括于以下的生物学活性测量部分所示，组合以每种化合物对增殖的IC50的固定比例进行。通过Chou and Talalay方法使用Calcusyn软件(Biosoft)计算IC50和CI值。IC50和CI值为在每个数据点具有三次重复实验的三组独立试验的平均值。
在使用的全部FLT3依赖的细胞系中，对全部测试的FTI和FLT3组合都观察到了组合剂量的协同作用。FTI和FLT3抑制剂的组合平均将每种化合物的抗增殖作用降低3-4倍。可以推断，FLT3抑制剂和FTI组合中观察的协同作用为基于机理的现象，而与每种FTI或FLT3抑制剂的特定化学结构无关。因此，协同生长抑制将在FLT3抑制剂和Tipifarnib或任何其它FTI的任意组合中观察到。
FLT3相关病症治疗的最终目标是杀死致病细胞并且引起疾病的退化作用。为了研究FTI/FLT3组合是否在FLT3依赖的致病细胞(特别是AML、ALL ALL和MDS细胞)的细胞死亡中具有协同作用，测试Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A的组合在MV4-11细胞中减少荧光标记的锚定蛋白(Annexin V)着色增加的能力。结合到磷脂酰丝氨酸的锚定蛋白已经从质膜的里叶转移到质膜的外叶并且是测量细胞凋亡的沿用已久的方法。参见van Engeland M.，LJ.Nieland，et al.(1998)″Annexin V-affinity assaya review on an apoptosis detection system basedon phosphatidylserine exposure.″Cytometry.31(1)1-9。
Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A与MV4-11细胞单独一起或者以固定比率(对于每种药剂基于计算的IC50为4∶1)以标准细胞培养条件培养48小时。化合物培养之后，收集处理的细胞并根据如下所述的生物活性测定部分中的方案使用Guava Nexin凋亡试剂盒使用锚定蛋白-PE和7-AAD着色。由于细胞在凋亡晚期开始破裂并且被认为是碎片，锚定蛋白着色在60％达到峰值。然而由于其一致的S形动力学，EC5O可由这种数据计算。根据图11a中的数据可以推断在导致MV4-11细胞的凋亡中，Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A的组合明显要比每种药剂本身更加有效。对于FLT3抑制剂FLT3抑制剂化合物A，锚定蛋白着色诱导的EC50改变4倍以上。对于FTI Tipifarnib，锚定蛋白着色诱导的EC50改变8倍以上。也使用上述Chou and Talalay方法进行统计分析以确定组合的协同作用。图11b描述了Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A组合在诱导锚定蛋白着色中的isobolar分析。全部数据点明显位于isobolar线的左侧。组合物的CI值列于图11c的表格中。由锚定蛋白着色(以及诱导凋亡)观察的协同作用比FLT3抑制剂和FTI组合对于增殖观察的协同作用更加显著。通过FTI和FLT3抑制剂的组合协同诱导MV4-11细胞凋亡的程度不能由本领域熟练技术人员所预见。因此基于增殖的数据，FLT3抑制剂和FTI的任意组合还将在诱导FLT3依赖的细胞凋亡(即，FLT3病症的致病细胞，特别是AML、ALL和和MDS)中具有协同作用。
为了证实FLT3抑制剂和FTI的组合协同活化FLT3依赖的细胞的凋亡，测试几种FLT3抑制剂和FTI Tipifarnib的组合在MV4-11细胞中诱导caspase3/7活性的能力。caspase活化，作为凋亡细胞死亡过程最终实现的关键步骤，可通过各种细胞刺激引发，包括生长因子抽出或生长因子受体抑制，参见Hengartner，MO.(2000)″The biochemistry ofapoptosis.″Nature 407770-76和Nunez G，Benedict MA，Hu Y，Inohara N.(1998)″Caspasesthe proteases of the apoptotic pathway.″Oncogene173237-45。细胞caspase活化可使用合成caspase3/7底物监测，其被裂解以释放酶荧光素酶的底物，可以将底物转化为荧光产品。参见Lovborg H，Gullbo J，Larsson R.(2005)″Screening for apoptosis-classicaland emerging techniques.″Anticancer Drugs 16593-9。caspase活化可根据以下生物学活性测定部分中的方案使用得自Promega(Madison，WI)的Caspase GIo技术检测。
对于协同作用组合分析，进行每种EC50测定以确定剂量比例。图12a-d总结了每种单独药剂的EC50测定数据。对于组合实验，Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物B、C和D与MV4-11细胞一起以固定比例(对于每种单独药剂基于计算的EC50)以不同剂量(以包括9、3、1、1/3、1/9×每种化合物EC50值的剂量范围)在标准细胞培养条件下培养24小时。24小时之后，根据厂商说明书和以下生物学活性测定部分的详细说明测量caspase3/7活性。图13.1-13.3列出了caspase活化的协同作用(通过前述Chou和Talalay方法)，其用Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物B、C和D的组合在MV4-11细胞中观察。在全部测试剂量和全部测试组合中观察到了协同作用。在MV4-11细胞中，对于caspase活化(以及诱导凋亡)观察的协同作用比观察到的FLT3抑制剂和FTI组合对增殖的协同作用更加显著。通过FTI和FLT3抑制剂的组合协同诱导MV4-11细胞凋亡的程度不能由本领域熟练技术人员所预见。因此基于增殖的数据，FLT3抑制剂和FTI的任意组合还将在诱导FLT3依赖的细胞凋亡(即，FLT3病症的致病细胞，特别是AML、ALL和MDS)中具有协同作用。
已经沿用已久的是，FLT3受体以及下游激酶例如MAP激酶的磷酸化作用为FLT3受体的增生作用所必须。参见Scheijen，B.和J.D.Griffin(2002)″Tyrosine kinase oncogenes in normal hematopoiesis andhematological disease.″Oncogene 21(21)3314-33。我们假定使用FLT3抑制剂和FTI观察到的协同作用的分子机制与化合物诱发的FLT3受体信号的降低(AML细胞增殖和存活所需)有关。为了测试这一点，我们根据以下生物学活性测定部分中详述的方案使用市售反应物考察FLT3-ITD受体和FLT3受体下游靶的活性、MV4-11细胞中MAP激酶(erk1/2)磷酸化作用。MV4-11细胞单独使用示出浓度的FLT3抑制剂化合物A或与Tipifarnib组合的FLT3抑制剂化合物A在标准细胞培养条件下培养48小时。为了分析FLT3磷酸化作用，收集细胞并将FLT3免疫沉淀并且通过SDS-PAGE分离。为了分析MAP激酶(erk1/2)磷酸化作用，收集细胞、进行溶解、通过SDS-PAGE分离，并且转入免疫印迹分析的硝化纤维中。为了定量分析FLT3磷酸化作用，免疫印迹使用磷酸酪氨酸抗体探测并且phophoFLT3信号使用分子动力学Typhoon图像分析确定。然后剥离免疫印迹并配置以量化总FLT3蛋白质信号。这种磷酸化作用与总蛋白信号的比例用于计算化合物剂量相应的大致IC50。为了定量分析MAP激酶(ERK1/2)磷酸化作用，免疫印迹使用磷酸化特异性ERK1/2抗体探测并且phophoerkl/2信号使用分子动力学Typhoon图像分析确定。然后剥离免疫印迹并配置以确定总ERK1/2蛋白质信号。这种磷酸化作用与总蛋白信号的比例用于计算化合物剂量相应的大致IC50。使用GraphPad Prism软件计算IC50值。该过程的结果列于图14。
对于FLT3磷酸化作用和MAP激酶磷酸化作用的抑制，人们观察到，Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A的组合使FLT3抑制剂化合物A增加了两至三倍的效力。这与化合物抗增殖作用的效力增加一致。以前没有报道使用FTI/FLT3抑制剂组合观察到的FLT3磷酸化作用作用。这种对于FLT3磷酸化作用的机制未知，并且基于上述增殖抑制收集到的实验数据可以预见到其可在任意FTI/FLT3抑制剂中存在。
体外生物学活性测试 试剂和抗体。细胞Titerglo增殖试剂得自Promega Corporation。蛋白酶抑制剂鸡尾酒(cocktails)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒II购自Sigma(St.Louis，MO)。GuavaNexin凋亡试剂购自Guava technologies(Hayward，CA)。Superblock缓冲剂和SuperSignal Pico试剂购自PierceBiotechnology(Rockford，IL)。荧光偏振酪氨酸激酶试剂盒(Green)得自Invitrogen。小鼠抗磷酸酪氨酸(4G10)抗体购自UpstateBiotechnology，Inc(Charlottesville，VA)。抗人FLT3(兔IgG)购自Santa Cruz biotechnology(Santa Cruz，CA)。抗磷酸Map激酶和总p42/44 Map激酶抗体购自Cell Signaling Technologies(Beverly，MA)。碱性磷酸酶-共轭山羊-抗-兔IgG以及山羊-抗-小鼠IgG抗体购自Novagen(San Diego，CA)。DDAO磷酸盐购自Molecular Probes(Eugene，OR)。全部组织培养试剂购自BioWhitaker(Walkersville，MD)。
细胞系。THP-1(Ras突变，FLT3野生型)以及人MV4-11(表达组成性FLT3-体内连续重复或分离自具有t15；17移位的AML患者的ITD变异体)AML细胞)(参见Drexler HG.The Leukemia-Lymphoma CellLine Factsbook.Academic PresSan Diego，CA，2000和Quentmeier H，Reinhardt J，Zaborski M，Drexler HG.FLT3 mutations in acute myeloidleukemia cell lines.Leukemia.2003 Jan；17120-124.)得自ATCC(Rockville，MD)。IL-3依赖的鼠科B细胞祖细胞系Baf3表达人野生型FLT3(Baf3-FLT3)以及ITD-突变的FLT3(Baf3-ITD)得自Dr.MichaelHeinrich(Oregon Health Sciences University)。细胞保持在含有penn/链球菌、仅仅10％FBS(THP-I、Baf3-ITD)和2纳克/毫升GM-CSF(MV4-11)或10纳克/毫升FLT配体(Baf3-FLT3)的RPMI培养基中。MV4-11、Baf3-ITD Baf3-FLT3细胞生长全部完全依赖于FLT3活性。GM-CSF增强了MV4-11细胞中FLT3-ITD受体的活性。
MV4-11、Baf3-ITD、Baf3-FLT3以及THP-I细胞的细胞增殖试验。
为了测量测试化合物的增殖抑制，使用基于荧光素酶的CellTiterGlo试剂(Promega)。细胞以10000细胞/孔保持在含有penn/链球菌、仅仅10％FBS(THP-I、BaO-ITD)和0.2纳克/毫升GM-CSF(MV4-11)或10纳克/毫升FLT配体(Baf3-FLT3)的100微升RPMI培养基中。将化合物稀释物或0.1％DMSO(载体对照组)加入到细胞并且将细胞在标准细胞生长条件下(37℃，5％CO2)生长72小时。在组合试验中，测试试剂同时加入到细胞中。根据在第0天的细胞数与第3天(72小时的生长和/或化合物处理)总细胞数的比较，以荧光计数(相对灯光单位，RLU)中的差异确定总细胞生长。百分之百的生长抑制定义为相当于第0天读数的RLU。零百分数抑制定义为DMSO载体对照组在生长第3天的RLU信号。所有数据点为三份样品的平均值。用于生长抑制的IC50表示在DMSO载体对照组第3天导致总细胞生长50％抑制的本发明化合物的量。IC50数据分析通过使用多参数拟合的非线性回归和多参数S形剂量-应答(变坡)方程式通过GraphPad Prism进行。
免疫沉淀反应和定量免疫印迹分析。MV4-11细胞在添加有10％胎牛血清、2纳克/毫升GM-CSF的DMEM中生长并且保持在1×105-1×106细胞/毫升之间。对于Map激酶磷酸化作用的蛋白印迹分析，每种条件使用1×106MV4-11细胞。对于研究FLT3-ITD磷酸化作用的免疫沉淀反应实验，每个试验条件使用1×106细胞。在化合物处理之后，MV4-11细胞使用冷1×PBS洗涤一次并且使用HNTG溶解缓冲剂(50mM Hepes、150mM NaCl、10％甘油、1％Triton-X-100、10mM NaF、1mM EDTA、1.5mM MgCl2、10mM焦磷酸钠)+4微升/毫升蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma cat.#P8340)+4微升/毫升磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Sigma cat.#P2850)细胞溶解。核细胞和碎屑通过离心作用(5000rpm5分钟，4℃)从溶解产物中除去。用于免疫沉淀反应的细胞溶解产物使用琼脂糖-蛋白A/G在4℃澄清30分钟并且免疫沉淀物使用3微克FLT3抗体在4℃澄清1小时。然后使用琼脂糖-蛋白A/G在4℃培养免疫络合物1小时。蛋白A/G免疫沉淀物使用1.0毫升HNTG溶解缓冲剂洗涤3次。免疫沉淀物和细胞溶解物(40微克总蛋白)在10％SDS-PAGE凝胶中拆分，并将蛋白转入到硝化纤维膜中。对于抗磷酸酪氨酸免疫印迹分析，膜使用SuperBlock(Pierce)阻断并使用抗磷酸酪氨酸(克隆4G10，Upstate Biotechnologies)印迹2小时，然后通过碱性磷酸酶共轭的山羊抗小鼠抗体印迹。对于抗phosphoMAP激酶蛋白质印迹法，膜被Superblock阻断1小时并且在原抗体中印迹整夜，然后使用AP共轭的山羊-抗兔次级抗体培养。蛋白质的检测通过使用分子动力学Typhoon成像系统(Molecular Dynamics，Sunyvale，CA)测量碱性磷酸酶与底物9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸盐二铵盐(DDAO磷酸盐)(Molecular Probes)反应的荧光产物进行。为了磷酸化作用信号的归一化，剥离印迹并使用抗FLT3抗体配置。DDAO磷酸盐信号的量化和IC50测定使用分子动力学成像系统(Molecular Dynamics ImageQuant)和GraphPad Prism软件进行。
锚定蛋白染色。为了研究白血病MV4-11细胞系的凋亡，细胞使用Tipifarnib和/或FLT3抑制剂化合物A处理，并且结合到磷脂酰丝氨酸的质膜外叶上的锚定蛋白使用GuavaNexin试验试剂和Guava个人流式细胞计系统(Guava Technologies；Hayward，CA)监测。MV4-11细胞以200000细胞/毫升分布在含有各种浓度的Tipifarnib和/或FLT3抑制剂化合物A的组织培养基中并且在37℃、5CO2％培养48小时。细胞通过在4℃在400x克离心10分钟收集。然后细胞用1×PBS洗涤并且以1×106细胞/毫升悬浮在1×Nexin缓冲剂中。5微升锚定蛋白-PE和5微升7-AAD加入到40微升细胞悬浮液中并且在冰上避光保存培养20分钟。450毫升冷1×Nexin缓冲剂加入到每个样品，并且细胞根据厂商说明书在Guava细胞计上得到。认为全部膜联蛋白阳性细胞细胞凋亡，并且计算膜联蛋白阳性细胞百分数。
caspase3/7活化试验。MV4-11细胞在含有pen/链球菌、10％FBS和1纳克/毫升GM-CSF的RPMI培养基中生长。每2-3天，将细胞保持在2×105细胞/毫升和8×105细胞/毫升供给/分裂。将细胞离心并且以2×105细胞/毫升再悬浮在含有penn/链球菌、10％FBS和0.1纳克/毫升GM-CSF的RPMI培养基中。在不同浓度的测试化合物或DMSO的存在下，MV4-11细胞以20000细胞/孔分布在含有penn/链球菌、10％FBS单独和0.1纳克/毫升GM-CSF(Corning Costar Cat#3610)的100毫升RPMI培养基中。在组合试验中，测试试剂同时加入到细胞中。细胞在37℃、5％CO2培养24小时。培养24小时后，caspase活性根据厂商说明书使用Promega CaspaseGlo反应物(Cat#G8090)测量。简要而言，CaspaseGlo底物使用10毫升caspaseGIo缓冲剂稀释。一体积稀释的caspaseGIo反应物加入到一体积的组织培养基并且在旋转定轨振荡器上混合两分钟。在室温下培养60分钟后，使用1秒程序在Berthold光度计上测量发光。基线caspase活性定义为与DMSO载体(0.1％DMSO)处理的细胞相应的RLU。EC50数据分析通过使用多参数拟合的非线性回归和多参数S形剂量-反应(变坡)方程式通过GraphPad Prism进行。
复合指数分析。为了基于Chou和Talalay方法确定FTI和FLT3抑制剂组合的生长抑制协同作用(Chou和Talalay.参见Chou TC，Talalay P.(1984)″Quantitative analysis of dose-effect relationshipsthe combinedeffects of multiple drugs or enzyme inhibitors.″Adv Enzyme Regul.2227-55)，进行固定比率组合给药和isobolar统计分析。对于每个细胞系的增殖，测试药剂以对于增殖的单个IC50的固定比例合并，并且不同浓度的剂量包括测定IC50剂量的9、3、1、1/3、1/9倍。为了测量测试组合的增殖抑制，使用基于荧光素酶的CellTiterGlo试剂(Promega)。细胞以10000细胞/孔保持在含有penn/链球菌、仅仅10％FBS(THP-I、BaO-ITD)和0.1纳克/毫升GM-CSF(MV4-11)或100纳克/毫升FLT配体(Baf3-FLT3)的100微升RPMI培养基中。根据在第0天的细胞数与第3天总细胞数的比较，以荧光计数(相对灯光单位，RLU)中的差异确定总细胞生长。数据点为三份样品的平均值。百分之百的生长抑制定义为相当于第0天读数的RLU。零百分数抑制定义为DMSO载体对照组在第3天生长的RLU信号。抑制数据使用Calcsyn(BioSoft，Ferguson，MO)分析并且计算复合指数(CI)。CI值小于0.9被认为具有协同作用。
体内组合研究 FLT3抑制剂FLT3抑制剂化合物和Tipifarnib(ZarnestraTM)对MV-4-11人AML肿瘤异种移植物在裸小鼠中的生长的组合治疗作用使用FLT3抑制剂化合物B和D测试。体内试验被设计用来扩展体外观察以评价每种口服给药的FLT3抑制剂化合物B和D和Tipifarnib对带有确定MV-4-11肿瘤异种移植物的裸小鼠的协同抗肿瘤作用。
FLT3抑制剂化合物B单独的抗肿瘤作用 雌性无胸腺裸小鼠(CD-1，nu/nu，9-10周龄)得自Charles River实验室(wilmington，MA)并且根据NIH标准供养。全部小鼠在无菌微隔离笼中以干净室内条件下以12小时明/暗周期圈养(5小鼠/笼)，室内保持在21-22℃和40-50％湿度。小鼠供给照射标准啮齿动物饮食并且不限制水。全部动物圈养在美国实验动物管理鉴定协会(AAALAC)完全认可的实验室动物医学设备中。全部方法包括动物按照NIH实验动物管理及使用指南(NIH Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals)管理，并且全部方案经动物关怀与利用委员会(IACUC)批准。
人白血病MV-4-11细胞系得自美国模式培养物保藏所(AmericanType Culture Collection)(ATCC编号CRL-9591)并且在含有10％FBS(胎牛血清)和5纳克/毫升GM-CSF(R&D Systems)的RPMI培养基中繁殖。MV4-11细胞得自患有具有11q23移位所致MLL基因重排并含有FLT3-ITD突变(AML亚型M4)(1，2)的幼年急性髓单核细胞白血病的患者。由于天然存在FLT3/ITD突变的结果，MV-4-11细胞表达组成性活性磷酸化FLT3受体。针对裸小鼠肿瘤异种移植物模型中MV-4-11肿瘤生长的强抗肿瘤活性预期为本发明所希望的质量。
在控制生长研究中，以下条件在皮下注射实体肿瘤异种移植物的裸小鼠中被确定为容许MV4-1l细胞生长的条件在注射之前细胞立即在PBS中洗涤并计数，悬浮在PBSMatrigel(BD Biosciences)1∶1的混合物中然后装入装有25规格针头的预冷却1立方厘米注射器。体重不低于20-21克的雌性无胸腺裸小鼠在大腿的左腹股沟部以0.2毫升的递送体积皮下注射5×106肿瘤细胞。对于退化作用研究，肿瘤在给药之前听任长至预定大小。肿瘤细胞接种约3星期后，带有大小为106至439立方毫米(在此范围内60小鼠)的皮下注射肿瘤小鼠随机分到实验组并且全部实验组具有约200立方毫米的类似的起始平均肿瘤体积。在工作日期间小鼠通过管饲法以各种剂量每天两次(b.i.d)口服给药载体(对照组)或化合物，并且在周末每天一次(q.d)。根据肿瘤生长动力学和载体治疗的对照小鼠中肿瘤大小，继续连续给药11天。如果对照组小鼠中肿瘤达到体重的约10％(约2.0克)，研究将停止。每天以在20％HP βCD/2％NMP/10mM磷酸钠，pH3-4(NMP＝Pharmasolve，ISPTechnologies，Inc)或者其它合适的载体中的透明溶液(@，1，3和10毫克/毫升)的形式新鲜制备FLT3抑制剂化合物并且如上所述口服给药。研究期间，使用电子游标卡尺每星期测量肿瘤生长3次(星期一，星期三和星期五)。使用公式(L×W)2/2计算肿瘤体积，其中L为肿瘤的长度(毫米)并且W为宽度(以毫米表示的最短距离)。体重每星期测量3次并且体重减轻大于10％作为缺乏化合物耐受性的指标。无法接受的毒性定义为研究期间体重减少大于20％。在每个剂量，小鼠每天严格研究明显不利临床特征、药物相关副作用。
在研究终止的那天，得到每个动物的最终肿瘤体积和最终体重。使用100％CO2对小鼠实施安乐死并且立即完整切除肿瘤并称重，最终肿瘤湿重(克)作为主要效力终点。
FLT3抑制剂化合物对MV4-11肿瘤生长的抑制作用的时间过程如图1说明。值表示每个实验组15个小鼠的平均值(±偏差(sem))。肿瘤生长的百分数抑制(％I)对比载体-处理的对照组研究的最后一天的肿瘤生长计算。对比对照的统计学显著性通过方差分析(ANOVA)接着进行Dunnett′s T检验确定*p＜0.05；**p＜0.01。
在研究终止时记录最终肿瘤重量的类似降低。(参见图2)。除了在研究终止当天15个小鼠中仅仅5只小鼠被处死的高剂量组，值表示每个实验组15个小鼠的平均值(±sem)。百分数抑制对比载体-处理的对照组中的平均肿瘤重量计算。对比对照的统计学显著性通过ANOVA接着进行Dunnett′s T检验确定**p＜0.01。
图1通过管饲法以10、30和100毫克/千克1天2次口服给药连续11天FLT3抑制剂化合物B在裸小鼠中产生的统计上有显著意义的、剂量依赖的MV4-11肿瘤皮下生长的生长抑制。在处理的最后一天(第11天)，分别以10、30和100毫克/千克的剂量给药，平均肿瘤体积分别比载体处理的组的平均肿瘤体积剂量依赖地减少44％、84％(p＜0.01)和94％(p＜0.01)。以30毫克/千克和100毫克/千克的剂量，肿瘤退化作用分别比第1天起始平均肿瘤容积分别统计学显著地降低42％和77％。在10毫克/千克的最低测试剂量，观察到中等生长延迟(44％I/对照组)，然而这种效果没有实现统计显著性。
图2口服给药连续11天后，与载体处理组的平均肿瘤重量相比，FLT3抑制剂化合物B产生统计学显著的最终肿瘤重量的剂量-依赖的降低，在10、30和100毫克/千克剂量分别降低48％、85％(p＜0.01)和99％(p＜0.01)。在一些小鼠中，对于高剂量的FLT3抑制剂化合物B，最终肿瘤已经退回到非明显、不能检测的肿瘤。
研究期间小鼠每星期称重3次(星期一，星期三和星期五)，并且在给药时每天研究表现的任何不利临床表现和药物相关副作用。以高达200毫克/千克/天的剂量时，对于FLT3抑制剂化合物B没有注意到明显的毒性，并且在11天治疗期间没有观察到对体重的明显副作用。全部FLT3抑制剂化合物B剂量组都表现出低于3％原始体重的平均体重减轻，表明该FLT3抑制剂化合物良好耐受。
为了进一步确定FLT3抑制剂化合物在肿瘤组织中达到预期的靶点，测量由载体和化合物处理的小鼠得到的肿瘤组织中的FLT3磷酸化作用水平。FLT3抑制剂化合物B的结果如图3所示。对于这种药物动力学研究，得自载体处理的对照组的10个小鼠的亚组随机分成5个小鼠的两个组，然后使用另一剂量的载体或化合物处理(100毫克/千克，经口服(po)给药)。2小时后收获肿瘤并且快速冷冻以通过免疫印迹评价FLT3磷酸化作用。
收获的肿瘤以下面方式处理用于FLT3磷酸化作用的免疫印迹分析100毫克肿瘤组织在添加有磷酸酶(Sigma Cat#P2850)和蛋白酶抑制剂(Sigma Cat#P8340)的细胞溶解缓冲剂(50mM Hepes、150mMNaCl、10％甘油、1％Triton-X-100、10mM NaF、1mM EDTA、1.5mMMgCl2、10mM焦磷酸钠)中搅匀。不溶性碎屑通过在4℃在1000×克离心5分钟而除去。澄清溶解产物(细胞溶解缓冲剂中10毫克/毫升的15毫克总蛋白)使用10微克琼脂糖共轭的抗FLT3抗体、克隆C-20(SantaCruz cat#sc-479ac)在4℃温和搅拌下培养2小时。从肿瘤溶解产物中免疫沉淀的FLT3然后使用细胞溶剂缓冲剂洗涤4次并通过SDS-PAGE分离。SDS-PAGE凝胶转移到硝化纤维并使用抗磷酸酪氨酸抗体(克隆-4G10，UBI cat.#05-777)免疫印迹，然后使用碱性磷酸酶-共轭的山羊抗小鼠次级抗体(Novagen cat.#401212)免疫印迹。蛋白质的检测通过使用分子动力学Typhoon成像系统(Molecular Dynamics，Sunyvale，CA)测量碱性磷酸酶与底物9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸盐二铵盐(DDAO磷酸盐)(Molecular Probes cat.#D 6487)反应的荧光产物进行。为了磷酸化作用信号的归一化，然后剥离印迹并使用FLT3抗体配置。
如图3所示，单次剂量的FLT3抑制剂化合物B以100毫克/千克在MV4-11肿瘤中产生与载体处理的小鼠的肿瘤相比明显生物降低的FLT3磷酸化作用。(总FLT3如下部曲线所示。)这些结果进一步证明了本发明化合物实际上在肿瘤中与预期的FLT3靶体相互作用。
如上所述，在体内评价FLT3抑制剂化合物B的口服抗肿瘤效力中制备带有MV4-11肿瘤的裸小鼠。
与Tipifarnib给药的FLT3抑制剂化合物B的抗肿瘤作用 如上所述，在仅仅体内评价FLT3抑制剂化合物B的口服抗肿瘤效力中制备带有MV4-11肿瘤的裸小鼠。
带有MV4-11肿瘤的裸小鼠随机分成每组15小鼠的五个实验组，其中在每个实验组中平均肿瘤大小相等。使用公式(L×W)2/2计算肿瘤体积(立方毫米)，其中L为肿瘤的长度(毫米)并且W为宽度(以毫米表示的最短距离)。每个实验组的起始平均肿瘤体积约为250立方毫米。
小鼠在工作日每天给药两次(bid)并且周末每天给药一次(qd)单独的载体(20％HPBCD/2％NMP/10mM磷酸钠，pH 3-4(NMP＝Pharmasolve，ISP Technologies，Inc.)、次有效剂量的FLT3抑制剂化合物B(10毫克/千克)、有效剂量的FLT3抑制剂化合物B(20毫克/千克)和Tipifarnib(50毫克/千克)，或与每种剂量的FLT3抑制剂化合物B组合给药。连续给药9天。研究期间使用电子游标卡尺测量三次肿瘤生长。研究期间体重测量3次并且体重减轻大于10％作为缺乏化合物耐受性的指标。
单独使用FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib以及组合使用FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对MV4-11肿瘤的治疗作用的时间过程如图15所示。如图所示，与达到约800立方毫米的肿瘤体积的载体处理组相比较，以10毫克/千克每天给药两次的剂量给药的FLT3抑制剂化合物B产生勉强够格的显著肿瘤抑制。与载体处理组相比较，以20毫克/千克每天给药两次的剂量给药的FLT3抑制剂化合物B产生显著的肿瘤生长抑制，并且与对照组相比彻底控制了肿瘤生长。观察到这种剂量产生了肿瘤生长停滞，然而没有引起肿瘤退化作用(定义为比研究开始时肿瘤尺寸更小的肿瘤尺寸)。如图15所示，在处理的最后一天(第9天)，与对照组相比，单独使用Tipifarnib(50毫克/千克)肿瘤体积没有明显降低。值表示每个实验组15个小鼠的平均值(±偏差)。肿瘤生长的百分数抑制(％I)对照载体-处理的对照组研究的最后一天的肿瘤生长计算。对比对照组的统计学显著性通过ANOVA接着进行Dunnett′s T检验确定**p＜0.01。
再次如图15所示，以50毫克/千克单一药剂的Tipifarnib给药没有效果。然而当两种药剂口服组合给药时，存在由当FLT3抑制剂化合物B以10或20毫克/千克给药的第1天的平均起始肿瘤体积开始的统计学显著地肿瘤体积的退化作用。在第9天，该组的平均肿瘤体积与载体处理的对照组相比抑制95％。因此，组合治疗产生了明显大于仅仅给药一种药物的抑制作用(即肿瘤退化作用)。实际上，Tipifarnib(50毫克/千克)和FLT3抑制剂B单独以10毫克/千克给药时实质上是无活性的，不过当组合使用时提供基本上彻底的肿瘤退化作用。
图15说明单独或者组合口服给药FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤体积的影响。
图16说明在研究的最后一天单独或者组合口服给药FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物最终体积的影响。如图16所示，在研究终止时候，使用组合治疗时注意到协同作用，此时每个实验组的最终肿瘤体积是相当的，只不过最终肿瘤重量达到统计显著性。
图17说明在研究的最后一天单独或者组合口服给药FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物最终肿瘤重量的影响。如图17所示，在研究终止时候，当与单独给药的适当处理组的最终肿瘤重量相比较，协同作用通过10毫克/千克FLT3抑制剂化合物B/50毫克/千克Tipifarnib组合试验组中肿瘤体积测量证实。
在单独或组合使用每种药剂时，在9天处理阶段没有观察到毒性并且没有观察到对体重的明显副作用。总之，与单独使用FLT3抑制剂化合物B或Tipifarnib相比，使用FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib的组合治疗产生明显更大的肿瘤生长抑制。
单独FLT3抑制剂化合物D的抗肿瘤作用 本发明FLT3抑制剂化合物D的口服抗肿瘤效力使用如上所述FLT3抑制剂化合物B口服抗肿瘤效力体内评价的上述方法在无胸腺裸小鼠中使用裸小鼠MV4-11人肿瘤异种移植物回归模型体内评价。
如上所述，在体内评价单独FLT3抑制剂化合物B的口服抗肿瘤效力中制备带有MV4-11肿瘤的裸小鼠。
体重不低于20-21克的雌性无胸腺裸小鼠在大腿的左腹股沟部以0.2毫升的递送体积皮下注射5×106肿瘤细胞。对于退化作用研究，肿瘤在给药之前听任长至预定大小。肿瘤细胞接种约3星期后，带有大小为100至586立方毫米(在此范围内60小鼠；平均288±133立方毫米(SD))的皮下注射肿瘤小鼠随机分到实验组并且全部实验组具有统计学类似的起始平均肿瘤体积(立方毫米)。在工作日期间小鼠通过管饲法以各种剂量每天两次(b.i.d)口服给药载体(对照组)或化合物，并且在周末每天一次(q.d.))。根据肿瘤生长动力学和载体处理的对照小鼠中肿瘤大小，继续连续给药11天。如果对照组小鼠中肿瘤达到体重的约10％(约2克)，研究将停止。每天以在20％HP βCD/D5W、pH3-4或者其它合适的载体中的透明溶液(@，1，3和10毫克/毫升)的形式新鲜制备FLT3抑制剂化合物D并且如上所述口服给药。研究期间，使用电子游标卡尺每星期测量肿瘤生长3次(星期一，星期三和星期五)。使用公式(L×W)2/2计算肿瘤体积，其中L为肿瘤的长度(毫米)并且W为宽度(以毫米表示的最短距离)。体重每星期测量3次并且体重减轻大于10％作为缺乏化合物耐受性的指标。无法接受的毒性定义为研究期间体重减少大于20％。在每个剂量，小鼠每天严格研究明显不利临床特征、药物相关副作用。
在研究终止的那天(第12天)，得到每个动物的最终肿瘤体积和最终体重。使用100％CO2对小鼠实施安乐死并且立即完整切除肿瘤并称重，最终肿瘤湿重(克)作为主要效力终点。
本发明FLT3抑制剂化合物D对MV4-11肿瘤生长的抑制作用的时间过程如图18说明。值表示每个实验组15个小鼠的平均值(±偏差)。肿瘤生长的百分数抑制(％I)对照载体-处理的对照组研究的最后一天的肿瘤生长计算。对比对照组的统计学显著性通过方差分析(ANOVA)接着进行Dunnett′s T检验确定*p＜0.05；**p＜0.01。
如图18所示，本发明FLT3抑制剂化合物D通过管饲法以10、50和100毫克/千克的剂量每天2次口服给药连续11天，在裸小鼠中产生统计上有显著意义的、剂量依赖的MV4-11肿瘤皮下生长的生长抑制。在处理的最后一天(第11天)，分别以50和100毫克/千克的剂量给药的平均肿瘤体积分别比载体处理的组的平均肿瘤体积剂量依赖地减少约100％(p＜0.001)。本发明FLT3抑制剂化合物D以50毫克/千克和100毫克/千克的剂量，肿瘤退化作用比第1天起始平均肿瘤体积分别统计学显著地降低98％和93％。在10毫克/千克的最低测试剂量，没有观察到比载体处理的组更明显的生长延迟。当在100毫克/千克处理的组的第12天结束给药并且肿瘤容许再次生长时，在研究第34天在12个小鼠中仅仅有6只显示可感知的、可测量肿瘤。
由于在试验终止时没有可测量的肿瘤，本发明FLT3抑制剂化合物D产生实际上彻底的肿瘤物质退化作用。(参见图19)。图19中图表中的条表示每个实验组15个小鼠的平均值(±偏差)。如图所示，在10毫克/千克剂量时最终肿瘤重量没有明显降低，与图18中的肿瘤体积数据一致。在50毫克/千克剂量时，由于在终止时这些小鼠中没有检测到可测量肿瘤物质，图表中没有出现条，与图18中所述肿瘤体积彻底退化一致。由于剩余的小鼠取消药物并且剩余的肿瘤如上所述继续生长，100毫克/千克图表剂量组没有出现在该图表中。
连续口服给药11天后，与载体处理的组的平均肿瘤重量比较，本发明FLT3抑制剂化合物D产生剂量依赖的最终肿瘤重量的降低，在50毫克/千克剂量记录的肿瘤物质的彻底退化作用。(参见图19)。
研究期间小鼠每星期称重3次(星期一，星期三和星期五)，并且在给药时每天研究表现的任何不利临床表现和药物相关副作用。以高达200毫克/千克/天的剂量时，对于本发明FLT3抑制剂化合物D没有注意到明显得毒性，并且在11天治疗期间没有观察到对体重的明显副作用。(参见图20)。总之对于全部剂量组，与起始体重相比没有明显体重减轻，表明本发明FLT3抑制剂化合物D良好耐受。
为了进一步确定本发明FLT3抑制剂化合物D在肿瘤组织中达到预期的靶点，测量由载体和化合物处理的小鼠得到的肿瘤组织中的FLT3磷酸化作用水平。本发明FLT3抑制剂化合物D的结果如图21所示。对于这种药物动力学研究，得自载体处理的对照组的6个小鼠的亚组随机分成3个小鼠的两个组，然后使用另一剂量的载体或化合物处理(10和100毫克/千克，经口服给药)。6小时后收获肿瘤并且快速冷冻以通过免疫印迹评价FLT3磷酸化作用。
收获的肿瘤以下面方式冷冻和处理用于FLT3磷酸化作用的免疫印迹分析200毫克肿瘤组织在添加有磷酸酶(Sigma Cat#P2850)和蛋白酶抑制剂(Sigma Cat#P8340)的细胞溶解缓冲剂(50mM Hepes、150mM NaCl、10％甘油、1％Triton-X-100、10mM NaF、1mM EDTA、1.5mM MgCl2、10mM焦磷酸钠)中搅匀。不溶性碎屑通过在4℃在1000×克离心5分钟而除去。澄清溶解产物(细胞溶解缓冲剂中10毫克/毫升的15毫克总蛋白)使用10微克琼脂糖共轭的抗FLT3抗体、克隆C-20(Santa Cruz cat#sc-479ac)在4℃和温和搅拌下培养2小时。
从肿瘤溶解产物中免疫沉淀的FLT3然后使用细胞溶剂缓冲剂洗涤4次并通过SDS-PAGE分离。SDS-PAGE转移到硝化纤维并使用抗磷酸酪氨酸抗体(克隆-4G10，UBI cat.#05-777)免疫印迹，然后使用碱性磷酸酶-共轭的山羊抗小鼠辅助抗体(Novagen cat.#401212)免疫印迹。蛋白质的检测通过使用分子动力学Typhoon成像系统(MolecularDynamics，Sunyvale，CA)测量碱性磷酸酶与底物9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸盐二铵盐(DDAO磷酸盐)(Molecular Probes cat.#D 6487)反应的荧光产物进行。为了磷酸化作用信号的归一化，然后剥离印迹并使用FLT3抗体配置。
如图21所示，与载体处理的小鼠的肿瘤相比较(肿瘤1和2)，单个剂量的本发明FLT3抑制剂化合物D以100毫克/千克在MV4-11肿瘤中产生生物学上明显减少的FLT3磷酸化水平(顶部栅格，肿瘤5和6)。(总FLT3如下部曲线所示。)在使用10毫克/千克化合物处理的动物中还存在磷酸化的部分还原(肿瘤3和4)。这些结果进一步证明了本发明化合物实际上在肿瘤中与预期的FLT3靶体相互作用。
本发明FLT3抑制剂化合物D与Tipifarnib一起给药的抗肿瘤作用 为了证明FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib的组合在MV4-11异种移植物模型中的体内协同作用，如上所述在仅仅体内评价FLT3抑制剂化合物B口服抗肿瘤活性中制备带有肿瘤的裸小鼠。
带有MV4-11肿瘤的裸小鼠随机分成每组10个小鼠的4个实验组，其中在每个实验组中平均肿瘤大小相等。使用公式(L×W)2/2计算肿瘤体积，其中L为肿瘤的长度(毫米)并且W为宽度(以毫米表示的最短距离)。每个实验组的起始平均肿瘤体积约为250立方毫米。
使用载体(20％HP βCD，pH3-4)或单独或组合使用次有效量的FLT3抑制剂化合物D(25毫克/千克)或Tipifarnib(50毫克/千克)。连续给药十六天。使用电子游标卡尺每星期测量肿瘤生长3次(星期一、星期三和星期五)。体重每星期测量3次并且体重减轻大于10％作为缺乏化合物耐受性的指标。
单独或组合使用FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib对MV4-11肿瘤的治疗作用的时间过程如图22所示。如图其示，与达到约1500立方毫米的肿瘤体积的载体处理组相比较，以25毫克/千克每天给药两次的剂量给药的FLT3抑制剂化合物D产生肿瘤生长的停滞。如图22所示，在治疗的最后一天(第16天)，与载体处理的对照组相比较肿瘤体积显著抑制了76％。值表示每个处理组10只小鼠的平均值(±偏差)。肿瘤生长的百分数抑制(％I)对照载体-处理的对照组研究的最后一天的肿瘤生长计算。对比对照组的统计学显著性通过ANOVA接着进行Dunnett′s T检验确定**p＜0.01。
如图22所示，以50毫克/千克单个剂量的Tipifarnib给药没有效果。然而当两种药剂口服组合给药时，存在第1天的平均起始肿瘤体积开始的统计学显著地肿瘤体积的退化作用。在第16天，该组的平均肿瘤体积与载体处理的对照组相比抑制95％。因此，组合治疗产生了每种药物单独得到的相加效应约1.3倍的抑制作用(即肿瘤退化作用)，表明了协同作用。(参见图22)。
图23说明单独或者组合口服给药FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物肿瘤体积的影响。图24说明单独或者组合口服给药FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物生长的最终重量的影响。如图24所示，在研究终止时候，当比较每个实验组的最终肿瘤重量时，类似地使用组合治疗时注意到协同作用。
在单独或组合使用每种药剂时，在16天处理阶段没有观察到毒性并且没有观察到对体重的明显副作用。在上一剂化合物两个小时后收集血浆和肿瘤样品以确定药物浓度。总之，与单独使用FLT3抑制剂化合物D或Tipifarnib相比，使用FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib的组合治疗产生明显更大的肿瘤生长抑制。
结论 在此我们提供有效证据，证明FTI和FLT3抑制剂的组合在体内和体外协同抑制了FLT3-依赖细胞的生长并且诱导其死亡(例如来源于具有FLT3-ITD突变的患者的AML细胞)。体外试验中，在多个FLT3-依赖的细胞中使用Chou和Talalay的复合指数方法，以及使用每个化合物单一次最佳剂量的平均作用方法证明了使用FTI/FLT3抑制剂组合对AML细胞增殖的协同抑制作用。此外，FTI和FLT3抑制剂的组合在FLT3-依赖的AML细胞中引起显著的细胞死亡。这些对细胞凋亡诱导的影响显著大于单独的每种药剂。FTI/FLT3抑制剂组合的这种协同作用由多种结构上不同的FLT3抑制剂和两种不同的FTI观察到。因此，增殖和诱导凋亡的这种协同抑制作用可在任何FLT3抑制剂/FTI组合中存在。有趣地，FTI Tipifarnib与FLT3抑制剂的组合显著增加了FLT3抑制剂介导的FLT3受体信号传导降低的效力。此外，使用体外方法观察的协同作用在使用FLT3-依赖的AML细胞(MV4-11)与FTI Tipifarnib和两种化学结构不同的FLT3抑制剂(FLT3抑制剂化合物B和D)的组合的体内肿瘤模型中重现。因此，这种作用将从任何FLT3抑制剂/FTI组合中看出。据我们所知，这是第一次观察到使用FTI和FLT3抑制剂的组合协同杀死AML细胞。此外基于早期数据，在组合中观察到的协同作用并非对本领域熟练技术人员显而易见。观察到的协同作用很可能与FTI已知抑制小GTPase(Ras和Rho)和NfkB驱动增殖和存活，以及FLT3抑制剂通过FLT3受体降低增殖和存活信号传导的能力有关。此外，FTI/FLT3抑制剂组合对FLT3受体本身的活性具有显著的影响。虽然这种机制当前未知，使用FLT3抑制剂/FTI组合，很可能在细胞增殖的抑制和细胞死亡的活化中具有显著作用。总之，这些研究为FLT3病症提供了新的治疗范例，FLT3病症特别是表达野生型或变异体FLT3的血液学恶性肿瘤，以及用于治疗FLT3病症的FTI和FLT3抑制剂组合的临床实验设计基础，特别是AML、ALL和MDS。
虽然上述说明书使用说明目的提供的实例教导了上述发明原理，应当理解的是上述发明的实施包括落入以下权利要求的全部常用的变型、改变和/或改进以及其等同体。
权利要求
1.一种在主体中抑制FLT3酪氨酸激酶活性的方法，包括向主体给予下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂。
2.一种在主体中抑制FLT3酪氨酸激酶表达的方法，包括向主体给予下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂。
3.一种在主体中降低FLT3酪氨酸激酶活性的方法，包括向主体给予下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂。
4.一种在主体中降低FLT3酪氨酸激酶表达的方法，包括向主体给予下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂。
5.一种在主体中治疗与FLT3酪氨酸激酶活性有关的疾病的方法，包括向主体给予下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂。
6.一种在主体中治疗与FLT3酪氨酸激酶表达有关的疾病的方法，包括向主体给予下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂。
7.一种在细胞中抑制FLT3酪氨酸激酶活性的方法，包括将细胞与下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂接触。
8.一种在细胞中抑制FLT3酪氨酸激酶表达的方法，包括将细胞与下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂接触。
9.一种在细胞中抑制细胞增殖的方法，包括将细胞与下式的FLT3激酶抑制剂
和法尼基转移酶抑制剂接触的步骤。
10.一种在主体中预防细胞增生疾病的方法，包括向主体给予预防有效量的(1)含有下式的FLT3激酶抑制剂
和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。
11.权利要求10的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的化学疗法。
12.权利要求10的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的放射疗法。
13.权利要求10的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的基因疗法。
14.权利要求10的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的免疫疗法。
15.一种在主体中预防细胞增生疾病的方法，包括向主体给予预防有效量的包括下式的FLT3激酶抑制剂
法尼基转移酶抑制剂、和药学上可接受的载体的药物组合物。
16.权利要求15的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的化学疗法。
17.权利要求15的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的放射疗法。
18.权利要求15的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的基因疗法。
19.权利要求15的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的免疫疗法。
20.一种在主体中预防与FLT3有关的疾病的方法，包括向主体给予预防有效量的(1)含有下式的FLT3激酶抑制剂
和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。
21.权利要求20的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的化学疗法。
22.权利要求20的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的放射疗法。
23.权利要求20的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的基因疗法。
24.权利要求20的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的免疫疗法。
25.一种在主体中预防与FLT3有关的疾病的方法，包括向主体给予预防有效量的包括下式的FLT3激酶抑制剂
法尼基转移酶抑制剂、和药学上可接受的载体的药物组合物。
26.权利要求25的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的化学疗法。
27.权利要求25的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的放射疗法。
28.权利要求25的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的基因疗法。
29.权利要求25的方法，进一步包括向主体给予预防有效量的免疫疗法。
30.一种在主体中治疗细胞增生疾病的方法，包括向主体给予治疗有效量的(1)含有下式的FLT3激酶抑制剂
和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。
31.权利要求30的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的化学疗法。
32.权利要求30的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的放射疗法。
33.权利要求30的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的基因疗法。
34.权利要求30的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的免疫疗法。
35.一种在主体中治疗细胞增生疾病的方法，包括向主体给予治疗有效量的包括下式的FLT3激酶抑制剂
法尼基转移酶抑制剂、和药学上可接受的载体的药物组合物。
36.权利要求35的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的化学疗法。
37.权利要求35的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的放射疗法。
38.权利要求35的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的基因疗法。
39.权利要求35的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的免疫疗法。
40.一种在主体中治疗与FLT3有关的疾病的方法，包括向主体给予治疗有效量的(1)含有下式的FLT3激酶抑制剂
和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和(2)含有法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药物组合物。
41.权利要求40的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的化学疗法。
42.权利要求40的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的放射疗法。
43.权利要求40的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的基因疗法。
44.权利要求40的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的免疫疗法。
45.一种在主体中治疗与FLT3有关的疾病的方法，包括向主体给予治疗有效量的包括下式的FLT3激酶抑制剂
法尼基转移酶抑制剂、和药学上可接受的载体的药物组合物。
46.权利要求45的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的化学疗法。
47.权利要求45的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的放射疗法。
48.权利要求45的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的基因疗法。
49.权利要求45的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的免疫疗法。
50.权利要求45的方法，进一步包括向主体给予治疗有效量的化学疗法。
51.权利要求1-50中任意一项的方法，其中所述法尼基转移酶抑制包括下式(I)化合物，
其立体化学异构形式、药学上可接受的酸或碱加成盐，其中
虚线表示任选的键；
X为氧或硫；
R1为氢、C1-12烷基、Ar1、Ar2C1-6烷基、喹啉基C1-6烷基、吡啶基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、氨基C1-6烷基，或者式-Alk1-C(＝O)-R9、-Alk1-S(O)-R9或-Alk1-S(O)2-R9的基团，其中Alk1为C1-6烷二基，R9为羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氨基、C1-8烷氨基或被C1-6烷氧羰基取代的C1-8烷氨基，
R2、R3和R16每个独立地为氢、羟基、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、氨基C1-6烷氧基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷氧基、Ar1、Ar2C1-6烷基、Ar2氧基、Ar2C1-6烷氧基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、三卤代甲基、三卤代甲氧基、C2-6烯基、4，4-二甲基噁唑基；或
当处于相邻位置时，R2和R3一起可以形成下式二价基团
-O-CH2-O-(a-1)，
-O-CH2-CH2-O-(a-2)，
-O-CH＝CH- (a-3)，
-O-CH2-CH2- (a-4)，
-O-CH2-CH2-CH2- (a-5)，或
-CH＝CH-CH＝CH- (a-6)
R4和R5每个独立地为氢、卤素、Ar1、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基S(O)C1-6烷基或C1-6烷基S(O)2C1-6烷基；
R6和R7每个独立地为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ar2氧基、三卤代甲基、C1-6烷硫基、二(C1-6烷基)氨基，或
当处于相邻位置时，R6和R7一起可以形成下式二价基团
-O-CH2-O- (c-1)，或
-CH＝CH-CH＝CH-(c-2)，
R8为氢、C1-6烷基、氰基、羟基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、咪唑基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基，或下式基团
-O-R10(b-1)，
-S-R10(b-2)，
-N-R11R12 (b-3)，
其中R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1、Ar2C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基，或式-Alk2-OR13或-Alk2-NR14R15的基团；
R11为氢、C1-12烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基；
R12为氢、C1-6烷基、C1-16烷基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基氨基羰基、Ar1、Ar2C1-6烷基、C1-6烷基羰基C1-6烷基、天然氨基酸、Ar1羰基、Ar2C1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、羟基、C1-6烷氧基、氨基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基羰基、氨基、C1-6烷氨基、C1-6烷基羰基氨基，或式-Alk2-OR13或-Alk2-NR14R15的基团；其中，Alk2为C1-6烷二基；R13为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、羟基C1-6烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基；R14为氢、C1-6烷基、Ar1或Ar2C1-6烷基；R15为氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、Ar1或Ar2C1-6烷基；
R17为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧羰基、Ar1；
R18为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素；
R19为氢或C1-6烷基；
Ar1为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基；和
Ar2为苯基或被C1-6烷基、羟基、氨基、C1-6烷氧基或卤素取代的苯基。
52.权利要求51的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂包括式(I)化合物，其中X为氧并且虚线表示键。
53.权利要求51的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂包括式(I)化合物，其中R1为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基或单或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R2为卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C1-6烷氧基、三卤代甲氧基或羟基C1-6烷氧基；并且R3为氢。
54.权利要求51的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂包括式(I)化合物，其中R8为氢、羟基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧羰基C1-6烷基、咪唑基，或为式-NR11R12的基团，其中R11为氢或C1-12烷基并且R12为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷基羰基、羟基、或为式-Alk2-OR13的基团，其中R13为氢或C1-6烷基。
55.权利要求51的方法，其中法尼基转移酶抑制剂为(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮，或其药学上可接受的酸加成盐。
全文摘要
本发明包括抑制FLT3酪氨酸激酶活性或表达，或者在细胞或主体中降低FLT3激酶活性或表达的方法，所述方法包括给予法尼基转移酶抑制剂和选自式I’化合物的FLT3激酶抑制剂。本发明包括治疗处于发展(或易于感染)细胞增生疾病或与FLT3有关的疾病风险的预防和治疗方法。
文档编号A61K31/4427GK101267821SQ200680029531
公开日2008年9月17日 申请日期2006年6月7日 优先权日2005年6月10日
发明者C·A·鲍曼, M·D·高尔, R·W·图曼, D·L·约翰逊 申请人:詹森药业有限公司