[0142] 结果：实时定量PCR结果显示，在CK2a敲降的Raw264. 7细胞中，LPS和polyI:C 诱导的IFNf3和CxcllO的表达明显比对照细胞中高（图1)。相应的，在LPS和polyI:C处 理的CK2α敲降的Raw264. 7细胞中，IFNI3诱导的靶基因Mxl和Mx2的表达量也大大增高 了（图1)。相反，炎症因子TNFa和趋化因子CXCL1的表达与对照组相比没有显著性的差 别（图1)，表明CK2选择性地抑制I型干扰素及其I型干扰素诱导的基因表达。通过特异 性识别蛋白磷酸化的抗体，利用Western杂交检测LPS诱导的TLR4信号通路中信号分子的 活化，发现在CK2α敲降的Raw264. 7细胞中，参与I型干扰素诱导的关键性信号分子TBK1 和IRF3的磷酸化明显增高，但是MAPKinasesJNK、ERK、p38的磷酸化则没有明显的变化 (图2)。相反，IκΒα的磷酸化反而下降了（图2)。这些数据显示CK2 -方面抑制TBK1 和IRF3的活化，另一方面正调节IKKα/β和NFκΒ的活化，因此CK2在TLR信号通路中针 对不同的信号分子，具有不同的调节作用。
[0143] 同样，在CK2敲降的L929细胞中，转化入胞浆的polyI:C、polydA:dT和DMXAA通 过激活RIG-I/MDA5或者cGAS/STING信号通路，诱导更多的IFNa、IFN0、CxcllO、Mxl和 Mx2 (图3A)。表明CK2也参与调节胞浆内的RNA和DNA等模式识别受体所诱导的I型干扰 素及其I型干扰素诱导的基因表达。同样通过Western杂交，发现转化的polyl:C在CK2 敲降的L929细胞内激活更多的TBK1和IRF3,相应地，I型干扰素激活的p-STATl在CK2敲 降的L929细胞也明显比对照细胞中要高（图3B)。在DMXAA刺激的CK2敲降的L929细胞 核中，不仅P-TBK1上升，而且IRF3的核转移也明显上调（图3C)。相反，NFκΒp65的核转 移并没有显著增加（图3C)。进一步证明CK2特异性的抑制TBK1和IRF3的活化，以此调节 多种模式识别受体介导的I型干扰素及其I型干扰素诱导基因的表达。
[0144] 实施例2蛋白激酶CK2参与调控多种病毒感染诱导的I型干扰素表达
[0145] 方法：将对照和CK2α敲降的稳转细胞系以106个/ml分别接种到6孔板中，每孔 接种 2ml。分别感染DNA病毒HSV-1 (1X107pfu/ml)、RNA病毒水泡病毒VSV(2. 5X105TCID5。/ ml)和仙台病毒SeV(lX10sHA/ml)。感染病毒6小时后，收集细胞用于RNA抽提制备。感染 HSV病毒6小时后，换液、继续培养66小时收集细胞上清液用于HSV病毒滴度测定。利用 TRIZOL(Invitrogen)方法提取Raw264. 7 和L929 的RNA,并用Superscript?IIIReverse TranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量 PCR检测基因表达水平。实时定量PCR引物详见附件表格1。运用△Act方法计算所测基 因相对于GAPDH的相对表达量。用经典病毒滴度测定法检测细胞上清液中HSV的病毒滴 度，具体方案为：以5X104个/ml分别接种Vero细胞到24孔板中，每孔接种0. 5ml，待细胞 丰度达到30 %时，分别加入不同浓度梯度的细胞上清液（原液、1:101、1:102、1:103、1:10 4、 1:105、1:106、1:107、1:10s、1:109、1:101°)和空白对照培养4小时。4小时后，去除上清液，每 孔加入0. 8%的琼脂-MEM培养液400μ1，常温静置1小时待培养基凝固后，继续倒置培养 67小时。培养结束后，每孔加入500μ1结晶紫溶液，常温静置2小时。抽掉琼脂，计数空斑 的数目，计算病毒滴度（pfu/ml,plaqueformingunit/ml)〇
[0146] 结果：实时定量PCR结果显示，在CK2a敲降的Raw264.7细胞中，HSV诱导的 IFNa、IFNI3和CxcllO的表达明显比对照细胞中高（图4)。相应的，IFNa/β的靶基因 Mxl和Μχ2的表达也在CK2α敲降的Raw264. 7细胞中大大增高了（图4)。随着I型干扰 素及其靶基因产物的大量表达，HSV病毒的复制、组装和释放受到显著的抑制，在CK2a敲 降的Raw264. 7细胞培养液中检测到的HSV病毒滴度比对照组的要低接近10倍（图4)。同 样，与对照细胞相比，在CK2敲降的L929细胞中，VSV和SeV诱导的IFNa、IFN0、Cxcll0、 Mxl和Mx2等基因的表达也极其显著地上调（图5和图6)。因此在多种病毒感染状态下， 下调CK2的表达均能显著增强不同类别细胞表达I型干扰素的能力。这些结果表明CK2是 负调控I型干扰素表达的关键性分子。
[0147] 实施例3CK2的激酶活性在调控I型干扰素表达中起着关键性的作用
[0148] 方法：在lenti-viral载体p⑶Η上分别克隆编码小鼠CK2α野生型和激酶失活的 突变体（K68M)的cDNA，然后将它们转导入L929细胞系，通过puromycin筛选得到对照细胞 株，分别表达野生型和突变型CK2a的细胞株。通过Western杂交验证了野生型和突变型 CK2a的表达（图7A)。
[0149] 将表达野生型和突变型CK2a的细胞株以106个/ml分别接种到6孔板中，每孔接 种 2ml。VSV(2. 5X105TCID5Q/ml)感染 6 小时后，利用TRIZOL(Invitrogen)法抽提制备细 胞中的RNA。用Superscript?IIIReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录 1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测I型干扰素基因表达水平，运用ΔΔct 方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。
[0150] 结果：实验表明，在高表达野生型CK2a的细胞中，IFNa、IFNf3和CxcllO等基因 的表达量比对照细胞低（图7B)。相反，在高表达无激酶活性的CK2 a突变体细胞中，这些 基因的表达量与对照细胞比没有明显差别（图7B)。这些结果表明上调CK2的表达能降低 细胞诱导I型干扰素的能力，而且CK2的激酶活性在调节I型干扰素表达中是必不可少的。
[0151] 实施例4抑制CK2激酶活性促进细胞表达I型干扰素，阻止水泡病毒感染
[0152] 4. 1方法：将小鼠成纤维细胞L929以106个/ml分别接种到6孔板中，每孔接 种2ml，待细胞丰度达到70 %时，使用不同浓度CK2激酶抑制剂一小分子化合物TBB或 DMS0 (对照）处理该细胞6小时或12小时后，利用裂解缓冲液（50mMTris-HCl(pH7. 4)、 150mMNaCl、lmMEDTA，1%TritonX-100,蛋白酶抑制剂Complete(Roche)、lmMPMSF、lmM NaF、lmMNa3V04)提取并制备细胞的蛋白裂解液，通过Western杂交检测NFkBp65和TBK1 的磷酸化。
[0153] 结果：图8A的结果表明20μΜTBB处理L929细胞6小时后，CK2的激酶活性被抑 制，它所介导的Ρ65磷酸化明显降低。但总体而言，100μΜΤΒΒ处理12小时能更有效地抑 制CK2的活性，而且能最有效地激活诱导I型干扰素表达的关键性激酶ΤΒΚ1 (图8Α)。
[0154] 4. 2方法：同法使用ΤΒΒ(100μΜ)或DMS0 (对照）处理L929细胞12小时后， 利用TRIZOL(Invitrogen)法抽提制备细胞中的RNA。用Superscript?IIIReverse TranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量 PCR检测I型干扰素基因表达水平，运用ΔΔct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表 达量。
[0155] 结果：发现TBB处理促进细胞合成IFNa、IFN0、CxcllO、Mxl和Mx2等基因的表 达（图8B)，因此可能建立了一个抗病毒感染的状态。果然，用0、20、50、100以1的了88分别 处理L929细胞12小时后，再接种VSV病毒（2. 5X105TCID5Q/ml，表达GFP，因此可以利用荧 光显微镜检测被感染的细胞）；24小时后，利用荧光显微镜检测VSV感染的效率。发现TBB 预处理的细胞呈现出对VSV感染的抗性，而且随着TBB浓度的增加，抗VSV感染的能力也变 强。需要特别指出的是，1〇〇μΜTBB处理后的L929细胞几乎完全不被VSV感染，具备了抵 御病毒感染的能力（图9)。
[0156] 4. 3在人胚胎肾细胞ΗΕΚ293Τ中，验证了抑制CK2的激酶活性对细胞表达I型干扰 素的影响以及在阻止水泡病毒感染中的作用。
[0157] 方法：将人胚胎肾细胞ΗΕΚ293Τ以106个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml， 待细胞丰度达到70%时，使用TBB或DMS0 (对照）处理细胞。同法提取细胞的蛋白裂解液 用于Western检测，提取RNA用于I型干扰素相关基因表达水平的检测，荧光显微镜检测 VSV感染的效率。
[0158] 结果：实验发现，在人胚胎肾细胞HEK293T中，TBB处理12或24小时后，TBK1也 被明显地激活（图10A)，并促进了IFNa、IFNf3、Mxl和Mx2等基因的表达（图10B)。更重 要的是，TBB处理后的HEK293细胞抵抗VSV感染的能力也极大地增强（图10C)。这些结 果说明TBB在小鼠和人细胞中均能诱导I型干扰素的表达，建立抗病毒感染的防御状态，有 效地抵抗VSV病毒的感染。
[0159] 实施例5CK2抑制剂TBB阻止HCV感染
[0160] HCV感染导致的慢性肝炎在中国和世界范围内都呈增加的趋势。在人肝癌细胞 Hu7. 5中，HCV病毒可以非常有效地感染和复制，但不能诱导I型干扰素的表达。因此，外源 给予干扰素治疗对一部分HCV慢性感染病人有较好的效果，但干扰素价格昂贵，且副作用 明显。所以，探究能否利用TBB来诱导宿主自体产生I型干扰素，以达到治疗HCV感染的效 果。
[0161] 方法：将Hu7. 5细胞以5X104个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml，使用的 培养基是〇1^1完全培养基。待细胞丰度达到30%时，10(^1188或0130(对照）处理24 小时后，MOI(multiplicityofinfection) =0· 01 或者Μ0Ι=0· 1 的HCV感染 8 小时后， 换液、继续培养64小时。收集细胞分别用于RNA分析和HCV感染的效率，收集细胞上清液用 于HCV病毒滴度测定。用经典病毒滴度测定法检测细胞上清液中HCV的病毒滴度，具体方 案为：以5X104个/ml分别接种Hu7. 5细胞到96孔板中，每孔接种200μ1，待细胞丰度达 到30 %时，分别加入不同浓度梯度的细胞上清液（原液、1:101、1:102、1:103、1:10 4、1:105、 1:106、1:107、1:10s、1:109、1:101°)，继续培养72小时，收集细胞，多聚甲醛固定后免疫荧光 化学法标记HCV特异性抗体，荧光显微镜检测已被HCV感染并带有荧光标记的Hu7. 5细胞 个数，计算病毒滴度（ffu/ml,fluorescenceformingfoci/ml)〇
[0162] 结果：同法提取分析细胞中的RNA与I型干扰素相关基因的表达水平，定量PCR结 果表明，在TBB预处理的细胞中，IFNa、IFNf3、Mxl和Mx2等I型干扰素相关基因的表达较 高；同时，TBB预处理也提升了细胞中炎症因子IL-6的表达（图11A)。相反，Hcv基因的表 达量则非常少（图11A)。细胞经4%多聚甲醛固定30分钟，PBS磷酸缓冲液洗涤，应用免 疫荧光化学法标记HCV特异性抗体，荧光显微镜检测HCV感染效率。发现未受处理的细胞 大量感染HCV，但TBB处理后仅仅有极少的细胞被HCV感染（图11B)。HCV的病毒滴度检测 结果显示，TBB预处理后，细胞上清液中HCV病毒的滴度明显降低（图11C)。以上研究结果 综合表明TBB预处理能促进肝脏细胞Hu7. 5产生I型干扰素，阻止HCV的感染和复制。
[0163] 实施例6TBB抑制HCV复制、清除HCV感染
[0164] 方法：将Hu7. 5细胞以5X104个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml，待细胞 丰度达到 30%时，首先用MOI(multiplicityofinfection) =0.01 或者Μ0Ι= 0.1 的HCV 感染细胞，24小时后，HCV已经进入细胞并开始复制，再使用100μΜTBB或DMS0 (对照）处 理感染后的Hu7.