5细胞。48小时后，同法收获细胞并制备RNA，通过定量PCR检测细胞和病 毒基因的表达量。
[0165] 结果：HCV感染后，Hu7. 5细胞并不能诱导I型干扰素的表达。但加入TBB后，细胞 开始大量表达I型干扰素、I型干扰素诱导的基因MX1和MX2,以及一些促炎症因子，像IL-6 和TNFa(图12A)。随着I型干扰素及其靶基因产物的大量表达，HCV病毒的复制、组装和 释放受到显著的抑制，在TBB处理的细胞培养液中检测到的HCV病毒滴度比未处理的要低 10-100倍（图12B)。这些结果表明TBB可以用来治疗慢性HCV感染的病人。
[0166] 实施例7TBB调节肿瘤细胞中I型干扰素的表达
[0167] 方法：人原髓细胞白血病细胞（Humanpromyelocyticleukemiacells)HL-60 (购 自ATCC)和人肾癌细胞0S-RC-2在RPMI-1640培养基中培养，并补加10%的胎牛血清、 2mM谷氨酰胺和抗生素。将HL-60或0S-RC-2细胞以5X104个/ml分别接种到6孔板中， 每孔接种2ml，待细胞丰度达到30%时，加100μΜTBB或DMS0(对照）处理。12小时后， 收集细胞，用Trizol(Sigma)制备RNA。用Superscript?IIIReverseTranscriptase Kit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测I型干扰 素基因表达水平，运用AAct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。
[0168] 结果：定量PCR结果表明，在TBB预处理的人原髓细胞白血病细胞HL-60和人肾癌 细胞0S-RC-2细胞中，IFNa、IFN0、Cxcl10、Mxl和Mx2等I型干扰素相关基因的表达比 未处理的对照细胞明显增高（图13和图14)，表明TBB也能在肿瘤细胞中诱导I型干扰素 的表达。
[0169] 实施例8CK2抑制剂TBB抑制EV71感染
[0170] 方法：将Vero细胞以3X104个/ml分别接种到24孔板中，每孔接种0. 5ml，待 Vero细胞丰度达到70 %时，按照TBB预防组与TBB治疗组分别处理Vero细胞。TBB预 防组：20、50、和100μΜTBB或DMS0(对照）分别处理细胞2小时后，分别感染肠道病毒 EV712*102TCID5Q/ml4小时后，换液、继续用添加20、50和100μΜΤΒΒ或DMS0(对照）的 培养基分别培养24小时。换液，用未添加ΤΒΒ或DMS0的培养基继续培养48小时，收集细 胞上清液用于EV71病毒滴度测定。ΤΒΒ治疗组：感染肠道病毒EV712*102TCIDM/ml4小时 后，换液、用添加20、50和100μΜTBB或DMS0(对照）的培养基分别培养72小时，收集细 胞上清液用于EV71病毒滴度测定。用经典病毒滴度测定法TCID5。（半数组织细胞感染量） 检测细胞上清液中EV71的病毒滴度，具体方案为：以3X104个/ml分别接种Vero细胞到 96孔板中，每孔接种0.lml，待细胞丰度达到70%时，分别加入不同浓度梯度的细胞上清液 (原液、1:101、1: 1〇2、1: 1〇3、1: 1〇4、1: 1〇5、1: 1〇6、1: 1〇7、1: 1〇8、1: 1〇9、1:101。）和空白对照培养 4小时。4小时后，去除上清液，换液、继续培养68小时。培养结束后，光学显微镜观察细胞 受感染程度，计数超过半数感染的孔板的数目，计算病毒滴度（TCID5Q/ml,tissueculture infectivedose/ml)〇
[0171] 结果：不同剂量TBB预防组处理Vero细胞，EV71感染后，TBB预防组处理的细胞 培养液中检测到的EV71病毒滴度低于未处理组，并呈现一定的浓度相关性。预防组中，使 用TBB的浓度越高，细胞培养液中检测到的EV71病毒滴度越低（图15A)。先感染EV71，再 使用TBB的治疗组细胞培养液中检测到的EV71病毒滴度比未处理组要低10-100倍（图 15B)，高浓度使用TBB(100μM)能够显著地抑制EV71病毒的复制、组装和释放，最终检测到 的EV71病毒滴度降低达到百倍（图15Β)。
[0172] 实施例9动物感染模型中ΤΒΒ抑制疱疹病毒HSV的感染
[0173] 9. 1ΤΒΒ激活小鼠体内诱导I型干扰素表达的关键性激酶ΤΒΚ1
[0174] 方法：6-8周龄Β6小鼠，雌雄各半，分别依照小鼠体重腹腔注射2. 5、10、25mg/kg TBB或葵花籽油（对照组），24小时后按照动物福利法处死小鼠，取肝脏与脾脏测定组织样 本中与I型干扰素合成相关的细胞因子TBK1的激活程度。称取单位重量的组织样本，加入 裂解缓冲液（50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、lmMEDTA，l%TritonX-100,蛋白酶抑 制剂Complete(Roche)、lmMPMSF、lmMNaF、lmMNa3V04)匀浆，提取并制备组织样本的蛋白 裂解液，通过Western杂交检测TBK1的磷酸化。
[0175] 结果：图16A的结果表明，腹腔注射10mg/kg TBB 24小时可以有效地激活肝脏中 诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1，腹腔注射2. 5或者10mg/kg TBB 24小时均可以 有效地激活脾脏中诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1。同时，根据Western检测的结 果，我们采用l〇mg/kg的TBB作为后续小鼠动物感染模型腹腔注射实施例的剂量。
[0176] 9. 2TBB抑制小鼠体内HSV的感染
[0177] 方法：6_8周龄B6小鼠，雌雄各半，分别依照小鼠体重腹腔注射10mg/kgTBB或葵 花籽油（对照组），6小时后分别依照小鼠体重尾静脉注射5*107pfu/gHSV。注射HSV12 小时后同法给予第二次TBB，注射HSV24小时后按照动物福利法处死小鼠，取血液与脾脏 测定组织样本中HSV的病毒滴度。用经典病毒滴度测定法检测小鼠组织样本中HSV的病毒 滴度，具体方案为：称取lg组织样本，加入lmlPBS，匀浆得到组织匀浆液。以5X104个/ ml分别接种Vero细胞到24孔板中，每孔接种0. 5ml，待细胞丰度达到30%时，分别加入不 同浓度梯度的组织样本匀浆液（原液、1:101、1: 1〇2、1: 1〇3、1: 1〇4、1: 1〇5、1: 1〇6、1: 1〇7、1:10s) 和空白对照（PBS)培养4小时。4小时后，去除匀浆液，每孔加入0.8 %的琼脂-MEM培养 液400μ1，常温静置1小时待培养基凝固后，继续倒置培养67小时。培养结束后，每孔加 入500μ1结晶紫溶液，常温静置2小时。抽掉琼脂，计数空斑的数目，计算病毒滴度（pfu/ g,plaqueformingunit/g)〇
[0178] 结果：由于腹腔注射lOmg/kgTBB可以有效激活小鼠组织中诱导I型干扰素表达 的关键性激酶TBK1 (图16A)，从而使HSV病毒的复制、组装和释放受到显著的抑制。HSV 感染24小时后，TBB处理组小鼠血液、脾脏中检测到的HSV病毒滴度显著低于对照组（图 16B)。
[0179] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 酪蛋白激酶2(Caseinkinase2，CK2)抑制剂的用途，其特征在于，（i)用于制备促 进I型干扰素（I-IFN)和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物；和/或（ii) 用于制备治疗和/或预防I型干扰素缺乏相关疾病的药物组合物。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括CK2的反义核酸、抑制性 microRNA、抗体或小分子化合物。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的I型干扰素缺乏相关疾病包括：病毒 感染性疾病、恶性肿瘤、多发性硬化（MultipleSclerosis)。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的病毒感染性疾病包括感染了以下的 病毒的疾病：单纯疱疹病毒（HSV)、水泡病毒（VSV)、卡波希氏瘤疱疹病毒（KSHV)、呼吸道合 胞病毒（RSV)、手足口病病毒（肠道病毒EV71和CA16)、乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)、或人类获得性免疫缺陷病毒/艾滋病病毒（HIV);和/或 所述的恶性肿瘤包括以下肿瘤：多毛细胞白血病（hairycellleukaemia)、慢性髓 性白血病（CML)、淋巴瘤（lymphoma)、骨髓瘤（myeloma)、黑色素瘤（melanoma)、肾细胞癌 (renalcellcarcinoma)、膀脫癌（bladdercellcarcinoma)、或卡波希氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)〇5. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂为抑制I型干扰素表达和 /或活性的小分子化合物，较佳地，包括四溴苯三唑（TBB)、CX-4945(Silmitasertib)、 DMT(2-二甲氨基-4, 5, 6, 7-四溴-1H-苯并咪唑）、山奈酚、酪氨酸磷酸化抑制剂 AG114(TyrphostinAG114)、四溴肉桂酸、3-[[5-(4_ 甲苯基）噻吩[2,3-d]嘧啶-4-yl]硫 基]丙酸0^?22)、0父-5011、鞣花酸伍11&8。厶(^(1)、3-甲基-1，6,8-三氢蒽醌（6111〇乜11)、 4'，5, 7-三羟基黄酮（apigenin)。6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的I型干扰素诱导基因或其蛋白包 括CXCL10/IP-10、STAT1、MX1、MX2、Rsad2/Viperine、磷酸激酶TBK1、干扰素调节因子 3(IRF3)。7. -种体外非治疗性的促进细胞表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白 和/或体外非治疗性的抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/或肿瘤细胞生长的方法，其 特征在于，包括步骤：在CK2抑制剂的存在下，培养细胞，从而促进细胞表达I型干扰素和/ 或I型干扰素诱导基因或其蛋白和/或抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/或肿瘤细胞 生长。8. -种筛选能够抑制CK2的化合物的方法，其特征在于，包括步骤： (al)在试验组中，向细胞培养体系加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和/或 活性；在对照组中，向细胞培养体系不加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和/或 活性； 其中，若试验组中I型干扰素的表达量和/或活性显著高于对照组，则说明所述的候选 化合物为能够抑制CK2的化合物；和/或 (a2)在试验组中，向病毒感染的细胞培养体系中加入待测化合物，并测定细胞培养体 系中病毒的滴度；在对照组中，向病毒感染的细胞培养体系中加入待测化合物，并测定细胞 培养体系中的病毒滴度； 其中，若试验组病毒的滴度显著低于对照组，则说明所述的候选化合物为能够抑制CK2 的化合物。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括步骤： (b)对（a)中的化合物进一步测试其对酪蛋白激酶2基因或其蛋白的促进作用。10. -种制备I型干扰素的方法，其特征在于，包括步骤： (i) 在CK2抑制剂的存在下培养细胞； (ii) 收集、分离并纯化细胞培养液中的I型干扰素。
【专利摘要】本发明提供了一种抑制酪蛋白激酶2活性在促进I型干扰素表达的应用。具体地，本发明涉及一种酪蛋白激酶2(Casein？kinase？2，CK2)抑制剂的用途，(i)用于制备促进I型干扰素(I-IFN)和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物；和/或(ii)用于制备治疗I型干扰素缺乏相关疾病的药物组合物。实验证明，CK2的抑制能够有效诱导、促进I型干扰素的产生，并激活I型干扰素下游基因的表达，从而对I型干扰素缺乏导致的相关疾病具有良好的治疗作用。
【IPC分类】A61P37/02, A61P31/12, A61K31/352, A61K48/00, G01N33/68, A61K31/519, A61P35/00, A61K39/395, A61P25/28, A61K31/4184, A61K31/122, C07K14/56, A61K31/192, A61K31/366, A61K31/4192, A61K31/7088, A61K45/00
【公开号】CN105457029
【申请号】CN201510617485
【发明人】肖晖, 杜旻, 刘晶华, 谢亚栋, 钟劲, 向禹
【申请人】中国科学院上海巴斯德研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年9月24日
【公告号】WO2016050203A1