专利名称：一类能够抑制锌离子金属蛋白酶的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类能够抑制锌离子金属蛋白酶的化合物，其用途以及含有该化合物的药物组合物。
背景技术：
基质金属蛋白酶即Matrix Metalloproteinases，简称MMPs，是由细胞分泌的Zn2+金属内肽酶家族的总称，参与细胞外基质(ECM)的降解。MMPs是一个Zn2+依赖性蛋白酶家族，主要由成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等合成与分泌，通常在中性条件下及Ca2+参与下发挥作用，目前已发现23种人源MMPs。各种MMPs普遍具有如下特征①不同的MMPs的cDNA序列具有同源性。②均以酶原形式分泌，受蛋白酶或其它因子激活，活化后能降解一种或多种ECM。③酶活性依赖酶活性中心的Zn2+及Ca2+。④酶活性受特异性基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)抑制，亦可受螯合剂抑制。
细胞外基质(ECM)不仅起细胞与细胞之间机械支持和连接作用，也是细胞和细胞之间信号传递的桥梁。MMPs是ECM蛋白水解酶，可以通过分解ECM成分来调节其降解和重组之间的动态平衡，以达到消除某些特殊信号、显现某些隐含信号、甚至使基质中已存在的生物活性物质释放或激活的目的，进而参与细胞和组织器官的各种形态和功能变化。这些变化既包括各组织和细胞的生长、增殖、分化；生殖过程中子宫内膜的周期性变化、排卵、胚泡着床等生理变化，也包括肿瘤细胞的浸润和转移，炎症的发生及扩散等病理变化。MMPs的生物功能除对细胞外基质(ECM)的降解外，它们在调控细胞因子、生长因子、激素和细胞粘附分子受体等的合成和分泌中发挥重要作用，进而参与细胞凋亡、形态发生、增殖和发育等一系列病理和生理过程。而MMPs在肿瘤的发生、发展过程中生长、浸润、转移、肿瘤血管新生和细胞凋亡中的关键作用已被确立。MMPs抑制剂的开发对于重要疾病包括癌症、神经退行性疾病如老年痴呆症、心血管疾病和各类炎症药物治疗具有广阔的前景。
锌离子金属蛋白酶还包括ADAMs(a disintegrin and metalloproteinase)蛋白水解酶。ADAMs又被称为MDC(metalloproteinase/disintergrin/cystein-rich)，是近年新发现的一类跨膜糖蛋白，目前人们已发现三十余种ADAMs。ADAMs在生物中分布很广，在多细胞动物中，如人、猪、大鼠、爪蟾、果蝇、线虫等的细胞、组织和器官，如脑、睾丸、睾、卵巢、乳腺、胎盘、小肠、结肠、心、肝、肺、骨、肌肉等处。尽管该家族成员尽管都含有相当保守的结构功能域，但是它们的组织分布、活性功能以及发挥的生物学作用各不相同。它们在在细胞外基质的水解、细胞一细胞和细胞-基质的粘连、细胞融合及信号传导等细胞活动中可能具有重要作用。该家族在精卵结合、神经发育、肌管形成、细胞的增殖与分化、胞外基质重建以及血管新生等多个生理过程中的重要作用。同时，ADAMs在肿瘤的发生、浸润和转移，老年痴呆症，关节炎以及心血管疾病等多个病理过程中也有关键的作用。
ADAM-TS(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motif)是最近新发现的一类锌离子金属蛋白酶现人们已发现二十余种。ADAM-TS在哺乳动物、果蝇、线虫等多种动物的组织都有中表达。ADAM-TS与ADAMs家族具有一些共同的结构特征，如蛋白质的氨基端依次含有信号肽、前导肽、金属蛋白酶区、去整合蛋白区及富含半胱氨酸区，但是，ADAM-TS不含表皮生长因子样重复域和跨膜域，代之以不同数目的I型凝血酶敏感蛋白(thrombospondin 1)重复结构。主要参与细胞外基质的降解、细胞与基质的粘附和组织器官的重构，在排卵、胚胎发育及结缔组织疾病、肿瘤等生理和病理过程中起着重要的作用。
对于已发现的ADAMs和ADAM-TS而言，其催化活性部位都包含Zn2+结合的HEXXH保守序列，这与MMPs的活性中心的结构相似。因此，MMPs的抑制剂，对于ADAMs和ADAM-TS也应有类似的作用。
MMP抑制剂开发是学术和工业研究的一个重要分支。在二十世纪九十年代末期，全球多家医药公司都对MMPs及其抑制剂的筛选表现出浓厚的兴趣，并且几种广谱的，小分子量的用于数种类型肿瘤的MMP抑制剂已被临床评估。虽然这些小分子药物在临床前的动物实验中，能高效的抑制MMP的活性，并有效阻止肿瘤的生长和转移，但是在临床上来治疗癌症的结果并不令人满意，最终导致了后期临床检验的失败。这主要是因为MMP家族的复杂性并没有被完全了解，这些抑制剂的特异性不强，对于其他种类的MMP的正常生理功能也起了不同程度的影响。以MMP为疾病的治疗靶点的概念是复杂的，因为MMP是维持正常生理环境所必需的，并且他们的功能多样化，具有重复性和背景依赖的表达与活性。尽管有着40年的研究历史，合成并测试了成千种化合物，只有一种胶原酶抑制剂(Periostat，doxycycline hyclate)通过美国FDA认证，并作为治疗牙周疾病药物。因此，寻求高效的、特异性强的MMP抑制剂是这个领域当前工作的重点，也是国内外开发抗肿瘤药物的热点。同时，由于MMPs和许多疾病密切相关，这些MMPIs今后极有可能用于治疗心血管疾病；关节炎；牙周疾病；多发性硬化症；炎症；疼痛；角膜溃疡；细菌性脑膜炎；糖尿病综合症；伤口愈合；肾病；神经退行性疾病；AIDS；疱疹；过敏症；子宫内膜异位症；骨质疏松；哮喘；可以用于器官移植；对受精过程和再生能力的控制；这些抑制剂还可以用于抗衰老；抗菌；作为细胞外基质/胶原产物，化妆品，美容产品的工业生产的添加剂。
发明内容
我们发现并证明了1，2，3-三羟基苯及其衍生物对锌离子金属蛋白酶有抑制作用。1，2，3-三羟基苯及其衍生物对锌离子金属蛋白酶的抑制作用具有普遍性和特异性。其中三个相邻的羟基是抑制的关键部位，并且这三个相邻的羟基必须是在苯环结构上，处于同一平面。我们进一步证明了1，2，3-三羟基苯对基质金属蛋白酶抑制的机理是竞争性抑制或竞争性优势抑制作用，一方面，本发明涉及式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制锌离子金属蛋白酶的药物中的应用，所述式I化合物是 其中R1，R2和R3独立的是氢原子，取代或未取代的C1-C18烷基，被一个或几个不连续O原子间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，或被-CO-、-COO-、-OCO-、-OCOO-、-CO-N(R4)-、-N(R4)-CO-、-N(R4)-CO-N(R4)-、-[N(R4)]2-CO-、-N(R4)-COO-间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，取代基独立的选自-OR5、-OCO-R5、-COO-R5、-N(R4)-R5、-N(R4)-CO-R5和-CO-N(R4)-R5；C2-C12链烯基或被一个或几个不连续O原子间隔的C2-C12链烯基；取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；-CO-OR4或-CO-N(R4)2；或者R1和R2，或R2和R3共同形成取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；R4和R5相互独立的是氢，C1-C18烷基，被一个或几个不连续O原子间隔的C2-C18烷基，C3-C12环烷基，C2-C18链烯基，取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基。
抑制锌离子金属蛋白酶的药物优选用于调节基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMs或ADAM-TS参与的生理及病理过程。其中基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMs或ADAM-TS参与的生理及病理过程优选血管新生，伤口愈合，器官移植，对受精过程和再生能力的控制，骨的重建或疼痛。
抑制锌离子金属蛋白酶的药物优选用于治疗和预防癌症，心血管疾病，关节炎，牙周疾病，多发性硬化症，炎症，角膜溃疡，细菌性脑膜炎，糖尿病综合症，肾病，神经退行性疾病，AIDS，疱疹，过敏症，子宫内膜异位症，骨质疏松、哮喘、抗衰老或抗菌。更优选用于治疗和预防癌症、心血管疾病或关节炎。
另一方面，本发明还提供了式I化合物或其盐在保健食品、化妆品或日常用品中作为添加剂用于抑制锌离子金属蛋白酶的应用。
式I化合物优选焦性末食子酸、末食子酸丙酯、单宁酸、杨梅黄酮、黄芩苷、末食子酸、五羟黄酮、野黄芩素、小木麻黄素、刺槐亭、栎草亭、杨梅苷、没食子酸月桂酯、没食子儿茶精、飞燕草甙元或苄丝肼。更优选焦性末食子酸。
焦性没食子酸(Pyrogallic acid) 3，4，5-三羟基苯甲酸丙酯(Propyl gallic acid)
没食子酸(Gallic acid) 杨梅黄酮(Myricetin) 黄芩苷元(Baicalein) 飞燕草甙元(Delphinidin)
野黄芩素(Scutellarein) 小木麻黄素(Strictinin) 刺槐亭(Robinetin) 栎草亭(Quercetagetin) 杨梅苷(Myricitrin)
没食子酸月桂酯(Lauryl gallate) 没食子儿茶精(Gallocatechol) 苄丝肼(Benserazide)
Methanone Rufigallol Tricetin 本发明的另一方面提供了用作锌离子金属蛋白酶抑制剂的药物组合物，包含式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
该药物组合物优选用于调节基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMs或ADAM-TS参与的生理及病理过程。基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMs或ADAM-TS参与的生理及病理过程优选血管新生，伤口愈合，器官移植，对受精过程和再生能力的控制，骨的重建或疼痛。
上述药物组合物优选用于治疗和预防癌症，心血管疾病，关节炎，牙周疾病，多发性硬化症，炎症，角膜溃疡，细菌性脑膜炎，糖尿病综合症，肾病，神经退行性疾病，AIDS，疱疹，过敏症，子宫内膜异位症，骨质疏松、哮喘、抗衰老或抗菌。更优选用于治疗和预防癌症，心血管疾病或关节炎。
本发明再一方面提供了具有抑制锌离子金属蛋白酶作用的保健食品、化妆品或日常用品组合物，包含式I化合物或其盐作为添加剂。
图1为酶谱分析柱状图。
具体实施例方式
下列实施例更详细地说明本发明，但是并不是要将本发明限定为实施例。
实施例1 1，2，3-三羟基苯及其衍生物对锌离子金属蛋白酶有抑制作用酶学实验步骤所用缓冲液体系为50mM HEPES(pH7.5)，with 0.2M NaCl，10mM CaCl2，and 0.05％Brij-35，所用的底物为DQ-Gelatin和P126；在室温条件下测定，反应总体积为100ml。在加有抑制剂时，酶与抑制剂应在缓冲液体系中孵育30分钟，然后再加底物测定。所有检测的仪器为FLX800荧光酶标仪(Bio-Tek)，对于DQ-Gelatin激发波长495nm，发射波长515nm，而对于P126，激发波长328nm，发射波长393nm。
测定反应时间为8分钟，取荧光值的点所组成的线的斜率为速度，其中未加抑制剂的记为V0，加抑制剂的为Vi，以Vi/V0表示抑制剂的抑制程度；然后以所加抑制剂的浓度为横坐标，以Vi/V0的值为纵坐标，做出相应曲线；在Vi/V0为0.5处所对应的抑制剂的浓度为IC50。
我们利用Dixon plot的方法对1，2，3-三羟基苯对MMP-2的抑制机理进行了检测以1，2，3-三羟基苯的浓度为横坐标，1/V为纵坐标，取三个不同的底物浓度，可作出三条直线；这三条直线的交点在Y轴正半轴和X轴负半轴之间，这说明其机理是竞争性或是以竞争性为主的抑制机理。我们进一步证明了1，2，3-三羟基苯对基质金属蛋白酶抑制的机理是竞争性抑制或竞争性优势抑制作用，见表1。
表1 1，2，3-三羟基苯及其几种衍生物对锌离子金属蛋白酶抑制的IC50(μM)
实施例2焦性没食子酸的抗肿瘤实验1.焦性没食子酸对HT1080肿瘤细胞粘附和伸展的抑制黏附实验将处于对数生长期的HT1080细胞经消化重悬以后，进行细胞计数，然后以103/孔的细胞密度传入24孔板中，加入指定量的焦性没食指酸，使每孔的药物终浓度依次为0μM，2μM，5μM，10μM，20μM，然后每孔加入1ml的10％FBS的DMEM培养基混匀后，放入37℃培养箱培养30min左右后取出，用孔板离心机1000转离心5min，然后吸去上清，在倒置显微镜下观察各孔里边黏附在孔板底部的细胞数量。
伸展试验将处于对数生长期的HT1080细胞经消化重悬以后，进行细胞计数，然后以104/孔的细胞密度传入24孔板中，加入指定量的焦性没食指酸，使每孔的药物终浓度依次为0μM，2μM，5μM，10μM，20μM，然后每孔加入1ml的10％FBS的DMEM培养基混匀，放入37℃培养箱培养，在细胞培养时间分别为30min，45min和60min的时候，利用倒置显微镜观察细胞的形态及生长情况。
肿瘤细胞的黏附和伸展与MMPs有关，实验结果证明不同浓度的1，2，3-三羟基苯对HT1080肿瘤细胞粘附和伸展有抑制作用。
2.焦性没食子酸对HT1080肿瘤细胞迁移的抑制先在24孔板中以104/孔的细胞密度培养HT1080细胞，待细胞生长到占底壁的80％左右的时候，将培养板取出，吸去上清液，用200μL的移液枪头在各培养板孔中划一条宽度相同的斜线，然后加入指定量的焦性没食指酸，使每孔的药物终浓度依次为0μM，2μM，5μM，10μM，20μM，并使每孔的培养基终体积为1mL，然后放入37℃的培养箱中，12h后观察培养板各孔中划线部分的填平情况。
肿瘤细胞的迁移与MMPs有关。不同浓度的1，2，3-三羟基苯对HT1080肿瘤细胞的迁移有抑制作用。
3.焦性没食子酸对HT1080肿瘤细胞浸润的抑制实验前需要将24孔培养板1个，Transwell小室数个，Matrigel，200uL枪头数个放于4℃冰箱中5小时以上，并用冰盒转移到超净台里面。实验时，先用预冷过的200μL的枪头加70μL/孔的Matrigel入Transwell中，一般分两次加入。将24孔板封好后，放入37℃培养箱20min左右并用10％FBS的DMEM培养基配置好终浓度为0μM，2μM，5μM，10μM，20μM的细胞悬液以备用(每份悬液中含大约106个HT1080细胞)。将凝胶后的24孔板取出，下部加入150μL/孔的NIH 3T3细胞上清作为趋化液，上部的Matrigel上加入已配好的细胞悬液。然后放入37℃的培养箱中培养2-3天，取出孔板除去Transwell小室上的Matrigel，用Giemsa染液将透膜细胞染色以后在倒置显微镜下观察各孔中透膜细胞数量的多少。
肿瘤细胞的浸润与MMPs有关。不同浓度的1，2，3-三羟基苯对HT1080肿瘤细胞的浸润有抑制作用。
4.焦性没食子酸对Hela、HT1080肿瘤细胞增殖的影响肿瘤细胞的增殖与MMPs有关。我们用MTT法测定不同浓度下的没食指酸对HT1080细胞的杀伤程度，实验方法如下将生长旺盛期的HT1080细胞，用10％FBS的DMEM培养基悬浊以后以104/孔的终浓度加入96孔板中，培养一天，待细胞贴壁生长达到底壁的70％，再换成2％血清(FBS)的培养基培养一天。然后将各孔按0μM，2μM，5μM，10μM，20μM的浓度给药。培养过夜，每孔加入20μl MTT后继续培养4h。小心吸去上清，每孔加入150μl的DMSO，轻轻振荡，使孔内形成的结晶紫充分溶解后，用酶标仪读出各孔在490nm下的OD值。
不同浓度的1，2，3-三羟基苯对Hela、HT1080肿瘤细胞增殖有抑制作用。1，2，3-三羟基苯对Hela、HT1080肿瘤细胞增殖的半数抑制浓度IC50分别为41.7μM和56.8μM。
5.焦性没食子酸体内抗肿瘤实验体内抗肿瘤实验在无菌条件下，抽取接种7~8d的H22肝癌腹水细胞，调细胞浓度为1×108/ml，每只小鼠左后肢皮下接种0.1ml，接种次日随机分组，每组12只，每天灌胃给药1次(按剂量给药)。连续给药10天，每3天称重1次，末次给药后次日脱臼处死小鼠，称瘤重，并按下式计算抑瘤率。
表2焦性没食子酸对小鼠H22荷瘤生长的抑制作用
焦性没食子酸在100mg/kg时对荷瘤小鼠H22肿瘤的抑制率为53％，说明焦性没食子酸具有体内抗癌活性。用药组和对照组瘤重有显著差异(P＜0.05>
实施例3特异性对抗MMP的药物治疗动脉粥样硬化一、动脉粥样硬化与MMPs动脉粥样硬化是急性心肌梗死和不稳定型心绞痛等临床综合征的病理基础，基质金属蛋白酶MMPs通过降解细胞外基质在心血管重塑中起到重要作用。MMPs表达既与内膜增厚、斑块的不稳定有关，也与再狭窄病变的形成有关。已检测出的动脉粥样硬化中表达上调的MMPs包括MMP-1，-2，-7，-9，-12。很多MMPs同动脉硬化损伤的基质重塑有关，例如MMP-1，-2，-3，-7，-9，-12，-13，-14。因此特异性对抗MMP的治疗药物的发展将有助于预防动脉粥样硬化发展、斑块破裂和再狭窄的形成。
1、动脉粥样硬化内膜增厚动脉粥样硬化可由内皮的化学或机械损伤启动，随即血中单核细胞通过转内皮渗透作用进入内膜，在那里他们激活或合成许多细胞因子和生长因子。相应于这些刺激，血管平滑肌细胞从中膜迁至内膜经历了增殖过程。基质降解是单核细胞与血管平滑肌细胞迁移的必要条件，因为细胞不得不穿越细胞外障碍，包括内皮下和环绕每个平滑肌细胞的基底膜。这些观察说明MMPs参与了内膜增厚的作用，特别是血管平滑肌细胞的迁移。
2、斑块稳定性不稳定斑块易导致冠脉内血栓形成和闭塞，触发急性冠脉综合征(ACS)。在动脉粥样硬化斑块中可检测到增强的MMPs表达，而MMPs可通过降解ECM导致斑块纤维帽的削弱，因此MMP家族的活动与斑块破裂有关。
3、再狭窄冠状动脉介入治疗(PCI)的发展为治疗缺血性心脏病提供了一个强有力的方法，但许多病人在几个月内症状再次发作，因为在原来的部位发生了再狭窄。这是由于中层血管平滑肌细胞的迁移和快速增长，产生内膜纤维细胞增生的特征病变。有报道在动物模型中球囊损伤上调了受损动脉明胶酶的表达。PCI扩张所致斑块中细胞外基质的降解便于循环血液和外源性凝血途径的激活与血管壁中的组织因子相接触，以及血管平滑肌细胞的迁移。这说明在冠状动脉增加的MMPs水平与血管平滑肌细胞的迁移和血栓形成所致的血管重塑和再狭窄有关。
二、动脉粥样硬化模型构建大鼠常用高脂饲养法，高脂饲养至少三个月，5％鸡蛋黄(富含胆固醇，捏碎)，10％猪油，0.2％甲硫氧嘧啶，1％胆固醇；3个月后，腹主动脉形成明显的斑块。用球囊损伤方法研究血管重构及再狭窄。
三、检测指标根据MMPs可能的作用机理，应用MMP抑制剂于大鼠的球囊损伤模型，考察MMP抑制剂对该病的影响，本实验是以大鼠的颈动脉为研究对象，造模后立刻开始腹腔注射刺槐亭300mg/kg，持续70天。相关检测指标如下1、内腔变窄和新内膜形成在造模后的不同天数时处死动物，取动脉片断，固定包埋切片，测量不同处理组的内腔变窄，新内膜形成，脉管损伤及重构的程度。内腔变窄从三个方面考虑绝对内腔横断面积(LA)；LA比率(LA比率＝LA损失/对照的内弹性膜面积，LAratio＝LA injury/IEL area of reference)；由新内膜形成的内腔横断面积变窄的比率＝(IELarea-LA)/IEL area。新内膜形成也用内膜到中间层的比例评价，即I/M ratio＝新内膜的绝对面积/中间层的绝对面积。
2、血管壁重构重构的程度通过球囊损伤部分总的血管壁面积(EEL AREA)与接连处没有损伤的标准部分的血管壁面积(EEL AREA)比率确定，即重构比率(remodeling ratio，RR)。血管壁面积(EEL AREA)是通过周长计算得到(A＝C2/4π)。缩窄性重构(阴性)RR＜0.95，扩大性重构(阳性)RR＞1.05。
3、酶谱分析大鼠处死后取颈动脉血管在缓冲液中冷冻保存，匀浆离心后测蛋白含量，并用等量的蛋白在明胶饱和的SDS-PAGE中分离，染色后用密度分析仪分析各条带的密度而表示酶活性。
四、结果分析1、内腔变窄和新内膜形成在给药后35天和70天，内腔面积和新膜面积以及内腔面积比率均有显著差异，而在给药后3天差异不明显(如表3)。
表3组织形态学数据
ap＝0.0001bp＝0.001cp＝0.01在动物球囊血管损伤后35、70天后，联合用药组和单独给药组与未给药得阳性对照组相比，绝对新内膜面积、I/M比率明显减小，内腔面积比率明显增加。在造模三个月后Movat染色可见与给药组相比有明显的内腔变窄和新膜形成。
2、血管壁重构由表1中重构比率的数据可以看出，在第3天、35天和70天，给药组与对照组的重构比率均有显著差异。由表2重构分类的数据可以看出，给药组与对照组相比，缩窄性重构明显减少，说明药物对血管重构的缩窄有抑制作用。
表4重构分类
3、酶谱分析球囊损伤后3天取大鼠的颈动脉进行酶谱分析，通过密度分析仪分析MMP-2带的相对密度。阳性对照组明显比3个给药组和阴性对照组大(如图1)。说明用药可以减少MMP的活性。
图1横坐标从左到右依次表示阳性对照组，三个不同剂量的给药组，以及阴性对照组。阳性对照组(100±13)明显比3个给药组(72±10，69±/12，35±5；P＜0.001)和阴性对照组(25±/3，P＜0.001)大。
五、结论应用MMP抑制剂于大鼠的动脉粥样硬化球囊损伤模型，以大鼠的颈动脉为研究对象，证明腹腔注射MMP抑制剂刺槐亭对此疾病有治疗和缓解作用。
实施例4外源性基质金属蛋白酶抑制剂治疗子宫内膜异位症的实验研究子宫内膜移位症是子宫内膜腺体浸润正常组织后发生的。子宫内膜移位症是一个浸润的过程。基质金属蛋白酶对于细胞外基质的重塑是必需的。基质金属蛋白酶参与正常的组织代谢周转，包括月经周期时的内膜破裂。充分证据表明金属蛋白酶和它们的组织抑制剂参与子宫内膜移位症的病理过程，与子宫内膜移位症的发展有关。目前发现的和子宫内膜移位症相关的金属蛋白酶和它们的组织抑制剂包括MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，TACE和TIMP-1，TIMP-3。本研究借助大鼠子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)模型，进行外源性基质金属蛋白酶抑制剂的治疗。通过治疗前后异位内膜病灶大小的变化了解外源性基质金属蛋白酶抑制剂对子宫内膜异位症的治疗效果。并通过检测抑制剂治疗组干预结束后3个月的血清性激素水平、肝肾功能及对重要脏器的影响，来了解该治疗方法的副反应及疾病的复发情况。为寻找治疗EMs新的有效药物奠定理论基础，为其临床治疗EMs提供理论依据。
外源性基质金属蛋白酶抑制剂为飞燕草甙元。
1.大鼠子宫内膜异位症模型的建立根据Vernon采用自体子宫内膜盆腔移植法，改进建立大鼠子宫内膜异位症动物模型。建模后四周，再次开腹，观察移植物的生长情况。EM模型建模成功肉眼观察标准移植灶体积增大，呈透明的结节状、囊状、有澄清液体积聚，移植物被结缔组织覆盖并有血管形成，质地软，作为大体判定标准。并取其异位病灶进行组织学观察。病理组织学观察可见移植的内膜存活，表面上皮增生呈柱状，腺体稀疏，腺腔形态欠规则，但仍可见腺上皮及间质细胞，腺上皮呈柱状、立方状或扁平状，部分可见核下空泡。间质致密，间质细胞小而稀疏。
建模成功后的大鼠随机分成五组，每组10只。实验组A为外源性抑制剂飞燕草甙元治腹腔注射，一日一次，共四周。C为外源性抑制剂飞燕草甙元治疗组150mg/kg，腹腔注射，一日一次，共四周。
对照组D为阳性对照组促性腺激素释放激素激动剂(LHRH-A)-那法瑞林0.1mg/kg，皮下注射，一日一次，共四周。E为阴性对照组0.9％生理盐水0.5ml/kg，腹腔注射，一日一次，共四周。
2.观测指标1)外源性抑制剂、那法瑞林对实验性子宫内膜异位症模型异位病灶体积的影响通过对各组大鼠治疗前后异位病灶体积变化的测定，结果显示治疗前各组异位病灶体积无显著性差异(P＞0.05)；而治疗后外源性抑制剂治疗组显示剂量为50mg/kg的作用较弱，剂量为100mg/kg、150mg/kg治疗组疗效较好。B、C治疗组和西药对照组异位病灶体积明显缩小或萎缩，抑制率明显升高，与模型组相比差异非常显著(P＜0.05)，外源性抑制剂治疗组异位病灶与西药对照组相比则无明显统计学意义(P＞0.05)，由此可见，外源性基质金属抑制剂、那法瑞林治疗EMs，其异位内膜生长受到了明显的抑制，而且外源性基质金属抑制剂与那法瑞林的抑制作用相似。
2)外源性抑制剂、那法瑞林对实验性子宫内膜异位症模型在位内膜及异位内膜的组织形态及超微结构的影响大体观察分别于各组大鼠给药前(术后4周时)和药物治疗后(给药后4周时)测量子宫分叉处、卵巢及腹壁等处异位内膜的长、宽、高，计算其总体积(V1、V2)，计算各组药物对异位内膜的抑制率。
各组动物处死后，打开腹腔见模型组大鼠腹腔内粘连广泛，10只鼠均可见移植物，约1-5mm3大小不等，有的为含血性液的囊性小泡，有的为含无色液呈透明状的囊性小泡，有的呈囊实性，有3只大鼠移植物与大网、肠管、子宫、盆腔腹膜广泛粘连，形成团块，有2只大鼠移植物表面形成结缔组织包裹，有1只异位病灶缩小，萎缩。外源性抑制剂治疗组大鼠腹腔内粘连很少，腹壁及分叉处病灶均都萎缩(其内未见液体)，80％移植物已消失，仅呈痕迹，双侧卵巢移植物明显缩小50％-70％，有3只出现了1-3mm3左右的白色质硬结节。那法瑞林组大鼠腹腔内移植物吸收好，有的明显缩小，有的已消失，与外源性抑制剂治疗组类似。正常对照组(假手术组)见盆腔结构完整，仅有一例出现肠系膜与腹壁切口处轻微粘连，但易于分离。
光镜观察石蜡切片经HE染色可见①正常大鼠子宫内膜粘膜上皮完整，上皮细胞为高柱状或柱状，粘膜层内间质细胞分布均匀，腺体数量多，腺腔完整，腺上皮细胞多为柱状，可见到核下空泡和顶将分泌。
②模型组可见移植的内膜存活，上皮细胞明显增生，呈柱状、立方状或扁平状，部分可见到核下空泡和顶浆分泌，表现出与在位子宫内膜接近同步的周期改变，间质细胞小而稀疏，生长不活跃，腺体数量减少，有的腺体形态改变，呈缝隙状，有的腺腔极度扩大，有乳头状突起，有的腺腔中可见到含铁血黄素细胞及泡沫细胞，有的腺体消失，血管丰富。
③外源性抑制剂治疗组在位内膜组织腺腔形态改变，但腺体结构完整，腺上皮排列整齐，间质致密；异位内膜组织呈缝隙状改变，表面上皮短立方状，上皮细胞排列紊乱，内膜腺体减少，腺上皮萎缩，表面血管减少，间质细胞小而稀疏。
④那法瑞林治疗组在位内膜组织腺体形态改变，有的扩张如球形，有的萎缩无腺腔，上皮细胞不完整；异位内膜组织上皮细胞变性、坏死，囊肿囊腔缩小，囊壁变薄，腺体数目减少，腺腔小，腺上皮略有萎缩。
3.结论应用MMP抑制剂在大鼠子宫内膜异位症模型中，证明腹腔注射MMP抑制剂飞燕草甙元对此疾病有治疗和缓解作用。
实施例5基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂在兔骨关节炎模型中的应用骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是关节软骨的变性，破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，是我国最常见的关节性疾病，也是引起老年人疼痛和残疾的主要原因之一。其发病机制尚不清楚，但关于其软骨降解的机制已得到多方面阐述。OA治疗的基本目的是缓解症状，改善功能，延缓进展及矫正畸形，对OA应着眼于早诊断、早治疗、长疗程，即在患者出现轻度症状时就应采用综合治疗。多种MMPs对关节软骨细胞外基质有降解作用，使关节软骨基质结构改变，抗外力作用下降，最终导致关节软骨进行性破坏。因此应用MMP抑制剂治疗骨关节炎是实现软骨保护以延缓病情发展的重要手段。
<实验进度>
第一周24只大耳白兔分别行ACL手术。
第三-五周动物随机分成三组，分别为A组(关节腔注射生理盐水)，B组(关节腔注射100mg/ml野黄芩素溶液)，C组(关节腔注射100mg/ml五羟黄酮溶液)。
六周后处死。进行临床表现观察，大体观察，病理学观察，统计学分析。
<模型建立>
将模兔用3％戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉注射麻醉，仰卧于手术台上固定，右膝关节局部脱毛，备皮，消毒，铺巾，严格无菌操作。取膝关节内侧长约4cm的纵切口，探查关节腔内无原发病变后切断内侧副韧带，进一步切除内侧半月板和前后交叉韧带，注意勿损伤关节软骨面，彻底止血，冲洗关节腔，行抽屉实验阳性后，逐层缝合关节囊，皮下，皮肤，无菌敷料包扎伤处，不予固定。术后每天肌注青霉素20万U，伤口换药，连续七天以预防感染。根据临床上超疲劳活动量提前出现OA的发病特点，手术后1周，每天强迫动物活动30分钟，分两次驱赶，4周后即获得稳定的OA模型。
<骨关节炎临床表现的观察>
于第六周给药结束后，用Lequesne MG的膝关节临床评估级别进行评估。
①局部疼痛刺激反应用手指挤压膝关节，按刺激反应程度不同分为4级。
I级无异常疼痛反应；II级患肢收缩；III级患肢收缩、痉挛，伴轻度全身反应，如周身颤抖，回头舔吮等；IV级患肢剧烈收缩、痉挛，全身颤抖，乱窜、挣扎。
②步态改变按患肢行走、奔跑时的步态分为4级。
I级患肢无跛行，跑动正常，蹬地有力；II级患肢奔跑时轻度跛行，蹬地有力；III级患肢参与行走，但跛行明显；IV级患肢不能参与行走，不能触地、蹬地。
③关节活动范围按患肢膝关节活动范围分为4级(伸直为0°)。
I级90°以上；II级45°～90°；III级15°～45°；IV级15°。
④关节肿胀按膝关节肿胀程度分为3级I级无肿胀，骨性标记清楚可见；II级轻度肿胀，骨性标记变浅；III级明显肿胀，骨性标记消失。
表5 3组兔膝关节骨关节炎临床表现评分结果(n＝8)
以上4组指标，A组分别与B组、C组相比，p＜0.01。
<大体观察>
手术6周后处死大白兔，观察膝关节有无关节积液和滑膜肿胀充血，并于解剖显微镜下观察股骨髁关节面的病理改变，按以下原则评分0分，关节面光整，色泽如常；1分，关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2分，关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；3分，关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；4分，软骨剥脱，软骨下骨质暴露。
上表数据，A组与B组、C组相比，在p＜0.05水平上有显著差异。
<组织学评价>
10％福尔马林固定的膝关节在脱钙剂中脱钙大约一周。脱钙完全后膝关节在前沿平面中横断，因此中间的和侧面的循环得以保持，且两个半边在石蜡中包埋。初级的切片以150μm的间隔用两步切断。这些切片以甲苯胺蓝染色，光镜下观察，用于评价软骨破坏和骨赘形成。软骨破坏用如下系统评价1＝只有最小表面区域，2＝轻微扩展到中上部区域，3＝适当地深入中间的区域，4＝标志到深部区域但不是高潮，5＝严重的完全增厚退化到高潮。软骨破坏的数量根据组织学部分表面的1/3、2/3或3/3确定，以上的分数分别乘以1、2或3，以分别反应参与的胫骨板的范围。骨赘用一个目镜千分尺测量的大小评分1、2或3分别为轻度的、中度的或严重的。
上表中数据A组与B组、C组相比，在p＜0.05水平上有显著差异。
<结论>
应用MMP抑制剂于在兔骨关节炎模型中，证明关节腔注射MMP抑制剂野黄芩素和五羟黄酮溶液对此疾病有治疗和缓解作用。
权利要求
1.式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制锌离子金属蛋白酶的药物中的应用，所述式I化合物是 其中R1，R2和R3独立的是氢原子，取代或未取代的C1-C18烷基，被一个或几个不连续O原子间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，或被-CO-、-COO-、-OCO-、-OCOO-、-CO-N(4)-、-N(R4)-CO-、-N(R4)-CO-N(R4)-、-[N(R4)]2-CO-、-N(R4)-COO-间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，取代基独立的选自-OR5、-OCO-R5、-COO-R5、-N(R4)-R5、-N(R4)-CO-R5和-CO-N(R4)-R5；C2-C12链烯基或被一个或几个不连续O原子间隔的C2-C12链烯基；取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；-CO-OR4或-CO-N(R4)2；或者R1和R2，或R2和R3共同形成取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；R4和R5相互独立的是氢，C1-C18烷基，被一个或几个不连续O原子间隔的C2-C18烷基，C3-C12环烷基，C2-C18链烯基，取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基。
2.如权利要求1所述的应用，其中抑制锌离子金属蛋白酶的药物用于调节基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMs或ADAM-TS参与的生理及病理过程。
3.如权利要求2所述的应用，其中基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMs或ADAM-TS参与的生理及病理过程是血管新生，伤口愈合，器官移植，对受精过程和再生能力的控制，骨的重建或疼痛。
4.如权利要求1所述的应用，其中抑制锌离子金属蛋白酶的药物用于治疗和预防癌症，心血管疾病，关节炎，牙周疾病，多发性硬化症，炎症，角膜溃疡，细菌性脑膜炎，糖尿病综合症，肾病，神经退行性疾病，AIDS，疱疹，过敏症，子宫内膜异位症，骨质疏松或哮喘。
5.如权利要求1所述的应用，其中抑制锌离子金属蛋白酶的药物用于治疗和预防癌症、心血管疾病或关节炎。
6.如权利要求1所述的应用，其中抑制锌离子金属蛋白酶的药物用于抗衰老或抗菌。
7.式I化合物或其盐在保健食品、化妆品或日常用品中作为添加剂用于抑制锌离子金属蛋白酶的应用，所述式I化合物为 其中R1，R2和R3独立的是氢原子，取代或未取代的C1-C18烷基，被一个或几个不连续O原子间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，或被-CO-、-COO-、-OCO-、-OCOO-、-CO-N(R4)-、-N(R4)-CO-、-N(R4)-CO-N(R4)-、-[N(R4)]2-CO-、-N(R4)-COO-间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，取代基独立的选自-OR5、-OCO-R5、-COO-R5、-N(R4)-R5、-N(R4)-CO-R5和-CO-N(R4)-R5；C2-C12链烯基或被一个或几个不连续O原子间隔的C2-C12链烯基；取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；-CO-OR4或-CO-N(R4)2；或者R1和R2，或R2和R3共同形成取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；R4和R5相互独立的是氢，C1-C18烷基，被一个或儿个不连续O原子间隔的C2-C18烷基，C3-C12环烷基，C2-C18链烯基，取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基。
8.如权利要求1至7中任一项所述的应用，其中式I化合物是焦性末食子酸、末食子酸丙酯、单宁酸、杨梅黄酮、黄芩苷、末食子酸、五羟黄酮、野黄芩素、小木麻黄素、刺槐亭、栎草亭、杨梅苷、没食子酸月桂酯、没食子儿茶精、飞燕草甙元或苄丝肼。
9.如权利要求1至7中任一项所述的应用，其中式I化合物是焦性末食子酸。
10.用作锌离子金属蛋白酶抑制剂的药物组合物，包含式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂， 其中R1，R2和R3独立的是氢原子，取代或未取代的C1-C18烷基，被一个或几个不连续O原子间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，或被-CO-、-COO-、-OCO-、-OCOO-、-CO-N(R4)-、-N(R4)-CO-、-N(R4)-CO-N(R4)-、-[N(R4)]2-CO-、-N(R4)-COO-间隔的取代或未取代的C2-C18烷基，取代基独立的选自-OR5、-OCO-R5、-COO-R5、-N(R4)-R5、-N(R4)-CO-R5和-CO-N(R4)-R5；C2-C12链烯基或被一个或几个不连续O原子间隔的C2-C12链烯基；取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；-CO-OR4或-CO-N(R4)2；或者R1和R2，或R2和R3共同形成取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基；R4和R5相互独立的是氢，C1-C18烷基，被一个或几个不连续O原子间隔的C2-C18烷基，C3-C12环烷基，C2-C18链烯基，取代或未取代的C6-C20的芳基，或是取代或未取代的C4-C20的含O、S或N的杂芳基，取代基独立的选自羟基、卤素、O、S、C1-C8烷基、C1-C8烷硫基、C1-C8烷氧基、C6-C20的芳基、C4-C20的含O、S或N的杂芳基、C6-C20的芳基氧基和C4-C20的含O、S或N的杂芳基氧基。
全文摘要
本发明公开了1，2，3－三羟基苯及其衍生物或其药学上可接受的盐用于对锌离子金属蛋白酶的抑制作用(式I)。这些化合物被用来作为锌离子金属蛋白酶(例如，MT1－MMP，明胶酶A，B和胶原酶，matrilysins，金属弹性蛋白酶，stromelysin－1)的有效的选择性抑制剂。这些抑制剂可以被用来调节基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMs、ADAM－TS参与的许多生理及病理过程，例如血管新生，伤口愈合，器官移植，对受精过程和再生能力的控制，骨的重建，疼痛等；可以用来治疗癌症，心血管疾病，关节炎，牙周疾病，多发性硬化症，炎症，子宫内膜异位症，角膜溃疡，细菌性脑膜炎，糖尿病综合症，肾病，神经退行性疾病，AIDS，疱疹，过敏症，子宫内膜异位症，骨质疏松，哮喘等。另外，这些抑制剂还可以用于抗衰老；抗菌；作为细胞外基质/胶原产物、化妆品、美容产品的工业生产的添加剂。这些抑制剂可以用在人，动物以及其他生物体上。
文档编号C07D311/30GK1837169SQ200610065730
公开日2006年9月27日 申请日期2006年3月14日 优先权日2006年3月14日
发明者房学迅, 姬海涛, 金峰海, 柳森, 牛凤兰, 史秀娟, 王会铃, 桑清湘, 曹强, 李惟, 王玉宏 申请人:房学迅