技术领域本发明属于生物技术制药领域，涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白POP，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其在制备疫苗和检测试剂盒中的应用。
背景技术：
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，为非发酵菌中的假单胞菌属，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，在医院病房及医疗器械中也普遍存在，是临床上最为常见的条件致病菌之一。目前在全球范围内，该菌已成为ICU病房、烧伤、战创伤感染，机械通气相关肺炎(VAP)分离率最高的病原菌之一。PA感染可发生在人体任何部位和组织，如烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等，也可引起心内膜炎、胃肠炎、肺炎甚至败血症等全身感染，全身感染死亡率超过20％。此外，由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。中国CHINET2005--2012年连续监测资料显示，PA对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0％、42.8％、35.8％、30.5％、30.5％、30.8％、29.1％和29.1％，对美罗培南的年度耐药率分别为32.0％、34.1％、28.5％、24.5％、25.2％、25.8％、25.0％和27.1％，但其中泛耐药(PDR-PA)菌株数量显著增多，在2011年和2012年分别达到1.8％和1.5％(铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识，中华结核和呼吸杂志，2014年1月37卷1期)。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫，从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择。基因工程亚单位疫苗通过基因工程的手段，将病原体的致病因子或其突变体的基因克隆至的蛋白表达载体，重组子在工程菌内进行大规模表达，经过纯化后制备成基因工程亚单位疫苗。该疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等有点，已成为疫苗研发的重要方向。研发基因工程疫苗的关键是筛选到良好的保护性抗原分子。铜绿假单胞菌的III型分泌系统是由20多个蛋白质组成的注射器样的大复合物，能够将一些毒力因子(如ExoU、ExoS、ExoY、ExoT等)及其它效应蛋白直接注入宿主细胞，引起宿主细胞损伤从而在细菌感染性疾病中发挥重要作用。PcrV是铜绿假单胞菌III型分泌系统的重要组件之一，它能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”，是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件(TeiiiS.等，CriticalCare2014)。鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。抗PcrV的多克隆抗体、单克隆抗体都能够抑制III型分泌系统的分泌，保护机体受到铜绿假单胞菌的入侵(Sawa，T.等.NatMed1999，Milla，C.E.等PediatrPulmonol2014，Frank，D.W.等JInfectDis2002，Baer，M.等InfectImmun2009。同样PcrV也是重要的候选疫苗分子，但由于其本身能够形成同源多聚体等原因，目前还未见有可溶性重组表达该蛋白单体的报道。OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(outermembranelipoprotein)，其位于铜绿假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。OprI蛋白在铜绿假单胞菌中高度保守，已经有研究将其作为铜绿假单胞菌的诊断靶点(Saint-OngeA等JGenMicrobiol.1992，DeVosD等JClinMicrobiol.1997，QinX等JClinMicrobiol.2003)。虽然OprI仅含有83个氨基酸，但是OprI具有良好的免疫原性和免疫保护性。OprI单独运用或与其它保护性抗原联合应用时能够诱导有效的免疫应答，有效抵抗铜绿假单胞菌的感染(Baumann，U.等Vaccine2004，Knapp，B.等Vaccine1999，Mansouri，E.等InfectImmun1999，Toth，A等.Vaccine1994，vonSpecht，B.U等.，InfectImmun等1995，vonSpecht，B.U等.，Vaccine1996，Weimer，E.T.等，Vaccine2009，Weimer，E.T.等，InfectImmun2009，Westritschnig，K等.HumVaccinImmunother2014)。鉴于OprI的这些性质，该蛋白可以作为良好的基因工程疫苗候选抗原。PilA蛋白为铜绿假单胞菌的IV型菌毛，在细菌的运动，与宿主细胞的粘附以及在组织的主动入侵过程中发挥重要作用(HahnHP.Gene1997.)。在肺炎动物模型和角膜炎动物模型上发现PilA蛋白的缺失导致其侵袭力和毒力明显下降(HazlettLD等，CurrEyeRes1991)。同时抗pilA的抗体能够抑制铜绿假单胞菌与上皮细胞的粘附(DoigP，等，Infect.Immun.1990)。重组表达的PilA蛋白免疫小鼠后能够有效的激发细胞免疫应答和体液免疫应答，并在烧伤感染模型中具有部分的保护效果(KorpiF等，JMicrobiolBiotechnol.2015)。这些资料显示PilA是一个良好的保护性抗原。
技术实现要素：
本发明的发明人在研究中发现，将铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)通过连接肽与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白(OprI)连接形成的重组蛋白激发机体产生更好的识别铜绿假单胞菌的抗体，有利于铜绿假单胞菌的诊断和治疗。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：一种重组蛋白，所述重组蛋白由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白PcrV片段、铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI片段以及铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段依次通过连接肽(linker)连接形成，所述重组蛋白具有通式：PcrV片段-(LinkerA)m-OprI片段-(LinkerB)n--PilA片段(POP)；其中，所述LinkerA和LinkerB序列分别独立地选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个，优选为GGGGS；m和n分别独立地取值为1、2、3或4，优选为1。在根据本发明的一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)的片段的氨基酸序列为SEQIDNO：3。在根据本发明的一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(OprI)的片段的氨基酸序列为SEQIDNO：4。在根据本发明的一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段的氨基酸序列为SEQIDNO：5。在根据本发明的一个实施方案中，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2。在根据本发明的一个实施方案中，所述重组蛋白是由核苷酸序列为SEQIDNO：1的DNA编码的。本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码权利要求1～6所述的重组蛋白的核苷酸序列形成；优选地，所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体；更优选为pGex-6P-2。进一步地，本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，所述方法包括：1)构建上述的表达载体；2)将步骤1)得到的表达载体转化至宿主菌，得到含有表达载体的宿主菌；3)诱导步骤2)得到的含有表达载体的宿主菌表达重组蛋白；4)提取并纯化得到重组蛋白。在根据本发明的一个实施方案中，所述宿主菌选自大肠杆菌XL1-blue、BL21或HMS174菌株中的一种，优选为大肠杆菌XL1-blue菌株。更进一步地，本发明还提供了上述重组蛋白在制备用于诊断、预防或治疗铜绿假单胞菌的药物中的应用；优选地，所述药物为用于诊断铜绿假单胞菌的试剂盒；优选地，所述药物为用于预防或治疗铜绿假单胞菌的亚单位疫苗。由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：1)本发明的POP重组蛋白的表达质粒在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达；2)选择pGEX载体系列时，POP重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的POP重组蛋白纯度大于95％；3)POP重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫保护效果。利用本发明的POP重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组蛋白疫苗具有良好的抗PA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。附图说明图1为重组质粒pGex-6P-2-POP的双酶切鉴定结果；其中，泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-POP经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约1400bp。图2为蛋白POP诱导鉴定结果；其中，泳道1：结合诱导表达的超声上清的GST填料；泳道2：经PP酶酶切后的上清；泳道3：经PP酶酶切后的GST填料；泳道4：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd。图3为纯化后的蛋白POPSDS-PAGE电泳结果；其中，泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：纯化的POP蛋白。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1重组质粒的构建与鉴定1.设计序列如SEQIDNO：1所示的编码POP重组蛋白DNA序列，所述DNA序列的合成和序列与pGEX-6p-2的连接由上海生工生物工程有限公司合成。2.重组质粒的转化重组质粒的转化从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞(上海超研生物科技有限公司)，第一管加入pGEX-6P-2质粒(GEHealthcareLifeSciences)，作阳性对照；第二管加入1ulPOP合成质粒；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μlLB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μl上清，再重悬菌体，取200μl涂布于，Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。2.双酶切鉴定取37℃摇床培养过夜的阳性质粒，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamHI(Takara公司)和Xhol(Takara公司)进行酶切，37℃水浴半小时。体系如下：试剂体积(ul)plasmidDNAo3NdeI0.5XhoI0.510×buffer(H)1ddH2O5totalvolume10灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含EB(上海俊晟生物科技有限公司)0.5ug/ml，将上述酶切反应体系中各加入1μl6×Loadingbuffer，通过凝胶80V电泳20min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约4000bp为表达载体pGEX-6P-2部分，小片段约1400bp，为插入的编码POP的片段(图1)。实施例2重组融合蛋白POP在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定1.POP诱导表达取过夜培养的pGEX-6P-2-POP/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp+抗性的LB培养基中，180rpm37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mLlysisbuffer(20mMPB，pH7.2，250mMNacl)混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心15min，分离上清和沉淀。2.处理上清取GlutathioneSepharose4B20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入GlutathioneSepharose4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的GlutathioneSepharose4B加入20μL2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。3.处理沉淀在沉淀中加入500μLPBS重悬菌体，取80μL重悬菌液加入20μL5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。4.SDS-PAGE电泳将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，PGEX-6P-2-POP/XL-1blue在30℃为可溶性蛋白(图2)。实施例3POP抗原的制备1.放大培养获取蛋白取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-POP/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm37℃培养5～6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时，加入80μLIPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加20mLlysisbuffer(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的GlutathioneSepharose4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取序列为SEQIDNO：2的POP目的蛋白向余下约800μL已结合蛋白的GlutathioneSepharose4B中加入800μLPBS和120μLPreScissionprotease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μLPBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的POP蛋白分子量在55-40kDa之间，与预期蛋白分子量大小相符合，见图3。实施例4铜绿假单胞菌感染肺炎小鼠模型的构建1.铜绿假单胞菌菌液制备取冻存的铜绿假单胞菌临床株XN-1(保藏号为CCTCCNO:M2015730，分类命名为：铜绿假单胞菌XN-1，拉丁文名称：PseudomonasaeruginosaXN-1，保藏时间：2015.12.9；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地点：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，采用LB营养琼脂平板复苏，37℃需氧培养过夜。挑取单个菌落接种20mLLB液体培养基，37℃需氧180rpm振荡培养15h后，取0.2mL接种于20mLLB液体培养基中，37℃需氧230rpm振荡培养6h。6000g离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后用生理盐水重悬浮菌体。采用分光光度计测定菌液的OD600值，并按照1OD＝6.0×109CFU/ml将其换算成细菌浓度。2.小鼠麻醉及滴鼻方案的建立在铜绿假单胞菌肺炎模型的感染实验中，为保证滴鼻过程的顺利进行，首先采用异氟烷将小鼠麻醉。麻醉方法：以氧气为输送载体以5％浓度的异氟烷进行吸入诱导麻醉，待小鼠进入外科深麻醉期后，以3％的浓度维持麻醉，这种方式可以达到较好的麻醉效果。滴鼻剂量的控制是模型稳定性的保证，为了更好的控制滴鼻剂量，同时防止滴鼻过程中菌液进入口腔和产生气泡，采取了以下措施：(1)由于鼻咽部有一个生理弧度，头仰得越厉害，滴鼻液越容易进入口腔，所以滴鼻过程中小鼠头部仰卧幅度不能超过鼻咽部的生理弧度；(2)顺鼻腔外侧壁滴药，尽可能减少滴鼻过程中气泡的产生；(3)把握好滴鼻的节奏，在小鼠吸气开始的瞬间滴加4μL以下量；(4)本实施例中滴鼻量为20μL，单侧鼻孔一次连续滴入。3.感染剂量的确定采用生理盐水将实施例1获得的PAXN-1菌液调节至五种不同浓度，将实验动物雌性BALB/c小鼠随机分为5组，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染剂量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。动物的分组和感染情况如表1所示。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。表1：铜绿假单胞菌肺炎模型感染剂量的确定组滴鼻剂量(CFU)数量浓度(CFU/ml)滴入量(μl)1PAXN-16*108103*1010202PAXN-13*108101.5*1010203PAXN-11.5*108107.5*109204PAXN-17.5*107103.75*109205PAXN-13.75*107101.88*109206生理盐水-10-20采用不同浓度(2倍梯度稀释)的铜绿假单胞菌菌株PAXN-1感染BALB/c小鼠时，经过7天的观察，结果如图1所示：感染量为1.5×108CFU时小鼠死亡率为40％，感染量为3.0×108CFU时小鼠死亡率为80％，感染量达到6.0×108CFU时小鼠死亡率100％。确定小鼠感染的优选剂量为3.0×108CFU。实施例5动物的免疫1)首次免疫，用PBS稀释POP抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；2)第二次免疫，第7天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；3)第三次免疫，第14天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上。实施例6：抗体的检测第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2a体液应答水平。1.制备液体1)包被液的配制：称取Na2CO31.6g，NaHCO32.9g，溶于1LddH2O，用PH计将pH调至9.6；2)封闭液的配制：1g牛血清V，溶于100mL抗体稀释液(1∶100)；3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1LddH2O，再加入500μLTween20，再用PH计将pH调至7.4；4)洗涤液的制备：同抗体稀释液5)显色液(TMB)，为天根公司产品；6)终止液(2MH2SO4)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mLddH2O中。2.ELISA检测POP重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价1)用包被液将纯化后的POP重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；4)将血清进行1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000等倍比稀释；5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤3遍，空干；6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1∶5000，制成抗体工作液；7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱40min，洗涤三遍，空干；8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；9)加入终止液(2MH2SO4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；10)结果判断：A样品/A阴性值≥2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1∶1000倍稀释)。结果：检测POP蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1∶1024000；免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的POP重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。实施例7：POP重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价POP末次免疫后10～14天，采用与实施例5相同的方法，用生理盐水将准备PAXN-1菌液并调节浓度至1.5×1010CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。表2POP重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果表2显示：阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为10％和20％，重组融合蛋白POP加Al(OH)3佐剂组的平均免疫保护率为85％。因此，本发明的POP重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PAXN-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染铜绿假单胞菌、确定预后等。本领域技术人员可以将本发明的POP重组蛋白用于其他任何适用的用途。尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。