一株枯草芽孢杆菌工程菌及其应用的制作方法

文档序号:11125949阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于D-核糖生产的枯草芽孢杆菌工程菌,其特征在于,所述工程菌为枯草芽孢杆菌SFA-H43菌株中转酮酶基因替换为SEQ ID NO.7所示基因序列后获得的工程菌。

2.一种用于D-核糖生产的枯草芽孢杆菌工程菌,其特征在于,枯草芽孢杆菌SFA-H43菌株中转酮酶基因终止密码子前500bp序列,替换为枯草芽孢杆菌SFR-4菌株的转酮酶基因终止密码子前500bp序列获得的工程菌。

3.一株用于D-核糖生产的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌SFR-43T,该菌株于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:湖北省武汉市武昌珞珈山,保藏号为:CCTCC M 2016666。

4.一种用于D-核糖生产的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,通过同源重组的方法,将枯草芽孢杆菌SFA-H43菌株中转酮酶基因替换为SEQ ID NO.7所示基因。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,SEQ ID NO.7所示基因序列源自枯草芽孢杆菌SFR-4菌株。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,同源重组的方法中,枯草芽孢杆菌SFA-H43菌株中转酮酶基因终止密码子前500bp序列替换为枯草芽孢杆菌SFR-4菌株的转酮酶基因终止密码子前500bp序列。

7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述工程菌的构建方法为:

(1)以菌株SFR-4基因组为模板,扩增该菌株转酮酶基因终止密码子前500bp片段,称为L-tkt,其中下游引物含有质粒p7Z6的lox71-zeo-lox66片段前端25bp互补序列;优选的,所用引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;

(2)以菌株SFA-H43基因组为模板,扩增其转酮酶基因下游500bp片段,为R-tkt,其中上游引物含有质粒p7Z6的lox71-zeo-lox66末端25bp互补序列;优选的,所用引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;

(3)以质粒p7Z6为模板,扩增携带有lox位点的博来霉素抗性基因片段lox71-zeo-lox66;优选的,所用引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示;

(4)采用融合PCR方法,将L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt融合;优选的,融合PCR所用引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示;

(5)将融合片段转化菌株SFA-H43,通过博来霉素抗性平板筛选整合型重组突变菌株,获得含有菌株SFR-4转酮酶突变位点的菌株SFA-H43的工程菌株,并采用Cre/lox系统方法敲除工程菌株中的抗性基因zeo,获得不带抗生素抗性基因的安全转酮酶突变工程菌株,命名为SFR-43T。

8.权利要求1-3任一项所述工程菌在发酵生产D-核糖和/3-羟基丁酮中的应用。

9.一种利用权利要求1-3任一项所述工程菌发酵生产D-核糖和/3-羟基丁酮的方法,其采用如下的摇瓶发酵和/发酵罐发酵方式:

(1)菌种培养:将工程菌株活化后接种到种子培养基培养,获得一级种子和/二级种子;

(2)摇瓶发酵:将步骤(1)培养好的一级种子接种到装有发酵培养基的摇瓶中,摇瓶培养至发酵液中D-核糖含量不再增加,结束发酵;

(3)发酵罐发酵:将步骤(1)培养好的一级或二级种子接种到发酵罐中,进行通风搅拌培养,培养过程中,控制pH,通过调节搅拌转速和通风比,控制溶解氧进行发酵。

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,

步骤(1)中菌种培养为:取35-40℃培养2-3天工程菌株的新鲜斜面,用接种环取1-2环斜面菌种,接种到50ml液体种子培养基中,35-40℃,150-200rpm,摇瓶培养10-16小时,是为一级种子;将一级种子以1-10%的(体积百分数)接种种子培养基,35-40℃培养6-12小时,是为二级种子;

或者,步骤(2)摇瓶发酵:将步骤(1)培养好的一级种子以1-10%(体积百分数)的接种量接种到装有发酵培养基的摇瓶中,35-40℃、180-220rpm,摇瓶培养至发酵液中D-核糖含量不再增加,结束发酵;

或者,步骤(3)发酵罐发酵:将步骤(1)培养好的一级或二级种子以1-10%(体积百分数)的接种量接种到发酵罐中(65-75%的装液量),35-40℃进行通风搅拌培养,培养过程中,控制pH在5-7,通过调节搅拌转速和通风比,保持发酵液中相对溶解氧浓度5-30%;

优选的,斜面培养所用的斜面菌种培养基的组成为:酵母浸提物5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 3g/L,琼脂20g/L,其余为水,pH7.0-7.2;

优选的,液体一级种子培养基的组成为:葡萄糖20-40g/L,酵母浸提物2-10g/L,玉米浆8-12g/L,pH 7.0-7.2;

优选的,二级种子培养基的组成为:葡萄糖30-60g/L,酵母浸提物2-10g/L,玉米浆8-12g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,pH 7.0-7.2;

优选的,摇瓶发酵培养基组成为:葡萄糖120-150g/L,酵母浸提物2-10g/L,玉米浆5-15g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,MnSO4 0.2g/L,pH 7.0-7.2;

优选的,发酵罐发酵初始培养基组成为:葡萄糖120-150g/L,酵母浸提物3-6g/L,玉米浆5-10g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,MnSO4 0.2g/L,pH 6.0-7.2;

优选的,一级种子培养基培养的时间为12-14小时;

优选的,二级种子培养基培养的时间为6-8小时;

优选的,摇瓶发酵或发酵罐发酵的培养温度为36-38℃;

优选的,发酵罐发酵的pH控制在5.5-6.5;

优选的,发酵罐发酵的溶解氧浓度保持在20-30%;

更优选的,发酵培养基中葡萄糖130-150g/L,酵母浸提物3-6g/L,玉米浆6-10g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,MnSO4 0.2g/L,pH 7.0-7.2;

优选的,发酵罐发酵通过补料的方式提高发酵效率和增加发酵产率;

优选的,补料发酵,初始葡萄糖浓度为120-150g/L;

优选的,补料采用一次补料方式;

优选的,补料时间为发酵液中葡萄糖浓度降至20-40g/L;

优选的,补料量为40-60g/L葡萄糖;

优选的,补料葡萄糖浓度为600-800g/L,酵母浸提物0.5g/L。

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