上完全的立体选择性在腺苷的C3'处大于95原子％的2H并入的合成。David, S. 和 Eustache, J.，Carbohyd. Res. 1971，16,46 以及 David, S?和 Eustache，J.，Carbohyd. Res. 1971，20, 319描述了 2'-脱氧-2'（S)-氘代-尿苷和胞苷的合成。所述合成通过使用 1-甲基-2-脱氧-2' -(S)-氘代呋喃核糖苷进行。
[0023] Radatus,等，J. Am. Chem. Soc. 1971，93, 3086 描述了用于合成 2' -单氣化（R 或 S) _2'_脱氧胞苷的化学程序。这些结构是由在用氘化铝锂立体特异性还原2, 3-脱氢-己 P比喃糖并且氧化所得稀糖获得的选择性2-单氣化-2-脱氧-D-核糖合成的。Wong等J. Am. Chem. Soc. 1978,100, 3548报道了通过涉及形成的反应序列和LiAlD4还原烯酮二硫缩醛衍 生物，由D-阿拉伯糖获得-脱氧-1-氘代-D-赤型-戊糖、2-脱氧-2 (S)-氘代-D-赤型-戊 糖以及2-脱氧-1，2 (S)-二氣代-D-赤型-戊糖。
[0024] Pathak 等? J.，Tetrahedron 1986,42, 5427 报道了通过用 LiAlD4还原性打开适 当甲基2, 3-无水--D-呋喃核糖苷或-D-呋喃木糖苷，立体特异性合成所有八种2 '或 2"_氘代_2' -脱氧核苷。Wu等? J. Tetrahedron 1987,43, 2355描述了对于脱氧与核糖核 苷二者所有2'，2"_二氘代-2' -脱氧核苷的合成，其是由糖的C2'的氧化开始并且随后 似804或LiAlD 4用还原，接着用氘化三丁基锡脱氧。Roy等.J. Am. Chem. Soc. 1986,108,1675 报道了 2'，2" -二氘代-2' -脱氧鸟苷和胸苷可由2-脱氧核糖5-磷酸使用2-脱氧核糖 5-磷酸醛缩酶在2H20中制备，从而取得大约90原子％的氘化。
[0025] 因此，显然糖残基的各位置可选择性地进行标记。许多这些氘化核苷已用于关于 核苷和寡核苷酸的内部运动的固态 2H_NMR研宄，参见Hiyama等J. Am. Chem. Soc. 1989，111， 8609 ;Alam，T 和 Drobny，G.P.，Biochemistry，1990,29,3421 ;Alam 等，.Biochemistry， 1990, 29,9610 ;Huang 等，J. Am. Chem. Soc. 1990,112,9059 ;Drobny，G. P?等，Biochemistry， 1991，30,9229。在固态2H-NMR光谱法的温度依赖性线形分析中，2'对比2"标记的立体选 择性或氘化的水平不起显著作用。使用特异性地氘标记的核苷酸用于在溶液研宄中简化 1D和2D iH-NMR光谱对于结构信息并不是十分有用。然而，在ID NMR研宄中氘化的最广泛 使用是由Danyluk等进行的。这些工作人员以一种冗长的方式从在2H 20中生长的蓝绿藻 的RNA消化物分离预氘化的2H标记的单核苷酸（约90原子％的2H并入）。这些预氘化的 核苷区段然后用于获得多种多样的部分氘化的二聚体和三聚体，以用于在1D屯-匪1?光谱 中（200-300MHZ)共振分配目的。进行4'，5'，5"- 2H3-腺苷的合成，并且将其偶联至适当 阻断的腺苷3-亚磷酸，以得到ApA*(pA*4'，5'，5"-2H3-pA)。此二聚体允许磷与H-3'之 间的差异的明确测量（Kondo 等，Am. Cem. Soc. 1972,94, 5121 ;Kondo, Labeled Compel. 1973， 9,497 ;Ezra 等，Biochemistry，1975, 53, 213 ;Kondo 和 Danylik.，Biochemistry，1976,15， 3627 ;Lee 等，Biochemistry，1976,15, 3627 ;Ezra 等，Biochemistry，1977,16,1977。类似 地，可进行4'，5'，5"-2H3-鸟苷的合成以合成富含鸟苷的寡核苷酸。
[0026] 开发立体特异性氘化的可用替代方法以合成聚氘化糖。此方法在2H20中使用阮 内镍催化剂采用氢与氘在携带羟基的碳处的交换（即，携带羟基的碳的亚甲基和次甲基 质子）。详细研宄揭示了结构依赖性交换率差异、高水平的差向异构作用、显著较低程度 的脱氧以及氣化水平重现的难题（Balza等，Res.，1982,107, 270 ;Angyal等.〇31~13〇117(11\ Res. 1986,157,83 ;Koch 等? Res. 1978, 59, 341 ;Wu 等?J. Org. Chem. 1983,48,1750 ;以及 Angyal 等 Res. 1986,157,83)。
[0027] 各种技术可用于合成完全氘化的脱氧和核糖核苷。因此，在一种方法中，通过氘化 阮内镍_ 2H20与糖的交换反应，制备在2、3'以及4'位置特异性标记的许多氘化核苷。所述 程序由以下组成：通过阮内镍_ 2H20交换反应在甲基0 -D-吡喃阿糖苷的2、3以及4位进 行氘化，接着通过氘化三丁基锡还原性消除2-羟基，以得到甲基-D-2, 2'，3, 4-2H4-2-脱 氧吡喃核糖苷，将其转化成甲基0-D-2,2'，3,4- 2H4-2-脱氧呋喃核糖苷并且糖基化以 得到各种2, 2'，3,4-2H4-核苷（对于H3' &H4'，>97原子％的2H并入；对于H2和H2'， 约 94 原子 ％ 的 2H 并入）（Pathak, T.，Chattopadhyaya, J. Tetrahedron 1987, 43, 4227 ; Koch, H. J. , Stuart, R. S. , Carbohydr. Res. 1977, 59. C 1 ；Balza, F. , Cyr, N. , Hamer, G. K.，Perlin，A. S.，Koch，H.J.，Stuart，R. S.，Carbohydr. Res. 1977, 59, C7 ;Koch，H.J.,Stuart, R. S.,Carbohydr. Res. 1978, 64, 127 ；Koch, H.J.,Stuart, R. S.,Carbohydr. Res. 1978, 59, 341 ;Balza，F.，Perlin，A. S. Carbohydr. Res.，1982，107, 270 ;Angyal，S. J.,Odier, L. Carbohydr. Res.,1983, 123, 13. ；Wu, G.D.,Serianni, A. S.,Barker, R.J.,Org. Chem. 1983, 48, 1750 ;Angyal，S.J.，Stevens，J. D.，Odier，LCarbohydr. Res. 1986, 157, 83 ; Kline, P. C.,Serianni, A. S. Magn. Reson. Chem.,1988, 26, 120 ；Kline, P. C.,Serianni, A. S. Magn. Reson. Chem.，1990, 28, 324 ;Robins，M.J.，Wilson，J.S.，Hansske，F.，J.Am. Chem. Soc. 1983, 105,4059。
[0028] 甲基0 -D-赤型呋喃糖苷在用氘化阮内镍处理时产生甲基 0 -D-2, 3, 4⑶-2H3-赤型呋喃糖苷（约75原子％的2H并入在C2和C4⑶位置，并且100原 子％的咕并入在 C3) (Kline, P. C. ;Serianni，A. S. Magn. Reson. Chem.，1988, 26, 120)。将这 种糖转化成D-3, 4, 5(S)-2H3-核糖。这些核苷随后还原成对应的3'，4'，5'（S)-2H3-2'~脱 氧核苷（Koch, H. J. ;Stuart，R. S. Carbohydr. Res. 1978, 64, 127 ;Kline，P. C.，Serianni，A. S.，Magn. Reson. Chem.，1990, 28, 324)。类似于化合物 3'，4'，5'（S)」H3-核糖核苷， 1'，2'，3'，4'，5'，5"（S)-2H6-核糖核苷可由完全氘化且适当保护的核糖起始合成。
[0029] 发明概述
[0030] 基于寡核苷酸的治疗剂是合理药物设计方法的有力组成部分，并且许多寡核苷酸 当前已上市或处于各种临床试验阶段。过去已在脱氧糖以及嘌呤和嘧啶碱基的特定位置合 成氘修饰的核苷。已合成基于磷酸三脂技术或亚磷酰胺的氘化DNA合成子，并且将其用于 合成限定序列的寡核苷酸。这些研宄仅是针对DNA和RNA的构象研宄、确定酶辅助的催化 反应的活性位点的目的。然而，尚未针对在人体内的治疗性应用或作为生物或生物化学试 剂可引出的作用来研宄氘化寡核苷酸。
[0031] 本发明描述了氘标记的亚磷酰胺、具有固体载体封端（cap)的核糖单元、寡核苷 酸、一种用于合成氘标记的核苷和寡核苷酸的方法、以及用于合成在每个位置所含有的氘 在0. 1%至98%范围的氘化核苷和寡核苷酸的方法。已知百分比的氘并入核苷后，所述核 苷可在后续步骤中进一步修饰，直到发生供固相寡核苷酸合成用的亚磷酰胺或固体载体结 合的核苷的合成。在另外的步骤中将维持0.1至98%的氘比率。过去据我们所知未曾提 出或未进行所述特定且受控的氘化。所形成的氘化核糖寡核苷酸提供具有增高的稳定性的 RNA序列。
[0032] 并不预期对寡核苷酸进行氘标记会呈现毒性作用。在糖、嘌呤、嘧啶碱基的所选择 位置的选择性氘修饰的寡核苷酸，或糖位置以及核碱基的完全氘化将促进寡核苷酸的生物 特性的改进。预期在核糖的糖部分的各种位置特异性氘化的寡核苷增大酶促稳定性并且实 质上增大治疗性寡核苷酸的稳定性。已知氘取代不影响酶识别或酶促结合。已利用位点 特异性原子转移来用于特异性氘标记的十二聚体的裂解的结构信息，参见Voss，等，J. Am. Chem. Soc.，1990,112,9669-9670。特定序列的酶识别是寡核苷酸关于其特异性作用的生物 化学相互作用的第一步，并且氘标记不会改变位点识别的生物化学过程。类似地，双链的杂 交不受氘标记影响。
[0033] 期望氘标记的寡核苷酸将不影响通过沃森-克里克碱基配对机制（Watson Crick base pairing mechanism)，胡格斯腾（Hoogsten)或其适用于 DNA/DNA 杂交、DNA/RNA 杂 交、RNA/RNA杂交的其他杂交机制与互补链的氢键合。预期在基于反义的寡聚物治疗性方 法中所涉及的氘化DNA与互补RNA之间的RNA酶H裂解不受共价附接至糖骨架或核碱基的 氘的存在影响。因此，氘标记的寡核苷酸将在反义治疗作用模式中起作用。另外，应有可能 开发氘化siRNA用于治疗应用。基于呈现用于合成核糖核苷和寡核苷酸（寡核苷酸链的核 苷中具有一个或多个氘）各种流程，期望可实现设计具有选择性或完全氘化的RNA序列的 适体。将在糖和核碱基中、在稳定且总体上不可交换的位置处如在碳氢键（C-H)处进行合 成和在核苷中进行氘标记的化学方法。然而，在细胞中在略碱性pH下有望存在缓慢的氘与 氢交换。由于通过体内交换机制（C-D-C-H)氘的缓慢释放，所述氘标记的寡核苷酸将提 供营养上有益作用的优点。因此，氘标记的寡核苷酸可具有取代在核苷的各种不可电离位 置且在寡核苷酸中具有天然氢原子的治疗性寡核苷酸的巨大潜力。为确定寡核苷酸的核苷 中特定氘化水平的作用，将进行特定共价碳氢键的极低水平的氘化如〇. 1%-直到98%氘 化，并且将研宄所述寡核苷酸的生物化学和生物学效应以及作用。所述系统性生物研宄将 提供对药物和治疗剂开发的更好指导。据我们所知未曾提出或未进行所述研宄。
[0034] 如本文所用，术语"寡核苷酸"是指多个核苷酸按由天然或修饰的杂环碱基部分所 限定的特定序列接合在一起。代表性杂环碱基部分包括但不限于核碱基，如腺嘌呤、鸟嘌 呤、胞嘧啶、尿嘧啶以及其他非天然存在的和天然的核碱基如黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺 嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤 的2-丙基以及其他烷基衍生物、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧 啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶，8-卤、氧杂、氨基、巯基、硫烷基、硫烷基、羟基以及 其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基 鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤。如本文所述的修饰的核碱基定义了合成的核 碱基或已从天然存在状态改变的核碱基，如氘化腺嘌呤、氘化胞嘧啶、氘化鸟嘌呤、以及氘 化尿嘧啶。
[0035] 因此，本发明的主要目的是传授氘化核苷、亚磷酰胺以及寡核苷酸，一种合成完全 氘化的亚磷酰胺和寡核苷酸的方法，以及一种合成在各种位置含有〇. 1% -98%氘的氘化 亚磷酰胺以及寡核苷酸的方法。
[0036] 本发明的另一目标是传授一种制备在核苷的各种位置具有共价标记的氘的衍生 化的核糖核苷和亚磷酰胺的方法，以及由其制备的产品。
[0037] 本发明的另一目标是传授在核苷的各种位置具有共价标记的氘的核糖核苷和亚 磷酰胺。
[0038] 本发明的另一目标是传授制备具有天然磷酸二酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸 的方法，以及由其制备的产品。
[0039] 本发明的另一目标是传授具有天然磷酸二酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸。
[0040] 本发明的另一目标是传授制备具有硫代磷酸酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸的 方法，以及由其制备的产品。
[0041] 本发明的另一目标是传授具有变异的骨架的氘标记的寡核糖核苷酸。
[0042] 本发明的另一目标是传授具有硫代磷酸酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸。
[0043] 本发明的另一目标是传授具有增高稳定性的氘化骨架的寡核苷酸。
[0044] 本发明的另一目标是传授可用于治疗性治疗的氘化寡核苷酸。
[0045] 本发明的另一目标是传授可用于治疗性治疗的氘化RNA反义寡核苷酸。
[0046] 从以下说明结合其中通过说明和举例方式所列的任何附图、本发明的某些实施方 案，本发明的其他目标和优势将变得显而易见。本文中所含的任何图式构成本说明书的一 部分，并且包括本发明的示例性实施方案且说明其各种目标和特征。
[0047] 附图简述
[0048] 图1A为作为氘化腺嘌呤示出的修饰的核碱基的化学结构；
[0049] 图1B为作为氘化鸟嘌呤示出的修饰的核碱基的化学结构；
[0050] 图1C为作为氘化胞嘧啶示出的修饰的核碱基的化学结构；
[0051] 图1D为作为氘化尿嘧啶示出的修饰的核碱基的化学结构；
[0052] 图2示出流程1 :合成1-0-乙酸- a / 0 2, 3, 5-0-三苯甲酰基-1-2, 3, 4, 5, 5'五 氘-D呋喃核糖苷；
[0053] 图3示出流程2 :5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘3' -氰基乙基n，n-二异丙基亚磷酰胺-0-D呋喃核糖基-尿 苷；
[0054] 图4示出流程3 :合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-3' - 丁二酰基Icaa-CPG-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基）尿苷；
[0055] 图5示出流程4:合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-3 ' -N，N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2 '，3 '，4 '，5 '，5 "五氘-D呋喃核糖基-N4苯 甲酰基胞苷；
[0056] 图6示出流程5 :合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-3' - 丁二酰基Icaa-CPG-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷；
[0057] 图7示出流程6 :合成作为5'_0_二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D 呋喃核糖基-N6苯甲酰基腺苷示出的、根据本发明的修饰的亚磷酰胺的替代实施方案；
[0058] 图8示出结构C1，根据本发明的氘化寡核苷酸的特定实施方案的代表性图示；
[0059] 图9A示出结构D1，具有磷酸二酯核苷酸间键的氘化寡核苷酸的替代实施方案；
[0060] 图9B示出结构D2,作为硫代磷酸酯核苷酸间键示出的、具有变异的磷酸酯骨架氘 化寡核苷酸的替代实施方案；
[0061]图 10 为使用具有 Chrosep 保护柱 Omnisphere 5 C18 的 Shimazdu 型 HPLC 管柱： Chroms印SS (4. 6 X 250mm)，氘化核苷和亚磷酰胺的HPLC分析的总结图表；
[0062] 图11A为1-0-乙酸-a / 0 2, 3, 5三苯甲酰基呋喃核糖苷的1H-NMR光谱；
[0063] 图11B为1-0-乙酸-a2, 3, 5三苯甲酰基呋喃核糖苷的正离子质谱，批号# : SK38-38,计算质量：504. 14,观察到的质量：522. 40 ;
[0064] 图12A为1-0-乙酸-a/0 2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷 (结构VI)的1H-NMR光谱，其中H-4质子示出在大约50%强度，从而指示大约50%的氘并 入在这一位置；
[0065] 图12B为1-0-乙酸-a/0 2, 3, 5-三苯甲酰基-1-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖 苷（VI)的正离子质谱，计算质量：509. 17,观察到的质量：526.80(M+钠）；
[0066]图13A为2'，3'，5'-三羟基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基-尿苷 (结构IX)的HPLC色谱图；
[0067]图13B为2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-尿苷 (结构IX)的HPLC报告；
[0068]图13C为2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷 (结构IX)的质谱，计算质量：249. 10,观察到的质量：247. 30;
[0069] 图14A为5'-0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基-尿 苷（结构X)的HPLC报告；
[0070] 图14B为5'-0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基-尿 苷（结构X)的1H-NMR光谱；
[0071] 图14C为5'-0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基-尿 苷（结构X)的1H-NMR光谱；
[0072] 图14D为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -0- 丁二 酰基吡啶鑰盐-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（化合物结构 XXIII)的 1H-NMR 光谱；
[0073] 图15A为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷（结构XI)的HPLC色谱图；
[0074] 图15B为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷（结构XI)的HPLC色谱图；
[0075] 图15C为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷（结构XI)的1H-NMR光谱；
[0076] 图1?为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基-尿苷（结构XI)的质谱，计算质量：665. 32， 观察到的质量：664. 00;
[0077] 图16A为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（结构XIII)的 HPLC色谱图；
[0078] 图16B为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（结构XIII)的 HPLC 报告，纯度：96. 72% ;
[0079] 图16C为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（结构XIII)的 UV分析；
[0080] 图16