甲苯。在直接真空线上着手1 次进一步干燥，进行6小时。获得油状产物，并且使用其合成1-溴-a / 0 D-2, 3, 5-三苯甲 酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷。
[0138] 合成1-溴-a / f3 D 2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（结构 V) :将不含甲苯的1-0-甲基-a/0 2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷 (IV)溶解于溶于在冰乙酸中制备的33%溴化氢（HBr)溶液并且紧密密封。在室温下搅拌 溶液。30分钟后，将反应混合物冷却至8-10°C。随后，将冰乙酸（200ml)添加至反应混合 物。然后，按逐滴方式添加去离子水（130ml)。将反应混合物搅拌23分钟。将反应混合物 倾倒在5-KTC冷却的去离子水上。用氯仿提取胶质物质。将冷（0_5°C)碳酸氢钠水溶液 添加至有机层，直至有机层的pH为碱性（pH>8)。分离有机层并且用冷碳酸氢钠水溶液再一 次洗涤，之后使有机层通过无水硫酸钠。在旋转蒸发仪上蒸发过滤的溶液。将胶质固体与 无水吡啶共蒸发两次。获得油状产物并且将其用于下一步骤。
[0139] 合成1-0-乙酸-a / 0 2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（结构 VI) :将上一步骤中获得的干燥产物1-溴-a2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D 呋喃核糖苷（结构V)溶于无水吡啶（40ml)中并且在氯仿（40ml)中无水蒸馏。向反应混 合物添加乙酸酐（13.9ml)。轻轻混合溶液、密封并储存在室温下72小时。然后，用氯仿稀 释溶液。将全部的有机层置于分液漏斗中并且用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，之后用饱 和盐水溶液洗涤。使有机层通过无水硫酸钠，之后在旋转蒸发仪上干燥。将残余物与甲苯 共蒸发三次。使用直接真空线将胶质物质干燥2小时。将无水乙醇添加至胶质物质。将溶 液保持在4°C下2小时。过滤所获得的固体并且用冷乙醇洗涤。将固体转移至圆底烧瓶中， 并且在高真空直接线上在37°C下干燥12小时。所述过程得到4. 5克灰白色产物的产量。 通过1H NMR和质谱分析分析产物。
[0140] 参见图3、5以及7,示出了修饰的亚磷酰胺的合成并且所述合成是分别根据流程 4、6以及8进行，并且以下概括了单个步骤。图3、5以及7示出具有核碱基尿嘧啶、胞嘧啶 以及腺嘌呤的亚磷酰胺的说明性实例。可使用相同或类似的步骤合成具有其他核碱基如鸟 嘌呤或修饰的核碱基的亚磷酰胺。因此，以下实施例仅为说明性的并且不意在为限制性的。
[0141] 合成2'，3'，5'-三羟基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖尿苷（结构 IX):使尿嘧啶（化合物VII ;0. 5g;4.46mmol)、六甲基二硅胺（15ml)以及硫酸铵（20mg， 0.15mmol)的混合物在回流下沸腾，直至尿嘧啶溶解，大约15小时。随后，在真空下蒸发六 甲基二硅胺，并且添加甲苯。振荡混合物，并且蒸发出溶剂以获得由三甲基甲硅烷基化尿嘧 啶组成的残余固体。固体残余物在不纯化情况下用于偶联。将新鲜蒸馏的1，2二氯乙烷（经 CaHj^鲜蒸馏）（16ml)添加至残余物。在40°C下搅拌混合物，接着在40°C温度下添加氯化 锡（1. 13ml，1. 46mmol)。反应在40°C下持续15分钟。将氘化1-乙酸a / 0 -D呋喃核糖苷 (结构VI ;1. 81g ;3. 56mmol)的1，2二氯乙烷（经CaHj^鲜蒸馏）溶液置于压力平衡漏斗 中，并且安装在以上反应烧瓶的顶部。逐滴添加溶液，并且使反应在回流下沸腾2. 5h。冷却 反应混合物并且在饱和碳酸氢钠溶液中搅拌1. 5h。经由硅藻土粉末床层过滤反应混合物。 分离有机层并且使其通过无水硫酸钠。在真空下蒸发反应混合物，并且在氯仿：甲醇（8:2) 中通过TLC进行检查。在二氧化硅（70:230目）（100g)柱（1. 5"X14cm)上用EtOAc:己烷 (6:4)作为洗脱剂对所获得的胶质物质进行色谱分离。通过TLC监控洗脱份。在氯仿：甲 醇（8:2)中&值为0.46。通过UV可视化监控纯洗脱份，将其合并，在旋转蒸发仪上浓缩， 并且获得呈泡沫形式的具有结构VIII的化合物（产量1. 7g)。
[0142] 将结构VIII (1.7g)在吡啶（20ml)和氨水溶液（37w/v%，20ml)中的混合物在 37°C下在紧密密封的烧瓶中保持48小时。然后，在真空中蒸发混合物，并且与异丙醇一起 共蒸发至干燥。将残余物的二氯甲烷溶液施加至装填有在氯仿中的硅胶（70:230) (100g) 的管柱（2X15cm)，接着施加氯仿：甲醇85:15(V:V)。通过UV使纯洗脱份可视化，并且蒸 发以得到结构IX的2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷的 化合物粉末（产量：700mg ;93. 3% )，参见图13A-13C。在系统氯仿：甲醇（85:15)中Rf为 0? 4。UV 最大为 260 (0? 494)，Emax :7826. 22。
[0143] 合成5'-0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基尿苷（结 构X):用无水吡啶将2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷 (结构IX ;0. 7g ;0. 175mmol)干燥两次，接着添加无水吡啶（10ml)。搅拌溶液并且用所附接 的干燥管冷却至0°〇。向溶液以1小时间隔按两份添加4,4，二甲氧基三苯甲基氯（011'-(：1; I. 16§;3.42111111〇1)。通过11(：在氯仿（85:15)中监控反应进程。反应完成（大约4小时） 后，用冷甲醇（5ml)淬灭反应混合物，接着在旋转蒸发仪上去除溶剂。将残余的胶状物溶解 在氯仿中，并且用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，接着用盐水溶液洗涤一次。在硅胶（70:230 目大小）（150g)柱上用氯仿：甲醇（95:5)作为洗脱剂色谱分离去除溶剂后获得的粗产物。 通过TLC监控洗脱份并且通过UV可视化。在氯仿：甲醇（95:05)中的Rf为0.4。合并纯 洗脱份并且蒸发以得到几乎无色的泡沫状物，产量：1. 3g，86. 6% ;UVmax为250nm ;Emax为 II, 671。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参 见图 14A-14D。
[0144]合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'，3'，4'，5'，5" 五氘0 -D呋喃核糖基-尿苷XI以及5' -0-二甲氧基三苯甲基-3' -0-叔丁基二甲基甲硅 烷基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷XII :通过与无水乙腈一起并且在真 空下持续数小时共蒸发来干燥化合物5' -0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘 0 -D呋喃核糖基尿苷（结构IX ;1. 3g ;2. 36mmol)。将所干燥的产物添加至无水四氢呋喃 (THF，13ml)。通过反应烧瓶顶部上的干燥管在无水条件下向所述溶液添加硝酸银（AgN03， 0. 5g，2. 94mmol)。向混合物添加无水R比啶（0. 69ml，8. 54mmol)。将反应混合物在室温下搅拌 10分钟。随后，在无水条件下添加叔丁基二甲基甲硅烷基氯（TBDMS-氯，0. 53g，3. 52mmol)。 密封反应混合物并且在室温下搅拌2. 5小时。通过TLC监控反应进程，并且在UV下可视化。 TLC溶剂系统为氯仿：己烷：丙酮（65:25:10)。粗产物示出2'异构体（结构XI)与3'异 构体形成。在TLC上进行未修饰的2'和3'异构体的比较性分析，并且斑点共迀移。
[0145] 常用处理后，在硅胶（230:400目）柱上用由氯仿：己烷：丙酮65:25:10组成的 溶剂系统对粗产物进行色谱分离。通过TLC监控洗脱份，并且通过UV可视化。在相同溶剂 系统中R f值为〇. 38。蒸发合并的纯洗脱份，以得到产量为800mg的、5' -0-二甲氧基三苯 甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基-尿苷的 泡沫状物，50. 9%。UVAmax 为 250nm(0. 350) ;Emax 为 1634。未分离 3'异构体 1-(5-0_ 二 甲氧基三苯甲基-3-0-叔丁基二甲基甲硅烷基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖基）尿嘧 啶XII。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参 见图 15A-15D。
[0146] 合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N_二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基尿苷（化合物结构 XIII):用无水乙腈彻底干燥来自5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基尿苷（结构XI)以及5' -0-二甲氧基三苯 甲基-3' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（结 构XII)的合成的2'-TBDM甲硅烷基异构体（结构XI，430mg)，并且置于圆底烧瓶中。添 加无水四氢呋喃（4. 3ml)，并且用氩吹扫溶液，并且重新盖上塞。在搅拌下，向溶液添加 2, 4, 6-三甲基吡啶（430微升；5当量），之后添加1-甲基咪唑（51微升；1. 0当量）。在 室温下搅拌溶液并且快速添加N，N-二异丙基氨基氰基乙基膦酰胺酸氯（磷酰基化试剂， ChemGenes目录号RN-1505;290微升；2当量）。70分钟后，反应完全，并且通过用氯仿稀 释进行处理。将有机层置于分液漏斗中，并且用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，接着用盐水溶液 进一步洗涤有机层。使有机层通过无水硫酸钠。在旋转蒸发仪上浓缩溶液。在乙酸乙酯： 己烷：三乙胺（30:60:10)系统中检查TLC。在硅胶（230-400目）柱上纯化粗产物，柱直 径（30cmX 1.5cm)。在硅胶柱上纯化粗产物。通过TLC监控纯洗脱份，将其合并并且然后浓 缩。获得干重为300mg的无色泡沫状产物。通过HPLC、UV、1H NMR、质谱数据以及31P NMR 分析产物，参见图16A-16F。
[0147] 需要附接有氘标记的核苷的固体载体来合成寡核苷酸。寡核苷酸合成后结合有 氘标记的核苷的固体载体使得氘标记的核苷处于寡核苷酸的3'端。在此过程中，由3'端 至5'端方向（常规寡核苷酸合成）进行寡核苷酸合成。本发明公开用于合成氘标记的 核苷-3' - 丁二酸核苷的方法，所述核苷在糖和嘌呤/嘧啶碱基的特定位置处具有可在 0. 1% -98%氘变化的受控的氘标签。本发明公开并入含氘的亚磷酰胺和固体载体的方法， 所述含氘的亚磷酰胺和固体载体具有不同百分比的富集的氘，其中氘与氢比率在20:98范 围内。
[0148] 结构B示出具有以下化学结构的氘化固体载体结构：
[0150] 其中X表示氘或氢，R1表示阻断基团，R2独立地表示阻断基团，R3表示连接分子， 并且R4表示固体载体，并且B表示核碱基。如先前所述，B可为生物碱基、修饰的碱基或其 组合。连接分子在本领域中通常已知是起作用来连接固体载体与官能团的小分子。优选的 连接分子为丁二酰基-Icaa，但可使用所属领域的技术人员已知的其他连接分子。固体载体 通常用于附接至第一核苷。在优选实施方案中，固体载体为受控的多孔玻璃（CPG)。然而， 还可使用其他载体如但不限于草酰基-受控的多孔玻璃、大孔聚苯乙烯（MPPS)、氨基聚乙 二醇。
[0151]图4示出流程3:合成偶联至固体载体结构的氘化核糖核苷，在本文中 示出为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' - 丁二酰基 Icaa-CPG-2'，3'，4'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基尿苷。
[0152] 合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -0-丁二酰 基吡啶鑰盐-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（化合物结构XIV):将化合物 5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋 喃核糖基尿苷（XI ;350mg)置于3. 5ml无水吡啶中并且搅拌。向搅拌的溶液添加丁二酸酐 (158mg ;1，58mmol)，之后添加4-二甲基氨基吡啶（20mg ;0. 163mmol)。密封反应混合物并 保持在水浴中并维持在37°C下14小时。通过TLC检查反应混合物并且发现完全。随后，用 冷甲醇（200微升）淬灭反应混合物，之后在旋转蒸发仪上去除溶剂。将粗反应混合物置于 氯仿中，并且用饱和盐水溶液洗涤有机层。通过无水硫酸钠过滤有机层，并且在真空下去除 氯仿溶液。通过短柱色谱法使用氯仿：甲醇（95:5)溶剂系统纯化粗化合物。合并且蒸发 纯的洗脱份。在真空下干燥泡沫状产物6小时。在此系统中产物的Rf?值为0.3。所述过 程得到120mg。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产 物，参见图17E和17F。
[0153] 合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' - 丁二酰基 Icaa-CPG-2, ' 3, ' 4, ' 5, ' 5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（化合物结构XV):将上一步骤 的核苷、3' - 丁二酸-吡啶鑰盐、5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-3' - 丁二酰基吡啶鑰盐-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（化合物结构 XIV ;85mg)置于圆底烧瓶中并且用无水乙腈彻底干燥，之后在高真空下使用直接线干燥6 小时。向固体添加无水乙腈（6ml)，之后添加0-(苯并三唑-1-基）-N，N，N，N-四甲基-脲 鑰-六氟-磷酸盐HBTU(47mg ;1. 1当量）。然后添加二异丙基乙基胺（39微升；2当量）。 向溶液添加氨基连接体Icaa CPG(长链烷基胺受控多孔玻璃；500A粒径；Pennsylvania的 Prime Synthesis公司的产品；1.5g)。彻底密封混合物并且在37°C下保持12小时。过滤 CPG，用乙腈洗涤，之后用乙醚洗涤。将CPG空气干燥过夜。
[0154] 封闭残余氨基。将干燥的CPG置于鄂伦麦尔烧瓶中，并且添加CAP A溶液 (ChemGenes产品，目录号：RN-1458,由乙酸酐：吡啶：四氢呋喃（10:10:80)组成，10ml)。 将悬浮液保持在室温下并且密封，持续2小时。过滤CPG，用异丙醇洗涤，之后用乙醚洗涤。 通过茚三酮测试检查完全封闭残余氨基官能团的完成。阴性茚三酮测试指示残余氨基官能 团完全封端。对所加载CPG进行三苯甲基测定。三苯甲基值为44ymol/g。
[0155] 参考图5,流程4示出合成根据本发明并且具有包括结构XXII的核碱基胞嘧啶的 亚磷酰胺的替代实施方案的实施例。以下概括合成中所包括的单个步骤的细节。
[0156] 合成2'，3'，5' -三0-苯甲酰基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基N4苯 甲酰基胞苷（结构XVII):使N 4bz-胞嘧啶（化合物结构XVI ;750mg ;3. 47mmol)、六甲基二 硅胺（HMDS;19ml)以及硫酸铵（32mg;0. 24mmol)的混合物在回流下沸腾，直至N4bz-胞嘧 啶溶解，大约15小时。然后在真空下蒸发六甲基二硅胺并且添加甲苯。振荡混合物并且蒸 发出溶剂以获得由三甲基甲硅烷基化的N4bz-胞嘧啶组成的残余固体。固体残余物在不纯 化情况下用于偶联。将16ml新鲜蒸馏的1，2二氯乙烷（经0 &112新鲜蒸馏）添加至残余物。 在40°C下搅拌混合物。然后在40°C温度下添加氯化锡（0. 86ml ;3. 29mmole)。继续在40°C 温度下反应15分钟。将氘化0 -D核糖-1-乙酸（结构VI ;1. 42g ;2. 79mmol)的1，2二氯 乙烷（4.3ml;经CaHj^鲜蒸馏）溶液置于压力平衡的漏斗中，并且安装在反应烧杯顶部。 逐滴添加溶液，并且使反应在回流下沸腾2. 5小时。冷却反应混合物并且在饱和碳酸氢钠 水溶液中搅拌1.5小时。通过硅藻土粉末床层过滤反应。分离有机层并且使其通过无水硫 酸钠。在真空下蒸发反应混合物，并且使用TLC在氯仿：甲醇（98:02)中进行检查。心值 为0.46。反应得到2. 14g。
[0157]合成2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基N4苯甲酰基 胞苷（具有结构XVIII的化合物）：搅拌2'，3'，5' -三0-苯甲酰基-2'，3'，4'，5'，5" 五氘0 -D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷（结构XVII) (2. 14g ;3. 22mmol)在吡啶（20. 5ml) 中的混合物直至溶解。然后添加甲醇（5ml)。将溶液冷却至0°C并且添加2N氢氧化钠水 溶液（6. 26ml)用于选择性水解0-苯甲酰基。水解反应在0°C下进行20分钟，同时继续搅 拌。用2N HC1水溶液（7ml)将反应混合物小心中和至pH 7. 5。添加吡啶（10ml)后蒸发 溶液。将残余物与异丙醇共蒸发至干燥。用蒸馏水湿磨残余物，以得到无色固体。过滤固 体、用乙醚洗涤，并且在高真空下干燥。获得呈粉末形式的具有结构XII的化合物（产量： 1. 0g ;88. 49% )。在氯仿：甲醇（85:15)中 Rf 值为 0? 5 ;UVmax 为 260(0. 903)并且 Emax 为 16,000。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据、和/或31P NMR中的一种或多种分析产物， 参见图18A-18D。
[0158] 合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0-D呋喃核糖基N4苯甲 酰基胞苷（具有结构XIX的化合物）：用无水吡啶将化合物2'，3'，4'，5'，5"五氘-D 呋喃核糖基N 4苯甲酰基胞苷（结构XVIII ;1.0g;2.88mm〇l)干燥两次，接着添加无水吡啶 (l〇ml)。搅拌溶液并且用所附接的干燥管冷却至0°C。向溶液以1小时间隔按两份添加4, 4， 二甲氧基三苯甲基氯（DMT-C1 ;1. 15g ;3. 39mmol)。通过TLC在氯仿：85:15中监控反应进 程。反应完成（大约4小时）后，用冷甲醇（5ml)淬灭反应混合物，接着在旋转蒸发仪上去 除溶剂。将残余的胶状物置于氯仿中，并且用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，接着用盐水溶液 洗涤。在硅胶（70:230目大小）（150g)柱上用氯仿：甲醇：丙酮（50:30:20)色谱分离去 除溶剂后获得的粗产物。通过TLC监控洗脱份并且通过UV可视化。在氯仿：甲醇94:06 中Rf为0. 4。合并纯洗脱份并且蒸发以得到几乎无色的泡沫状物（产量：1. 5g ;81. 08% )， UV 入 max 为 260nm;Emax :16609.66(260nm)。通过以下 HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和 / 或 31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图19A-19D。
[0159]合成5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'，3'，4'，5'，5" 五氘0 -D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷和5' -0-二甲氧基三苯甲基-3' -0-叔丁基二甲基 甲硅烷基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷（具有结构XX和XXI 的化合物）：通过与无水乙腈一起并且在真空下持续数小时共蒸发来干燥化合物5' -0-二 甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷（化合物XIII; 1. 5g ;1. 95mmol)。将所干燥的产物添加至无水四氢呋喃（THF ;15ml)。通过反应烧瓶顶部上 的干燥管在无水条件下向所述溶液添加硝酸银（AgN03 ;0. 49g ;2. 94mmol)。向混合物添加 无水吡啶（〇. 60ml ;7. 26mmol)并且在室温下搅拌10分钟。随后，在无水条件下添加叔丁基 二甲基甲硅烷基氯（TBDMS-氯；0. 52g ;3. 52mmol)，密封反应混合物。将混合物在室温下搅 拌2. 5小时。通过TLC监控反应进程，并且在UV下可视化。使用溶剂系统首先使用氯仿： 己烷：丙酮（65:25:10) (Rf值为0.38)并且然后使用乙酸乙酯：己烷（50:50)进行TLC检 查。粗产物示出2'异构体（结构XX)与3'异构体（结构XXI)形成。在TLC上进行未修 饰的2'和3'异构体的比较性分析，并且斑点共迀移。
[0160] 在硅胶（230:400目）柱上用由氯仿：己烷：丙酮（65:25:10)组成的溶剂系统对 粗产物进行色谱分离。通过TLC监控洗脱份，并且通过UV可视化。在相同溶剂系统中心为 〇. 38。蒸发合并的纯洗脱份，以得到产量为800mg的、5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔 丁基二甲基甲硅烷基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷的泡沫状 物，50.9%。U