D为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（结构XIII)的 UV分析报告；
[0081] 图16E为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（结构XIII)的 质谱，计算质量：865.43,观察到的质量：866. 50(质量+钠离子（888.4);
[0082]图16F为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基尿苷（结构XIII)的 31P NMR 光谱，批号 #:SK188-38,尖锐的双重峰在 150.560&150.069ppm，纯度：100%，A = 0. 491 ；
[0083] 图17A为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结构XIV)的HPLC色谱 图；
[0084] 图17B为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结构XIV)的HPLC报告；
[0085] 图17C为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结构XIV)的1H-NMR光 谱；
[0086] 图17D为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷 基-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结构XIV)的质谱，计算 质量：768. 36,观察到的质量：769. 30;
[0087] 图17E为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -0- 丁二 酰基吡啶鑰盐-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷（结构XIV)的1H-NMR光 谱；
[0088] 图17F为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -0- 丁二 酰基吡啶鑰盐-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷（结构XIV)的正离子模式 质谱，计算质量：764.83,观察到的质量：788. 10(+钠离子）；
[0089]图18A为2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-N4苯甲酰 基胞苷（结构XVIII)的HPLC报告；
[0090]图18B为2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-N4苯甲酰 基胞苷（结构XVIII)的1H-NMR光谱；
[0091]图18C为2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-N4苯甲酰 基胞苷（结构XVIII)的质谱，计算质量：352. 14,观察到的质量：352. 50;
[0092]图18D为2'，3'，5' -三羟基-2'，3'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-N4苯甲酰 基胞苷（结构XVIII)的质谱，计算质量：352. 14,观察到的质量：352. 50;
[0093] 图19A为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -0- 丁二 酰基吡啶鑰盐-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-尿苷（结构XIV)的正离子模式 质谱，计算质量：764.83,观察到的质量：788. 10(+钠离子）；
[0094]图19B为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-N4 苯甲酰基胞苷（化合物XIX)的HPLC报告；
[0095]图19C为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-N4 苯甲酰基胞苷（化合物XIX)的1H-NMR光谱；
[0096]图19D为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2'，3'，4'，5'，5"五氘0 -D呋喃核糖基-N4 苯甲酰基胞苷（化合物XIX)的1H-NMR光谱；
[0097]图20A为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结 构XXII)的HPLC色谱图，纯度：78. 88% ;
[0098] 图20B为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结 构XXII)的HPLC报告，纯度：78.88%;
[0099] 图20C为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结 构XXII)的UV分析；
[0100] 图20D为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结 构XXII)的UV分析；
[0101] 图20E为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结 构 XXII)的 31P NMR 光谱，尖锐的双重峰在 150.576&149.852ppm，纯度：95%，A = 0.724;
[0102] 图20F为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结 构 XXII)的 31P NMR 光谱，尖锐的双重峰在 150. 576&149. 852ppm，纯度：95%;A = 〇? 724 ;
[0103] 图21A为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -N，N-二 异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（结 构 XXII)的 31P NMR 光谱，尖锐的双重峰在 150. 576&149. 852ppm，纯度：95%;A = 〇? 724 ;
[0104] 图21B为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3' -0- 丁二 酰基吡啶鑰盐-2'，3'，4'，5'，5"五氘-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷（化合物结构 XXIII)的质谱，计算质量：867. 95,观察到的质量：869. 20 ;
[0105]图22A为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' 3'，4'，5'，5"-五氘0 -D呋喃核糖基-N6 苯甲酰基腺苷（结构XXVIII)的HPLC色谱图；
[0106]图22B为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' 3'，4'，5'，5"-五氘0 -D呋喃核糖基-N6 苯甲酰基腺苷（结构XXVIII)的HPLC色谱图；
[0107] 图22C为5' -0-二甲氧基三苯甲基-2' 3'，4'，5'，5"-五氘0 -D呋喃核糖基-N6 苯甲酰基腺苷（结构XXVIII)的质谱，批号# :09015RDV，计算质量：678. 28,观察到的质量： 679. 2 ；
[0108] 图23A为SEQIDNo. 1、完全氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
[0109] 图23B为SEQ ID No. 1、完全氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
[0110] 图23C为SEQ ID No. 1、完全氘化RNA的纯化寡核苷酸的UV分析；
[0111] 图24A为SEQ ID No. 2、大约25 %氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
[0112] 图24B为SEQ ID No. 2、大约25 %氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
[0113] 图24(：为3￡〇10此.2、大约25%氘化1?隱的纯化寡核苷酸的，分析；
[0114] 图25A为SEQ ID No. 3、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
[0115] 图25B为SEQ ID No. 3、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
[0116] 图25C为SEQ ID No. 3、天然RNA的纯化寡核苷酸的UV分析；
[0117] 图26A为SEQ ID No. 4、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
[0118]图26B为SEQ ID No. 4、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
[0119] 图26C为SEQ ID No. 4、天然RNA的纯化寡核苷酸的UV分析；
[0120] 图27A为SEQ ID No. 5、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
[0121] 图27B为SEQ ID No. 5、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；以及
[0122] 图27C为SEQ ID No. 5、天然RNA的纯化寡核苷酸的UV分析。
[0123]发明详述
[0124] 本发明描述高纯度氘化核糖以及糖、基于氘化核糖的核苷酸、氘化RNA寡核苷酸， 以及用于合成供在治疗剂中使用的并入氘的寡核苷酸的受控方法。所述受控方法将需要开 发在0. 1%至98%范围内的各种所选择氘化度的方法，以及确定反应条件的分析方法。分 析方法提供所含有的氘在每个位置〇. 1 %至每个位置98%范围内的氘化寡核苷酸。在核苷 内并入不同百分比的氘后，将进行进一步的化学合成以产生亚磷酰胺，所述化学合成将在 每一步骤维持氘百分比，直到亚磷酰胺步骤。随后，将施用所述固定比率D/H寡核苷酸合成 子来产生寡核苷酸。通过各种分析方法如质子NMR和质谱确定氘的并入百分比后，如果维 持正确选择的反应条件，氘/氢比率将不受影响。本发明进一步描述氘标记的核苷_3'_ 丁 二酸核苷的受控合成的所选择实施例，所述核苷在供用于固相寡核苷酸合成的糖和嘌呤/ 嘧啶碱基的特定位置具有部分或完全饱和的在0. 1% -98%氘变化的氘标签。因此，类似于 常规寡核苷酸合成，即从3'端至5'端方向进行本寡核苷酸合成方法。
[0125]因此，本发明的氘化核糖以及糖、基于氘化核糖的核苷酸、氘化RNA寡核苷酸可出 于治疗益处而使用。寡核苷酸疗法，即使用寡核苷酸来调节特定基因的表达，提供选择性改 变基因表达、而无较多常规治疗剂的不合意的非特异性毒性作用的机会。在说明性实例中， 本发明的氘化核糖以及糖、基于氘化核糖的核苷酸、氘化RNA寡核苷酸可用在反义疗法中。 因此，本发明可用来提供具有增高的保护的修饰的反义RNA，以提供更稳定、不易消化的反 义RNA。因此，本发明的寡核苷酸可用于许多疾病的临床实践并且针对已知反义疗法适合或 有待鉴别的任何靶RNA。本发明的氘化寡核苷酸可用于其他基于核酸的分子疗法，包括使用 基于核酸的分子如RNA干扰在mRNA水平使基因表达沉默。
[0126] 以下描述用于合成氘化核苷、糖和碱基保护、亚磷酰胺以及所涵盖的对应寡核苷 酸的数个说明性步骤。合成糖氘保护的核苷包括选择性地氘化不可交换质子，如B-D-核糖 的5'的H-l、H-2、H-3、H-4以及H-5。H-1'和H-4'质子在变成核苷的一部分时性质为略酸 性的，并且具有在某种程度上与氢交换的趋势。因此，这两个质子不会产生大于90%的D/H 比率。尽管质子H-2'、H-3'、H-5'、5"具有较高的pK并且因此可氘化至大于95%的D/H比 率，但在反应中在质子性溶剂中或在与略碱性pH条件接触时不易交换回氢。
[0127] 本发明公开一种具有结构A的结构的修饰的亚磷酰胺：
[0129]其中X或XI表示氘或氢，R1表示阻断基团，R2独立地表示阻断基团，R3为磷酸酯 保护基团、优选地氰基乙基二烷基氨基，并且R4独立地为保护基团、优选地3' B-氰基乙基 保护基团，并且B表示核碱基。尽管核糖的1'位也被氘化，然而氘的程度在此位置可变并 且氘化后可交换氢。因此，1'位在图中示出为D/H。通过数据可见，此位置的氘并入为大约 50:50氘：氢。因此，在进一步的讨论中，如果在制剂中氘并入降低至较低的氘，那么与核糖 环的其他位置的氘化相比，1'位的氘富集将为剩余位置的几乎50%。4'位的氘也可变。
[0130] 封闭或保护基团通常致使分子的化学官能团对于特定反应条件来说成惰性，并且 稍后可从分子中的所述官能团去除，而不实质上损害分子的剩余部分。作为寡核苷酸方法 的一部分，可封闭核碱基和2'糖基上的官能团。根据本发明的羟基保护基团包括多种多样 的基团。优选地，保护基团在碱性条件下是稳定的，但可在酸性条件下去除。优选地，R1 (5' 羟基）为二甲氧基三苯甲基（DMT)。其他代表性羟基保护基团包括但不限于三苯甲基、单 甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基咕吨-9-基（Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基） 咕吨-9-基（Mox)。优选地R2 (2'羟基）用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保护。对于其 他基团，还可使用如叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基(T0M)。磷酸酷保护基团起作用来在例 如固相寡核苷酸合成方案过程中保护一个或多个含有磷的核苷酸间键。用脱保护剂如氢氧 化铵水溶液处理其上具有磷保护基团的一个或多个核苷酸间键将使得去除磷保护基团，并 且在其位置处留下羟基或巯基。除了以上所列的那些，也可使用其他保护基团诸如但不限 于二苯基甲硅烷基乙基、氰基丁烯基、氰基对二甲苯基（CPX)、甲基-N-三氟乙酰基乙基 (META)以及乙酰氧基苯氧基乙基（AP0E)。
[0131] 核碱基B可为生物碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。B还可为修饰的碱 基，如氣化腺嘌呤，参见图1A ;氣化鸟嘌呤，参见图1B ;氣化胞嘧啶，参见图1C ;氣化尿嘧 啶，参见图1D ;或所属领域的技术人员已知的其他修饰的碱基，包括生物碱基、合成碱基以 及修饰碱基的类似物，如但不限于次黄嗓呤（hypoxanthine)(次黄嗓呤（inosine))、5-甲 基胞嘧啶、5-氮杂胞嘧啶、5-卤化尿嘧啶和胞嘧啶以及5-烷基取代的核碱基类，如C-5丙 炔尿嘧啶以及C-5丙炔胞嘧啶，这些类似物也已氘化。B还可含有阻断基团，如苯甲酰基保 护基团或异丁酰基保护基团、乙酰基保护基团、苯氧基乙酰基保护基团、4-异丙基苯氧基乙 酰基保护基团或二甲基甲脒基、二甲基乙脒保护基团。
[0132] 图2描绘在合成氘化RNA-核苷、n-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的过程中起始 材料的说明性实例的合成。根据流程，以a / f3 -D呋喃核糖苷（-D-核糖，结构I)起始进 行1-0-乙酸- a / 0 2, 3, 5-0-三苯甲酰基-1-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（结构VI) 的合成° 通过 A. Foldesi, F. R. Nilson, C. Glemarec, C. Gioeli&J. Chattopadhyaya, Tetrah edron，9033, 1992所述程序的稍微修改引入氘。合成氘化阮内镍的程序也是从此处引用的 文献的同一作者采纳而来，稍微加以修改以改进氘并入的效率。步骤包括由D-核糖（I) 合成1-0-甲基-a / 0-D呋喃核糖苷（II)。使用氘化阮内镍由化合物II合成1-0-甲基 a2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（III)。通过在温和条件下进行苯甲酰基化由具有 结构III的化合物合成1-0-甲基- a / 0 2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核 糖苷（IV)。通过首先选择性去除1-0-甲基以产生1-羟基糖、随后用溴置换，而不分离中 间体1-羟基糖，由化合物IV合成1-溴-a / 0 D 2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D 呋喃核糖苷（V)。化合物V不进行纯化直接用于合成1-0-乙酸- a / 0 2, 3, 5-三苯甲酰 基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（VI)。使化合物VI结晶并且通过1H NMR充分表征，参 见图12A。由此分析确认在每个糖位置所并入的氘百分比，并且通过质谱分析进一步表征 糖，参见图12B。
[0133] 合成1-0-乙酸-a/0 2, 3, 5-0-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷，流 程1 :
[0134] 制备氘阮内镍催化剂：将192mL去离子水置于装备温度计和泰氟隆（Teflon)涂覆 的磁性搅拌器的500ml鄂伦麦尔烧瓶（Erlenmeyer flask)中。将鄂伦麦尔烧瓶置于塑料烧 杯中，所述塑料烧杯半填充有水，并且位于加热板/磁性搅拌器上。缓慢添加氢氧化钠团粒 (51. 2g)至烧瓶内的水中，同时轻轻搅拌。轻轻搅拌使水温维持在约50°C。搅拌混合物直 至所有氢氧化钠（NaOH)团粒均已溶解。添加另外的化学品之前，烧瓶内的温度维持在大约 50°C。随后，在30分钟的时间帧内按多个小份逐渐添加40g阮内镍合金（Sigma Aldrich)。 外部、即烧杯内的水温维持在大约50°C +/_4°C。添加阮内镍合金后，将组合物搅拌大约60 分钟，同时维持内部温度。随后，将反应烧瓶缓慢冷却至室温，耗费大约1小时。将1升去 离子水一次性添加至烧瓶，并且小心倾析出。再重复此过程两次，总计3次。在每次添加 水和倾析过程中，所有固体材料均留在烧瓶中。完成3次加水和倾析步骤后，将固体转移至 500ml过滤烧瓶。将管连接至过滤烧瓶以去除在将去离子水添加至过滤烧瓶顶部时所产生 的任何溢出的水。持续洗涤并且搅拌过滤烧瓶的内容物，直至所有浑浊消失。浑浊消失后， 使用大约20升去离子水继续用去离子水进行另外的洗涤。在水具有pH 6. 5-7.0时终止洗 涤，并且上清液澄清。
[0135] 随后制备氘化阮内镍催化剂。将洗涤后的催化剂颗粒转移至隔片加盖的瓶中。将 泰氟隆涂覆的磁性搅拌器置于瓶中并且将橡胶塞置于隔片瓶的顶部。用氩吹扫瓶。将悬 浮液搅拌1分钟，之后使颗粒沉降。使用巴斯德（Pasteur)吸管小心去除水。这一过程进 行4次，每次要求添加、通过添加1. 5ml去离子水、搅拌并且小心去除水。随后，添加氧化氘 (D20，1.5ml;Cambridge Isotope Labs. Massachusetts，纯度大于 98%)。将混合物揽样 30分钟。固体沉降至底部后，通过吸管小心去除液体。将所述过程再重复两次，添加另外的 氧化氘（D 20,1.5ml)并且搅拌30分钟。每次打开隔片加盖的瓶，并且添加试剂，用氩吹扫 瓶，并且用隔片快速密封。三次后，添加3ml D20。然后，将混合物搅拌1小时，接着去除上 清液。将此过程再重复12次，每次用氩吹扫瓶。用D 20(10ml)处理混合物并且在用氩吹扫 后保持密封过夜。小心去除上清液，接着以相同方式添加新鲜D20(10ml)。倾析出上清液。
[0136] 合成1-0-甲基a2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（结构III):向8克1-0-甲 基-a/0-D呋喃核糖苷添加10ml D20(10ml)。在旋转蒸发器上蒸发溶液。将此过程再重 复两次，每次使用l〇ml D20。将残余物溶解在160ml D20水中。将氘化阮内镍（40ml)转移 到溶液中。将氩鼓入反应混合物中，持续10分钟。然后，将反应混合物在氩氛围下维持在 110°C油浴中，持续7天。将反应混合物冷却至室温，并且通过硅藻土床层过滤并且用小体 积的去离子水洗涤。在旋转蒸发器上蒸发滤液。将残余物与吡啶共蒸发三次，并且使用直 接的真空线干燥另外6小时。所述过程得到6. 8g油状产物。
[0137] 合成1-0-甲基-a / 0 2, 3, 5-三苯甲酰基-2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（结构 IV):将干燥的1-0-甲基-a2, 3, 4, 5, 5'五氘-D呋喃核糖苷（III，6. 8g)置于圆底三颈 烧瓶中，并且配备压力平衡漏斗和磁性搅拌器。添加无水蒸馏二氯甲烷（34.1ml)。搅拌反 应混合物。接着添加无水吡啶（68.2ml)。在零摄氏度下搅拌溶液。随后，通过压力平衡漏 斗将苯甲酰氯（21.2ml)逐滴添加至密封的反应烧瓶中。添加苯甲酰氯后，去除压力平衡漏 斗并且用塞替换。将混合物在冰箱中在0-4°C下在密封的聚乙烯袋中保持48小时。将反应 倾倒在冰水混合物上，并且将反应混合物保持1小时。用氯仿萃取胶质材料，用冷（〇-5°C ) 饱和碳酸氢钠溶液洗涤，之后用盐水溶液洗涤。使有机层通过无水硫酸钠，并且在旋转蒸发 器上蒸发溶液。随后，将残余物与吡啶共蒸发，之后添加无水