。以植物病原真菌通用引物ITS1/ ITS4为第一轮反应引物，反应体系如上述常规PCR体系。反应程序中退火温度为58°C，其 他参数同上述常规PCR反应程序。然后以特异性引物，以第一轮PCR产物为模板进行第二 轮PCR扩增，所用引物为权利要求1所述的特异性引物HB1和HB2。体系同上，退火温度为 55. 8°C，其他参数不变。所有试剂均购于合肥志宏生物有限公司。取5ML扩增产物于1. 0% 琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为400bp的DNA条 带，则证明所检测样品中含有梨黑斑病菌。
[0019] 实施例2:制备DNA模板 提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下： 1.菌丝体的培养、收集及DNA提取 PDA培养基：琼脂粉20g，土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1L。
[0020] 将供试病菌转至PDA培养基平板上，20°C黑暗培养5d后从菌落边缘切取10块 2cmX 2cm菌落块，转至PDA液体培养基，28°C振荡培养7天，过滤收集菌丝，经液氮冷冻研磨 成粉，-20 °C保存备用。
[0021] 基因组DNA的提取依照分子克隆提供的CTAB法，具体操作如下： 取少量菌丝粉，加入900 y L 2% CTAB提取液和90 y L10%SDS，涡旋混匀，于60 °C水浴 lh，期间每隔lOmin上下颠倒几次，常温条件下12000rpm离心10min ;取上清，加入等体积 酚/氯仿/异戊醇（25 :24 :1 )，颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min ;将上清转移至 新的EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min ;上清转移 至新EP管中，加入1倍于上清体积的异丙醇，-20°C条件沉淀15min ;常温条件下12000rpm 离心5min，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，37°C条件下待乙醇挥发干；加适量灭菌超 纯水或者TE (pH8. 0)溶解沉淀(含20 y g/ml RNase)，37°C消解30min后电泳检测，-20°C 保存备用。
[0022] 2.发病植物组织DNA的提取 将供试病菌转至PDA培养基平板上，28°C黑暗培养5d后从菌落边缘切取2cmX 2cm菌 落块，创伤接种于石榴植株上。一段时间后切取发病组织提取基因组DNA，具体操作：取 一些发病的植株组织，每毫克组织加入l〇ML、〇. 5mol/LNaOH，在研钵中充分研磨后转移至 1. 5ml 的离心管中，12, OOOg 离心 5min，取 5ML 上清液加入 495ML、0. lmmol/L Tris (PH8. 0)， 混匀后取1ML直接用于PCR反应。
[0023] 实施例3:检测引物的特异性和灵敏度 一、特异性检测 本发明所用菌株及相关信息见表1。采用本发明所设计的特异性引物对表1中所有的 供试菌株基因组DNA进行PCR扩增，仅能从梨黑斑病菌菌株中特异地扩增出一条400bp的 条带，而其他供试菌株及空白对照均无扩增条带。表明该引物具有种属特异性，可以将梨黑 斑病菌与其他种属区分开。
[0024] 表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株_^^
上表中：+表示具有引物HB1/HB2的特异性扩增条带，长度为400bp 表示无扩增产 物。
[0025] 二、灵敏度检测 在25ML的反应体系中测定了上述所建立的检测体系的灵敏度，引物HB1和HB2可稳定 地从至少lng的基因组模板中扩增得到400bp的特异性条带。而以植物病原真菌的通用引 物ITS1和ITS4对梨黑斑病菌菌株不同浓度的基因组DNA进行PCR扩增的产物为模板，再 使用特异性引物HB1和HB2进行第二轮套式PCR扩增，可稳定地检测到10pg的基因组DNA， 使灵敏度提高了 100倍。
[0026] 实施例4 :植物病组织中的病原物检测 从人工接种的植物上剪取发病组织，提取DNA进行PCR扩增，发病样品均扩增出了 400bp的特异性条带，而健康植株扩增不出条带，说明该套技术能用于植物病组织中梨黑斑 病菌的快速分子检测。
【主权项】
1. 一种用于检测梨黑斑病菌的引物，包括一对引物，其特征在于：其上游引物序列 如HBl所述，下游引物序列如HB2所述，其中，HBl为：TCACCCTTGTCTTTTGCGTA，HB2为： ACCTTTGCTGATAGAGAGTG。2. -种利用权利要求1所述的引物检测梨黑斑病菌的方法，其特征在于：提取待测样 品的DNA作为模板，利用上述设计的的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测， 如果存在分子量为400bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有梨黑斑病菌。3. 根据权利要求2所述的检测梨黑斑病菌的方法，其特征在于：所述PCR反应的扩增 体系为：l〇XTaq buffer 2.5ML、25mmol/L MgCl2 2.〇ML、2.5mmol/L dNTP 2.〇ML、l〇Mmol/L 正反向引物各I. 〇ML、5U/L Tagase 0.2ML、20 ng/MLDNA模板2ML，补水至总体积25ML。4. 根据权利要求2所述的检测梨黑斑病菌的方法，其特征在于：所述PCR反应的反应 程序为：94°C、4min; 94°C、30 s, 55.8°C、30 s, 72°C、30 s, 35 个循环；72°C、10min，4°C 保存。5. -种利用权利要求1所述的引物检测梨黑斑病菌的方法，其特征在于，具体操作如 下：提取待测样品的DNA作为模板，利用两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模 板为提取待测样品的DNA，引物为真菌ITS序列通用引物ITSl和ITS4,第二轮PCR反应的 模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的引物HBl和HB2,取第二轮PCR反应扩增产物进 行凝胶电泳检测，如果存在分子量约为400bp的DNA条带，则证明所检样品中含有梨黑斑病 菌。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测梨黑斑病菌的引物，包括一对引物，其上游引物序列如HB1所述，下游引物序列如HB2所述,其中，HB1为：TCACCCTTGTCTTTTGCGTA，HB2为：ACCTTTGCTGATAGAGAGTG。及利用该引物检测梨黑斑病菌的方法。本发明通过设计一对特异性引物，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织中的梨黑斑病菌。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于田间调查和植物产品的检验，对控制梨黑斑病的大面积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105039535
【申请号】CN201510396232
【发明人】陈雨, 杨雪, 姚剑, 李云飞, 张爱芳, 谷春燕
【申请人】安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年9月9日