-322 和miR-497
[0135] 1.根据上述实例 1 所述方法制备pLVX-dMAN-miR-322、pLVX-dMAN-miR-497 以及 对照载体pLVX-dMAN-cel-39载体。
[0136] 2?细胞培养：
[0137]C2C12 细胞（购自ATCC,Manassas,VA)，10 %FBS-DMEM培养基（FBS购自Gibco， DMEM购自Hyclone)培养。收集生长状态良好的细胞，离心计数，以3X105/孔接种于6孔 板内，37 °C，5 %C02培养 24h。
[0138] 3.慢病毒包装：
[0139] 慢病毒包装所需细胞系为293T细胞系，所需质粒包括慢病毒表达载体 pLVX-dMAN或对照载体pLVX-dMAN-ce1 -39和病毒包装质粒（5质粒体系的第四代包装 质粒，Clontech)，在接种细胞及包装病毒的整个过程中，293T培养所用血清必须为不含 四环素的血清（FBS-tet-off，FTEU/0828812,Biontex)。细胞转染采用脂质体转染试剂 (Polysciences)，用10mMNaCl溶液分别稀释质粒和质脂体溶液，将质粒和脂质体混合后室 温静置约10分钟，缓慢逐滴加入细胞培养液中，轻轻转动几次使液体分布均匀。转染6小 时后弃除含有转染试剂的培养液，更换新鲜利用Tet-ofT血清配制的培养液。
[0140] 转染48-72小时后，收集含有病毒颗粒的细胞培养液，4000rpm室温离心10分钟以 去除沉底的细胞碎片，将上清液分装后，置于_80°C备用。
[0141] 包装好的慢病毒可用于感染所选的细胞，通过抗生素puromycin的筛选，杀死没 有感染的细胞，存活的细胞均可稳定过表达dMAN。待筛选完成后，用Trizol(TakaRa)裂解 细胞提取总RNA。
[0142] 4.miRNA检测：
[0143] 使用miRNA检测方法S-Poly(T)法，分别检测样本中miR-322和miR-497的 表达量，并以内参基因snoRNA234表达量进行归一化计算。结果如图1所示，与对照组 pLVX-dMAN-cel-39 相比，感染了pLVX-dMAN-miR-322 组的miR-322 表达量下调 53%，转染 了pLVX-dMAN-miR-497组的miR-497表达量下调42%，实验证明在C2C12细胞中慢病毒感 染本发明方法所构建的dMAN载体能够有效抑制miRNA。
[0144] 实施例4:局部注射pLVX-dMAN-miR-1载体抑制小鼠组织中miR-1
[0145] 1.根据上述实例1所述方法制备pLVX-dMAN-miR-1。
[0146] 2.活体局部组织注射：
[0147] 以2周龄Bal/BC小鼠作为研究对象，利用脂质体转染试剂 invivo-jetPET(Polyplus)，分别在第2、4、6周局部注射pLVX-dMAN-miR-1质粒或对照质粒 pLVX-dMAN-cel-39至胫前骨肌，每次每只按2. 5ug/20g进行注射。在第八周处死并提取胫 前骨肌样本提取总RNA。
[0148]3.miRNA检测：
[0149] 使用miRNA检测方法S-Poly(T)法，分别检测样本中miR-1的表达量，并以内参基 因snoRNA234表达量进行归一化计算。结果如图1所示，与对照组pLVX-dMAN-cel-39相比， 转染了PLVX-dMAN-miR-1组的miR-1表达量下调63%，实验证明在活体组织中瞬时转染本 发明方法所构建的dMAN载体能够有效抑制miRNA。
[0150] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。
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【主权项】
1. 一种microRNA抑制剂，其特征在于，所述一种microRNA抑制剂为双拷贝miRNA粘附 分子，由通用直链互补序列、通用茎环序列及2个miRNA结合区序列3部分组成。2. 根据权利要求1所述的microRNA抑制剂，其特征在于，所述通用直链互补序列为18 个碱基对；所述miRNA结合区序列与成熟miRNA序列互补，并在与miRNA 5'端第10、第11 位互补的碱基之间引入4个不配对的碱基；所述通用茎环序列其茎为8个碱基对，环为4个 喊基。3. -种用于表达如权利要求1~2所述的microRNA抑制剂的miRNA抑制剂表达载体， 其特征在于，包括： 背靠背连接的H1-U6双启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 通用受体载体pLVX-dMAN，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示； 双拷贝miRNA粘附分子的DNA序列。4. 一种如权利要求3所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下 步骤： 51、 以基因组为模板，Hl-F :5' -TGTGGTCTCATACAGAACTT-3' 和 H1-R:5'-CCGACCTTGGGAACGCT GACGTCAT-3' 为引物序列，扩增 Hl 启动子序 列；以基因组为模板，以 U6-F:5' -GTCAGCGITCCCAAGGTCGGG CAGG-3' 和 U6-R: 5'-GGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3'为引物序列，扩增U6启动子序列；将两个启动子序列配置在 同一体系中，再利用Hl-F和U6-R引物通过Overlap PCR，将两个启动子以背靠背方式进行 串联，构建成背靠背连接的H1-U6双启动子序列； 52、 以 dMAN-UN-F :5' -CGATAAAAAAGACGGCGCTAGGAGAGTCTTCTGAGACGCGTCTCTGCCAACTTG AGCTGAGTCGTCTTTTTTG-3 ' 和 dMAN-UN-R : 5 ' -AATTCAAAAAAGACGACTCAGCTCAAGTTGGCAGAGACGC GTCTCAGAAGACTCTCCTAGCGCCGTCTTTTTT-3'为用于构建通用受体载体的引物，通过引物退火 的方式形成双链片段，通过ClaI和XhoI位点，插入到商业化载体pLVX-puro中，构建成通 用受体载体； 53、 以Sl的H1-U6双启动子序列为模板，以4条用于构建dMN的引物，经过两轮PCR 扩增获得完整dMN序列，并通过限制性内切酶酶切及连接酶构建到S2的通用受体载体中， 构建成pLVX-dMAN载体。5. 根据权利要求4所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法，其特征在于，所述用于构 建dMN的引物的设计方法如下： SI 1、获取miRNA成熟序列，并转换成对应的DNA序列； 512、 在步骤Sll所得的DNA序列，5'端第10、第11位之间插入"ATCT"碱基，形成 antisense-MBS序列；并将antisense-MBS序列反向互补形成sense-MBS序列； 513、 根据步骤S12所得序列，设计4条用于构建dMN的引物： 引物 1 :5' -GTATTCTGTGACCAGAATACTTC-antisense-MBS-CTTGACTCTC-3'； 引物 2 :5' -GAATATAGGAATCTATATTCGGC-sense MBS-CGGAACTTGA-3'； 引物 3 :5' -ACCCGTCTCTCTTC-antisense-MBS-CTTGTATTCTGTGACCAGA-3'； 引物 4 :5' -GTGCGTCTCATGGC-sense MBS-CGGGAATATAGGAATCTAT-3'。6. 根据权利要求5所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法，其特征在于，miRNA成熟 序列为 mmu-miR-195、mmu-mi R-497 或 mmu-miR-322。7. 根据权利要求4所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法，其特征在于，S3具体包 括以下步骤： 以H1-U6双启动子序列为模板，利用引物1和引物2序列进行dMN第一轮扩增；随后以 第一轮扩增产物为模板，利用引物3和引物4进行dMN第二轮扩增，获得dMN表达序列； 将dMN表达序列与通用受体载体混匀置于含有相应限制性内切酶、连接酶、ATP及限 制性内切酶反应缓冲溶液体系中，将反应体系置于循环仪中，限制性内切酶酶切反应和连 接酶连接反应，将dMN表达序列连接到通用受体载体上，构建pLVX-dMAN载体； 转化Stbl3感受态细胞，以氨苄青霉素进行筛选，次日挑选单克隆培养所提质粒即为 pLVX-dMAN 载体。8. -种如权利要求3所述的miRNA抑制剂表达载体的应用，其特征在于，将所述miRNA 抑制剂表达载体用于制备治疗因miRNA的异常表达而引起的疾病的药物。9. 根据权利要求8所述的miRNA抑制剂表达载体的应用，其特征在于，将所述miRNA抑 制剂表达载体包装成慢病毒。
【专利摘要】本发明公开一种microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用，所述一种microRNA抑制剂为双拷贝miRNA粘附分子，由通用直链互补序列、通用茎环序列及2个miRNA结合区序列3部分组成。在构建好的表达载体中含有2个dMAN的表达框架，可以同时转录相同或不相同的两个MAN，载体利用率更高，病毒颗粒的使用量以及毒性更小。在构建方法上，本发明所述构建dMAN的方法更加经济，只需要合成2对不超过60个碱基的引物，通过2次PCR及其酶切和连接技术便可完成一个包含两个MAN结构miRNA抑制载体的一步克隆构建。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/113, A61P43/00, C12N15/867, A61K48/00
【公开号】CN105132424
【申请号】CN201510505280
【发明人】苟德明, 康康, 邱惠玲, 钟嘉胜, 罗兰
【申请人】深圳大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月17日