【具体实施方式】
[0036] 以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发 明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均 不脱离本发明的保护范畴。
[0037] 实施例1
[0038] 巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris的构建
[0039] 本实施例中的葡萄糖氧化酶基因GOD序列以及编码的蛋白序列如图1所示，其具 体制备及葡萄糖氧化酶基因G0D功能鉴定包括：
[0040] A、葡萄糖氧化酶基因G0D的全序列扩增和克隆；
[0041] B、葡萄糖氧化酶基因G0D转化毕赤酵母。
[0042] 步骤A葡萄糖氧化酶基因G0D的制备，其制备方法是以5 '端 ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和 3 '端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点 青霉DNA为模板，在扩增仪上按照98°C预变性5分钟；30个PCR循环：98°C变性30秒， 65°C退火30秒，72°C延伸1分钟；72°C延伸10分钟的程序进行PCR扩增；PCR反应均按 如下成份及用量进行：反应体系为50yL:基因组DNAlOOng，引物各0. 2ymol/L，dNTPs 250μmol/L, 5XQ5High-FidelityDNAPolymeraseBuffer10μL,Q5High-Fidelity DNAPolymerase0. 5μL。PCR产物跑1 %的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物通过T4DNA连 接酶连接到质粒PMD18-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α，然后涂布到具有氨苄青霉素的LB 平板上，37°C过夜培养直至菌落长出，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得葡萄糖氧 化酶基因G0D序列。
[0043] 步骤B的步骤如下：
[0044]A、通过PCR方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列 去除，引物序列如下：GodF:5'GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCGAC3'， 序列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点；G〇dR:5<GAGATGAGTT TTTGTTCTAGAGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC3 ^，序列中下划线部分为下游添加限制 性内切酶Notl识别位点；
[0045]B、PCR产物经纯化回收采GIBSON连接到表达载体pMD-AOX的EcoRI和Notl位点 上，转化到E.coliDH5a，酶切验证筛选阳性克隆，并送测序；
[0046]C、测序正确重组质粒pMD-A0X-G0D经PmeI酶切后线性化。用2μg线性化 pMD-AOX-GOD质粒电击转化80yL毕赤酵母PichiapastorisX33感受态细胞，然后将转 化细胞涂于含100μg/mlG418的YPD平板上，30°C培养96h;获得巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris〇
[0047] 实施例2
[0048] 巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris在试管中酶活的验证
[0049] 以实施例1获得的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris为生产菌，活化后在温度为 30°C、转速为200rpm条件下培养到0D600在1. 2左右的种子培养液以2%的接种量转入 YPCS培养基，于温度为30°C、转速为200rpm条件下培养；在YPCS培养基中培养至0D600 值为1. 2左右时，将酵母细胞转入YPCS诱导培养基，每天添加1 %甲醇诱导表达3天。
[0050] 培养基：种子和斜面培养基为YH)培养基：胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，葡萄糖 2% ;斜面培养基添加琼脂2%。含100 μ g/mL G418的YPCS培养基含有如下质量百分含量 的原料：胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，酪蛋白水解物2%，山梨醇0. 5%。
[0051]通过蛋白电泳（SDS-PAGE)得到一条如图4所示的分子量大小约为90kDa的蛋白 条带，同时在摇瓶中以1 %甲醇浓度诱导产葡萄糖氧化酶的能力，最高酶活为25U/mL，比野 生菌的酶活（14U/mL)提高了近0. 8倍。
[0052] 实施例3
[0053] 巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris在10L发酵罐上酶活的验证
[0054]将活化好的重组菌株接种于YH)培养基中，在温度为30°C、转速为200_250rpm培 养到0D600彡2时以3 %的接种量接种于BMGY培养基中，在温度为30°C、转速为250rpm培 养至0D600达到10左右。将培养好的BMGY发酵液以10%的接种量接入10L全自动发酵 罐。初始装液量6L，并加入4%〇ΡΤΜ1，每隔24h无菌操作添加无菌VC6mL，诱导48h后无 菌操作添加无菌VB212ml。
[0055] 菌体培养阶段：30°C通气搅拌培养18_24h，培养基中的甘油逐渐消耗，当甘油消 耗殆尽后菌体不再生长，此时D0会突然上升，稳定不变。培养过程中用氨水维持pH值5. 0 左右，此时菌体0D600约为90左右。
[0056] 碳源饲喂阶段：菌体培养阶段甘油耗尽后，连续流加50%甘油，每升甘油中含 12mLPTMl，流加速度为12mL/h/L，30°C培养4h，溶氧维持在0,pH用氨水维持在5. 0左右。 此步结束时0D600约为150-170之间。
[0057] 饥饿培养阶段：在诱导培养前，停止补料0. 5-lh，确认甘油完全耗尽。pH用氨水维 持在5.0。当甘油消耗完后菌体不再生长，此时D0会突然上升，稳定不变。此时菌体0D600 约为180。
[0058]诱导表达阶段：流加入诱导剂甲醇，每升甲醇中含12mlPTMl，流加速度为 3.0ml-5.0ml/h/L，在10小时后提高流加速度。山梨醇作为碳源流加，流加量是甲醇的 1/20,速度为0. 3ml-0. 5ml/h/L，在10个小时后提高流加速度，此时溶氧维持在0的水平， 在温度为30°C条件下培养。诱导时间达到120-144h。在诱导阶段，当提高培养基pH至 6. 0-6. 5,葡萄糖氧化酶的表达量可进一步提高，但是杂菌污染的概率会大大增加。
[0059] 诱导表达阶段结束后，巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris在10L发酵罐上的酶活 可达到594U/ml。
[0060] 培养基和试剂
[0061] BMGY培养基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，磷酸钾pH= 6.OlOOmM，YNB1. 34%，生 物素4X10-5 %，甘油1 %或甲醇0. 5 %;微量元素包括：硫酸铜6. 0g/L，碘化钠0. 08g/L，硫 酸锰3. 0g/L，钼酸钠0. 2g/L，硼酸0. 02g/L，氯化钴0. 5g/L，氯化锌20g/L，硫酸亚铁65g/L， 酸 5. 0mL/L，生物素(λ2g/L，VC80mg/L，VB2 :0· 5M，余量为水。
【主权项】
1. 葡萄糖氧化酶基因GOD，其特征在于其基因序列为SEQIDNo. 1。2. 萄萄糖氧化酶基因GOD的制备方法，其特征在于是以5 ^端ATGAAGTCC ACTATTATCACCTCCA和 3'端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点青霉DNA为模 板，采用PCR扩增方法获得。3. 利用萄萄糖氧化酶基因GOD编码的蛋白，其特征在于其序列为SEQIDNo. 2。4. 利用葡萄糖氧化酶基因GOD转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，其特征在于 其保藏编号为CGMCCNo. 11626。5. 根据权利要求4所述的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris的制备方法，其特征在于 其制备方法中的步骤如下： A、 通过PCR方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列去 除，引物序列如下：GodF:5'GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCGAC3'，序 列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点；G〇dR:5<GAGATGAGTTTTT GTTCTAGAGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC3^，序列中下划线部分为下游添加限制性 内切酶Notl识别位点； B、PCR产物经纯化回收采GIBSON连接到表达载体pMD-AOX的EcoRI和Notl位点上， 转化到E.coliDH5α，酶切验证筛选阳性克隆，并送测序； C、 测序正确重组质粒pMD-AOX-GOD经Pmel酶切后线性化，用2μg线性化pMD-AOX-GOD 质粒电击转化80μL毕赤酵母PichiapastorisX33感受态细胞，然后将转化细胞涂于 含100μg/mlG418的YPD平板上，30°C培养96h;获得巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris CGMCCNo. 11626。
【专利摘要】本发明属于新基因的制备，特别是指一种葡萄糖氧化酶基因GOD、利用其编码的蛋白以及转化的巴斯德毕赤酵母Pichia？pastoris。葡萄糖氧化酶基因GOD是以5′端ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和3′端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。本发明解决了目前重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达的问题，利用本发明获得了全长的GOD基因及其构建的穿梭表达载体，进一步转化到巴斯德毕赤酵母Pichia？pastoris，经筛选鉴定得到一株较原始菌株较高分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。本发明为进一步的工厂化生产大大节约了成本费用，提高了葡萄糖氧化酶的经济效益。CGMCC No.1162620151106
【IPC分类】C12R1/84, C12N1/19, C12N15/53, C12N15/10, C12N15/81, C12N9/04
【公开号】CN105420252
【申请号】CN201510893562
【发明人】高庆华, 胡美荣, 吴芳彤, 陶勇, 秦艳梅, 马清河, 王云鹏
【申请人】河北省微生物研究所, 中国科学院微生物研究所
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月7日