r>[0032] 抗菌肽的表达由组成型启动子控制，载体线性化后，去除抗生素抗性基因，通过信 号肽和锚定蛋白的控制，抗菌肽最终分泌到表达宿主乳酸菌细胞外，或者锚定展示在细胞 壁上。
[0033]本发明所述的乳酸菌是指卫生部颁发的《可用于食品的菌种名单》（卫办监督发 (2010)65号）所包含的所有乳酸菌属的所有菌株：即嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei)，卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，发酵乳杆菌（Lactobaci 1 lus fermentum)，格氏乳杆菌（Lactobaci 1 lus gasseri)，1尚 士字 L 杆菌（Lactobacillus helveticus)，约氏字L 杆菌 (Lactobaci 1 lus johnsonii )，副干酪乳杆菌（Lactobaci 1 lus paracasei)，植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)，鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)，唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，以及乳酸乳球菌 乳酸亚种（Lactococcus lactissubspecies lactis)等。
[0034] 本发明所述的抗菌肽和锚定蛋白都根据乳酸菌对密码子的使用偏好性对核苷酸 序列进行了优化，以利于在乳酸菌细胞表达。其优化原则为：TTCTTT ; GTAGTT; TCCTCT ; GAGGAA；TGCTGT；AGACGT；AGGCGT 〇
[0035] 本发明所述的LDH启动子指组成型启动子，该组成型启动子是干酪乳杆菌LDH启动 子的类似序列。
[0036] 与现有抗菌肽生产技术相比，本发明具有以下优势：
[0037] (1)由于所使用的表达系统及所有的表达调控原件都来自于食品级乳酸菌、干酪 乳酸菌自身，所以最终表达抗菌肽的重组乳酸菌是真正的食品级产品；
[0038] (2)抗菌肽展示在乳酸菌细胞壁表面，在宿主肠道内具有较高的稳定性，不容易在 肠道环境中降解，便于长期发挥作用。
[0039] (3)未使用乳酸菌表达常用的诱导型启动子，而使用组成型启动子，发酵时不需要 使用Nisin等诱导物，因而其生产工艺十分简便。
[0040] (4)与从蝇蛆直接提取的抗菌肽相比，表达抗菌肽的重组乳酸菌更加安全，规模化 生产成本更低。 (四）
【附图说明】
[0041 ]图1为抗菌肽和锚定蛋白的表达框示意图。
[0042]图2为重组乳酸菌抑制革兰氏阳性菌抑菌圈实验图，a为5微升菌悬液，b为10微升 菌悬液，c为20微升菌悬液，d为50微升菌悬液，CK为无菌水对照，1为1微升菌悬液，25为25微 升菌悬液，5为5微升菌悬液。
[0043]图3为重组乳酸菌抑制革兰氏阴性菌抑菌圈实验图，a为5微升菌悬液，b为10微升 菌悬液，c为20微升菌悬液，d为50微升菌悬液，CK为无菌水对照。 (五)
【具体实施方式】
[0044]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0045] 实施例1:抗菌肽和锚定蛋白编码基因密码子优化
[0046] 由于乳酸菌具有较强的密码子偏好性。因此为了能够使昆虫来源的抗菌肽基因 (核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列为SEQ ID N0.2)顺利在乳酸菌细胞高表达， 需要对其核苷酸系列进行优化，去除稀有密码子。其优化原则为:TTC-TTT; GTA-GTT; TCC ^TCT ； GAG^GAA ； TGC^TGT ； AGA^CGT ； AGG^CGT ；
[0047] 蝇蛆抗菌肽优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
[0048] 实施例2:抗菌肽和锚定蛋白表达框的构建
[0049] 抗菌肽的表达和定位是通过多个表达调控原件的组合使用来实现的。这些表达调 控原件包括启动子，信号肽序列，抗菌肽基因，锚定蛋白序列，以及各个表达调控原件之间 的连接序列（见图1)，抗菌肽表达框为:LDH启动子(SEQ ID N0.4)-信号肽(SEQ ID NO.5)-锚定蛋白（SEQ ID NO.6)-蝇蛆抗菌肽（SEQ ID NO. 3)。
[0050] 本发明中，抗菌肽的表达最终是以组成型启动子来控制的，该组成型启动子来源 于干酪乳杆菌乳酸脱氢酶(LDH)启动子，核苷酸序列为SEQ ID N0.4所示。
[0051 ]信号肽序列是乳杆菌USP45信号肽，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
[0052] 锚定蛋白核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
[0053] 锚定蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示。
[0054] 实施例3:alr基因（丙氨酸消旋酶)表达框的构建
[0055] 全基因合成乳酸菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PGADPH(核苷酸序列为SEQ ID N0.8所示），以植物乳杆菌基因组DNA为模板，使用引物alrF(SEQIDN0.10)和alrR(SEQID NO.11)，PCR扩增，获得air(丙氨酸消旋酶)基因（核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示）。
[0056] 以上述PGADPH基因片段（SEQ ID NO.8)和air的PCR扩增产物（SEQ ID NO.9)为模板， 加入引物PgadphF(SEQ ID N0.12)和alrR，将启动子PGADPH与alr基因融合，构建成功alr基因 表达框。
[0057] 融合PCR条件:94度预变性5min，94度变性lmin，58度退火30秒，72度延伸2分钟，32 循环。
[0058]实施例4:alr基因（丙氨酸消旋酶)缺陷型乳酸乳球菌株的构建
[0059] (1)带loxp位点的氯霉素抗性表达盒构建
[0060] 采用Overlapping PCR技术，将带有lox位点DNA片段(SEQ ID N0.13)，氯霉素抗性 基因表达框(SEQIDN0.14)，带有lox位点的DNA片段(SEQIDN0.15)，融合为一个DNA片段 (SEQ ID N0.16)，即为lox位点序列-氯霉素抗性基因表达框-lox位点序列。
[0061] (2)alr敲除盒构建
[0062] 克隆嗜酸乳杆菌菌株alr基因上游侧翼500bpDNA序列（SEQIDN0.17)，带lox位点 序列的氯霉素抗性基因表达框(SEQIDN0.16)，下游侧翼500bpDNA序列（SEQIDN0.18)， 将上述序列按照下述的顺序，融合成一个DNA片段：air基因上游500bp同源臂（SEQ ID N0.17)-lox位点序列-氯霉素抗性基因表达框-lox位点序列（SEQ ID N0.16)-alr基因下游 500bp同源臂(SEQ ID NO. 18)，这个融合后的DNA片段即为air敲除盒片段。克隆上游侧翼序 列用到的引物为UparmF和UparmR(SEQIDN0.19和SEQIDN0.20)，克隆下游侧翼序列用到 的引物为DownarmF和DownarmR(SEQ ID N0.21 和SEQ ID N0.22)。
[0063] (3)将步骤(2)构建的air敲除盒片段通过电击转化至乳酸乳球菌菌株，涂布抗性/ 丙氨酸平板。抗性/丙氨酸平板用M17琼脂培养基配置（购买于上海鼎国生物工程有限公 司），添加氯霉素浓度10微克/毫升，D-丙氨酸10毫克/毫升。配置MRS琼脂平板(培养基购买 于上海鼎国生物工程有限公司）。筛选在抗性/丙氨酸平板生长的菌落，而在MRS琼脂培养基 中不能生长的菌落，初步确定为阳性克隆。
[0064] 进一步通过菌落PCR验证，以获得双交换重组子。菌落PCR所用引物为UparmF和 DownarmR(SEQIDN0.1^PSEQIDN0.22)。
[0065] (4)含Cre重组酶编码基因的温敏质粒pFED760(红霉素抗性)转化步骤(3)通过验 证了的双交换重组子(需提前制备感受态），37°C培养于含10微克/毫升氯霉素和10毫克/毫 升D丙氨酸的MRS平板，菌落出现后平行转接点种于分别含有30微克/毫升红霉素和10微克/ 毫升氯霉素的MRS琼脂平板培养基，筛选对氯霉素敏感但有红霉素抗性的重组子，使用菌落 PCR方法验证氯霉素抗性基因的切除。
[0066] (5)将步骤(4)获得的重组子于10ml不含任何抗生素的MRS(添加 10毫克/毫升D丙 氨酸)培养基，37°C过夜培养，以使含有Cre重组酶编码基因的质粒丢失，将培养液涂MRS平 板，37°C过夜培养，取菌落平行涂板于含有30微克/毫升红霉素的MRS平板和不含任何抗生 素的MRS平板，以筛选对红霉素敏感的重组子，通过菌落PCR验证含有Cre重组酶编码基因的 质粒的丢失。确认为air基因（丙氨酸消旋酶)缺陷型无抗生素标记的乳酸乳球菌菌株。
[0067] 实施例5:表达蝇蛆抗菌肽食品级重组乳酸菌的构建，转化和筛选
[0068] (1)克隆乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16srDNA基因序列。
[0069] (2)克隆air基因表达框，以实施例3中的质粒为模板。
[0070] (3)0verlappingPCR技术将16srDNA上半片段（SEQIDN0·23)，抗菌肽表达框(实 施例2)，alr基因表达框(实施例3)，16srDNA下