一种β-琼胶酶编码基因及基因获取方法

专利名称：一种β-琼胶酶编码基因及基因获取方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种β -琼胶酶编码基因及其基因获 取方法。
背景技术：
琼胶酶(agarase，EC 3. 2. 1. 81)是一种可以降解琼胶的糖苷水解酶，主要存在 于微生物中，以海洋细菌最为突出。最先由Gran于1902年从海水中分离到一株琼胶降解 菌，80多年后由Buttner MJ等人首次克隆到一个琼胶酶基因，开启了人类对于琼胶酶的认 识。到目前为止发现的琼胶酶组成了一个较大的家族，根据其作用方式不同，可分为α-和 β-琼胶酶。α-琼胶酶降解琼胶的α-1，3糖苷键，生成不同聚合度的琼寡糖产物；β-琼 胶酶降解琼胶的β _1，4糖苷键，生成不同聚合度的新琼寡糖产物。根据氨基酸序列相似 性，琼胶酶又可分为不同的Glycoside Hydrolases(GHs)家族α -琼胶酶的GH96家族； β -琼胶酶的GH86、GH50和GH16家族。迄今只报道了两个α -琼胶酶，大部分都是β -琼 胶酶，其中又以GH16家族占据优势。琼胶酶的产酶菌多为海洋细菌。通过查阅资料、文献检索所知，Alterococcus, Alteromonas> Bacillus、Cytophaga> Microscilla> Microbulbifer> Pseudoalteromonas> Pseudomonas、Str印tomyces、Zobellia等属中的某些菌株可产生琼胶酶。中国专利200410023656. 1报道了一种从我国南海海域分离的生产琼胶酶的新 菌种 Alteromonas sp. nov. SY 37-12 (CCTCCM204009)。中国专利 200810121997. O 报道了 一株分离自东海沉积物的生产琼胶酶的新菌种需钠弧菌(Vibrio natriegens或简写为 V. natriegens)，菌种保藏号为CGMCC No. 2428。上述专利重点针对产酶菌株，单一菌株往往 具有多种琼胶酶的同工酶基因。目前大多数研究者都是采用文库构建的方法获取琼胶酶基因。但是文库构建需要 花费大量时间和精力，通过筛选数千个克隆才能获取阳性克隆，之后还要进行亚克隆等环 节。若有一种方法能基于同源克隆而直接从基因组中通过PCR扩增出目的基因部分序列， 则可以免去上述构建文库的繁琐工作，从而实现目的基因的高效获取。然而由于琼胶酶家 族多、公布的序列有限、彼此间差异较大，很难根据普通的克隆方法得到核心序列。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种从生产琼胶酶的菌株中克隆琼胶酶基因的方法，开 辟一条新的、快捷的途径，并将获得的琼胶酶基因用于重组菌株的构建并实现异源表达，最 终实现工业化生产琼胶酶。本发明的另一目的是利用该方法克隆到一个全新的琼胶酶基因。本发明所述的方法包括如下步骤(1)将已知琼胶酶进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列；(2)设计兼并引物；
(3)以菌株基因组为模板，利用兼并引物经PCR方法扩增琼胶酶基因的核心DNA序 列；(4)利用位点步进PCR方法扩增琼胶酶核心序列的侧翼序列，进而拼接得到琼胶酶全基因序列。该方法将目前发表的所有琼胶酶按照不同的家族如GH16、GH50、GH86和GH96等 进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列，或者也可以直接在软件Block Maker (http // bioinformatics. weizmann. ac. il/blocks/blockmkr/www/make_blocks. html)中进行比 对和寻找保守区域，然后利用软件 C0DEH0P(http//bioinformatics. weizmann. ac. il/ blocks/codehop. html)寻找可能的兼并引物。依据引物的基本原则和要求简并度尽可能 小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的TM值尽可能相近等，选择适 宜的兼并引物。利用该方法，我们利用GH50家族的兼并引物(上游引物GH50F 5，-AACTGGGGCTTC ACCACCYTNGGNAAYTGG-3，；下游引物 GH50R :5，-ACACGAAGCCCACGTTCTARTTYTCNCC-3，)，以中 国专利200810121997. 0中报道的需钠弧菌(保藏号CGMCC No. 2428)为模板进行PCR扩 增，结果得到一段940bp的琼胶酶基因核心序列(SeqID. NO 1的第1939位到2878位碱基 序列)。经Blastx比对，与已知最相似的琼胶酶基因序列(GenBank登录号BAG71428)相 似性为61%。然后，利用位点步进(SiteFinding)PCR技术(位点步进PCR是一种基因或染 色体步移技术，利用一段设定好的合成锚定序列在低温下结合到基因组特异位点，经已知 基因序列上的特异引物和合成锚定序列上的特异引物进行PCR反应，扩增出目的序列)扩 增出该核心序列的侧翼序列，经拼接得到一种全新的β-琼胶酶基因aga41的全长序列，其 特征在于全长2973bp (核苷酸序列如Seq ID. NO 1所述)。该基因编码990个氨基酸(氨 基酸序列如Seq ID. NO 2所述)，属于GH50家族，与已公布琼胶酶序列(GenBank登录号 BAG71428，氨基酸序列如Seq ID. NO :3所述)同源性低至49%。利用基因克隆技术，可将克隆到的琼胶酶基因连接到合适的载体上，并转化或转 染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组琼胶酶。合适的原核生物宿主包括各种细菌如 E. coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵 巢细胞)等，优选采用原核表达系统E. coli。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载 体。一个优选的例子是将本发明克隆到的琼胶酶基因aga41连接到大肠杆菌表达载体 pET28b (Novagen)上，并转化到大肠杆菌Rosetta中，经诱导表达出高活性的重组β -琼胶酶。本发明的方法能通过设计兼并引物，经PCR从需钠弧菌(保藏号CGMCC No. 2428) 基因组中直接扩增出琼胶酶基因aga41核心序列，然后利用位点步进PCR扩增核心序 列的侧翼序列，进而拼接得到全基因序列。本发明将得到的琼胶酶基因aga41成功构 建了重组表达质粒和重组表达菌株Rosetta，能产出活性表达的重组琼胶酶。本发明的方法能快速从新发现的琼胶酶生产菌株克隆出琼胶酶的基因并进行鉴 定，克服以往经文库构建获取琼胶酶基因的步骤繁琐、成功率低等缺点。获得的琼胶酶基因 可克隆到合适的宿主中实现异源表达，最终实现工业化生产琼胶酶，为后续的工业应用提 供成本低廉的琼胶酶起始材料。


图1为不同PH条件对β -琼胶酶活性的影响图2为不同温度条件对β -琼胶酶活性的影响
具体实施方式
实施例1 β -琼胶酶基因aga41核心序列的获取将目前公布的琼胶酶按照不同的家族GH16、GH50、GH86和GH96在软件ClusterW 中进行氨基酸多序列比对，找到保守序列，同时可在软件Block Maker中比对并寻找保守区 域，利用软件C0DEH0P搜查保守区域的兼并引物，选择合适的兼并引物进行PCR扩增。按此 方法通过氨基酸序列比对，从GH50家族的保守序列NWGFTSFGNW和ENYNVGFVSV设计出的兼 并引物(上游引物 GH50F 5，-AACTGGGGCTTCACCACCYTNGGNAAYTGG-3，；下游引物 GH50R 5，-ACACGAAGCCCACGTTCTARTTYTCNCC-3，)，以中国专利 200810121997. 0 中报道的需钠弧菌(保 藏号CGMCC No. 2428)为模板进行PCR扩增，获得一段β -琼胶酶基因aga41核心序列，为 940bp (Seq ID. NO 1的第1939位到2878位碱基序列)。实施例2 β -琼胶酶基因aga41侧翼序列的获取根据实施例1中得到的β -琼胶酶基因aga41核心序列，利用位点步进PCR技术 来扩增侧翼序列。具体做法如下基于核心序列设计扩增5’端上游序列的3个特异性嵌套引物GSPl :5’ -ATACAAACCACTACGCACTGGCGATT-3’ ；GSP2 :5， -GCAATACCGTCAACAATACAAACCACTA-3，；GSP3 :5， -GATTACGGGAGACCACCAACGAGTTAGT-3，；合成锚定序列位点5' -CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCTCAAGCGGCCGCNNNNNNGCCT-3，；合成特异性嵌套引物SFPl :5，-CACGACACGCTACTCAACAC-3，；SFP2 :5， -ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3，)；进行3轮PCR扩增1，位点步进PCR。PCR体系如下20yL反应体系中包含0. 5U的LA Taq酶及 其buffer，IOpmol合成锚定序列位点，dNTP混合物以及模板需钠弧菌(保藏号CGMCC No. 2428)基因组DNA。变温PCR条件如下92°C预变性2min，95°C变性lmin，25°C退火lmin， ramp to 68°C，3min，最后 68°C延伸 IOmin02，第一轮引物扩增。在上述位点步进PCR体系中加入5yL引物混合物(50pmol SFPl和IOpmol GSP1)，按照下列PCR程序进行扩增95°C变性lmin，按着进行30个二步PCR 循环(95°C变性10s，68°C退火延伸6min)，最后72°C延伸lOmin。3，第二轮引物扩增。以第一轮PGR产物稀释100倍为模板，以引物对GSP2和SFP2 进行第二轮巢式PCR，同时以引物对GSP3和SFP2进行平行的巢式扩增。PCR程序跟第一轮 引物扩增相同。由于引物GSP2和GSP3之间相差175bp，可以通过上述第二轮引物扩增产物 的电泳条带之间的相隔距离来进一步确认特异性PCR扩增。
经过上述多轮PCR确认得到特异性扩增产物，割胶回收后TA克隆，进行序列测定， 从而扩增出5’端上游序列。同样，设计扩增3’端下游序列的特异性基因引物GSP4 :5，-CTGATTGGGGGATAACACCTGAAG-3，；GSP5 :5， -GATGTGATGAGTTACAATCTTTACGCCA-3，； GSP6 :5， -AGTAGTGACAATCAACAAGGTCGTGC-3，)；按照上述同样的方法扩增出3’端下游序列的片段。然后经过序列拼接，得到基 因的全长序列。本发明得到的β-琼胶酶基因aga41全长为2973bp，共编码990个氨基 酸，其序列分别见Seq ID. NO :1和SeqID. NO :2，其与已公布的琼胶酶(GenBank登录号 BAG71428，氨基酸序列如Seq ID. NO :3所述)同源性低于50%，。实施例3 β -琼胶酶基因aga41的重组表达质粒和重组菌株的构建将本发明获得的β -琼胶酶基因aga41克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。首 先基于全长序列，设计扩增全基因的上游引物aga41F(5’ -CACTACCATATGTACTGTTCGTTTTA-3，，NdeI)和下游引物 aga41R(5，-ATTCTCGAGTCATTTGTTAATAGATC-3，，XhoI)，PCR 扩增确认 基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用NdeI和XhoI双酶切PCR产物，割 胶回收酶切后的片段，跟同样经过NdeI和XhoI双酶切的质粒pET28b连接，按照CaCl2转化 法转化到大肠杆菌DH5ci中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Axygen) 提取附性克隆的质粒，进而NdeI和XhoI双酶切鉴定，得到接近3kb的片段，经序列测定为 β _琼胶酶基因aga41。表明已经成功构建了表达质粒，将此重组表达质粒转化到大肠杆菌 Rosetta表达菌株中，构建了表达重组菌株。实施例4 利用重组表达菌株表达重组β -琼胶酶基因aga41将构建好的3ml重组表达菌株转接到IOOml含有20 μ g/ml卡那霉素和34 μ g/ ml氯霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D_达到0. 6，此时加入终浓度为0. ImM 的IPTG进行诱导表达，转入25 °C以150r/min振荡培养9h。离心收集菌体，重悬于 Mcilvane' sbuffer(pH 7.5)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，然后进 行NTA-Ni2+亲和柱层析，由于所表达的重组蛋白含有N端的6XHis tag,能亲和吸附到层 吸柱中，经过不同浓度(30、70、100和250mmol/L)的咪唑溶液梯度洗脱后，收集洗脱液。经 SDS-PAGE检测，得到电泳纯的重组β -琼胶酶蛋白Aga41。用Bradford方法测定蛋白质浓 度，得到约6mg/100ml发酵液的表达量。实施例5 重组β -琼胶酶Aga41的活性检测和酶特性分析利用DNS (3，5- 二硝基水杨酸)方法测定纯化的重组β _琼胶酶Aga41活性。具 体操作在Iml的反应体系中包括990 μ L含0. 25%琼脂糖的Mcilvane，s buffer (pH7. 5) 禾口 10μ L的纯化酶液，在40°C水浴中反应30min，取出500 μ L溶液加至500 μ L DNS溶液中， 煮沸5min后迅速冷却，进行吸光值A52tl的测定。同样方法，将失活的酶液作为对照用于调 零。测得的琼胶酶活性为1. 51U/ml。另外，将纯化的酶液直接滴于固体琼胶板上，可以观察 到明显的凹陷，用碘液染色后可以看到透明圈，表明这个重组表达的β-琼胶酶Aga41是具 有琼胶降解活性的，为后续的研究和应用提供了良好材料。经测定，β-琼胶酶Aga41的最适pH为7.5(如图1)，最适反应温度为40°C (如 图 2)，0. 5mM 到 5mM 的 Ca2+ 和 0. 5mM 的 Zn2+、Mn2+、Mg2+、Co2+ 能促进酶活性。
权利要求
一种编码β-琼胶酶的基因，其核苷酸序列与Seq ID.NO1所示序列一致。
2.权利要求1所述的基因编码的β-琼胶酶，其氨基酸序列与SeqID.NO :2所示序列一致。
3.携带有如权利要求1所述基因序列的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其为大肠杆菌载体pET28b。
5.一种宿主系统，其由权利要求3所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主 得到。
6.根据权利要求5所述的宿主系统，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主系统，其为大肠杆菌E.coli。
8.—种从生产琼胶酶的菌株中克隆琼胶酶基因的方法，包括如下步骤(1)将已知琼胶酶进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列；(2)设计兼并引物；(3)以菌株基因组为模板，利用兼并引物经PCR方法扩增琼胶酶基因的核心DNA序列；(4)利用位点步进PCR方法扩增琼胶酶核心序列的侧翼序列，进而拼接得到琼胶酶全 基因序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)为按照不同的琼胶酶 GH16、GH50、GH86、GH96家族等进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列，或者也可以直接 在软件Block Maker中进行比对和寻找保守区域。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)为利用软件C0DEH0P设 计兼并引物，依据的基本原则为简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能 大、上下游引物的Tm值尽可能相近等。
全文摘要
本发明公开了一种琼胶酶及其编码基因的获取方法。从海洋细菌需钠弧菌(保藏号CGMCC No.2428)中首次利用多种PCR方法获取该琼胶酶基因aga41，突破了以往通过构建文库筛选琼胶酶基因的传统方法。该琼胶酶基因aga41属于β-琼胶酶中的GH50家族，全长2973bp，编码990个氨基酸，与已知琼胶酶序列相似性最高为49％，为一种新型β-琼胶酶。将本发明的琼胶酶基因克隆到表达载体pET28b上，构建了重组大肠杆菌Rosetta菌株，经异源表达获得的活性重组琼胶酶可应用于工业生产。
文档编号C12N15/56GK101845447SQ201010170690
公开日2010年9月29日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者吴敏, 廖丽, 王春生, 许学伟 申请人:国家海洋局第二海洋研究所