专利名称：棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
虫害是制约农作物高产的重要因素。据统计，各种作物因虫害而遭受的经济损失平均达20 % 30 %，每年损失约数千亿美元。喷施化学农药、生物杀虫剂是目前主要的防治方法。由于人类对环境保护和自身健康意识的增强、害虫抗性、农药残留等因素使大量传统杀虫剂已经不适应现代农业发展的需要。利用基因工程手段培育抗虫新品种具有保护作用连续性、资源丰富、毒性专一、对环境污染小、周期短、成本低，目的性强等优点。因此，转基因抗虫植物的出现使抗虫问题可以在很大程度上解决。如来源于微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)毒蛋白基因已成功地转入各种作物及果树林木，来源于高等植物的植物凝集素基因也被用来获得转基因抗虫植物。虽然昆虫对转基因植物的抗性发展缓慢，但也是一个不容忽视的问题。转基因植物的大田抗性试验证明，经12次繁殖后昆虫便对Bt毒蛋白产生抗性，转单一晶体蛋白 (insecticidal crystal protein，ICP)基因的植物在生产上一般只能用8 10年。由此看来，昆虫的抗性是抗虫转基因工程中较为严重的潜在问题，迫切需要寻找新的方法或新的基因来有效或者特异的防治植物病虫害。RNA干扰(RNA interfefence，RNAi)现象是指利用内源性或外源性双链 RNA(double stranded RNA, dsRNA)介导细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、植物、 锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼、大小鼠等多种生物中。大多数昆虫也存在RNAi信号的系统性传播现象。有研究表明将dsRNA直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织，可引发远距离靶基因的特异性沉默。此外，除了直接注射dsRNA，还可以通过饲喂dsRNA的方法诱导昆虫产生RNAi现象。目前已有研究表明饲喂相应靶基因的dsRNA已成功降低苹浅褐卷蛾 (Epiphyas postvittana)幼虫羧酸酯酶表达水平、蜜蜂(Apismellifera)的雷帕霉素靶蛋白(targetof rapamycin, amTOR)(Helicoverpa armigera) P450SI3 的表达水平。因而，以RNAi技术为基础开发新的害虫防治方法，为农业害虫的防治提供了高特异性和环境安全的新策略。昆虫激素在昆虫的生长发育中起着极其重要的作用。调节昆虫发育的昆虫激素， 其合成、运输和代谢途径中所涉及的关键基因多数具有很强的物种特异性，即与其他物种的基因同源性低，尤其是与人类基因相比几乎没有同源性，这在很大程度上降低了 RNAi技术的“脱靶效应”，从而为应用安全性方面提供了保障。因此，在植物中表达昆虫激素相关基因的dsRNA，其优点在于只对植食性的昆虫有抑制作用，同时还可以根据昆虫激素相关基因的物种特异性，通过表达不同序列的dsRNA对某一种或某一属昆虫的生长发育产生影响， 从而达到精确、安全的控制虫害的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，名称为Ha-JHBP蛋白，获自鳞翅目夜蛾科昆虫棉铃虫 (Helicoverpa armigera),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与棉铃虫生长相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与棉铃虫生长相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第12至740位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在高严谨条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码棉铃虫生长相关蛋白的DNA 分子；4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码棉铃虫生长相关蛋白的DNA 分子。
3.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
4.含有序列表的序列2自5’末端第207至689位核苷酸的DNA片段或序列表的序列 6所示的RNA。
5.如权利要求4所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段为DNA片段甲、DNA片段乙或DNA片段丙；所述DNA片段甲如序列表的序列2自5’末端第207至689位核苷酸所示；所述DNA片段乙如序列表的序列2自5’末端第204至691位核苷酸所示；所述DNA片段丙为含有正向序列和反向序列的DNA，所述正向序列如序列表的序列4 自5’末端第15至497位核苷酸所示，所述反向序列如序列表的序列4自5’末端第711至 1193位核苷酸所示；所述DNA片段丙优选为序列表的序列4所示DNA。
6.含有权利要求4或5所述DNA片段的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为如下(I)或 (II)(I)将所述DNA片段丙插入重组质粒PC2300PN的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒PC2300PN为以植物表达载体pCAMBIA2300为骨架载体，在I3St I和EcoRI酶切位点之间插入序列表的序列8自5，末端第12至295位核苷酸所示的DNA，在I^stI和HindIII 酶切位点之间插入序列表的序列9自5’末端第14至194位核苷酸所示的DNA，得到的重组质粒；(II)将所述DNA片段甲或所述DNA片段乙插入细菌表达载体L4440的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组菌为将(II)所述的重组质粒导入大肠杆菌HTl 15 (DE!3)得到重组菌。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求5所述的DNA片段丙导入目的植物中，得到抗棉铃虫能力高于所述目的植物的转基因植物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述DNA片段丙通过权利要求7的(I)所述的重组质粒导入所述目的植物；所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物优选为烟草。
10.一种用于杀死棉铃虫的制剂，其活性成分为双链RNA，所述双链RNA的一条链如序列表的序列6自5’端第16至503位核苷酸所示。
全文摘要
本发明公开了一种棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与棉铃虫生长相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白的编码基因及其功能片段。利用本发明Ha-JHBP基因作为目的基因构建dsRNA植物表达载体，在植物中大量表达Ha-JHBP的dsRNA，提高了转基因植株的抗虫能力。本发明对于植食性昆虫的生物防治，植物抗虫基因工程，分子生物学领域发挥重要的应用价值。
文档编号C12N15/12GK102464710SQ201010539960
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者朱祯, 王晓芳 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所