专利名称：一种培养间充质干细胞的培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞与组织培养领域中的培养基配方，涉及一种无血清、化学成分清 晰的培养基配方，该培养基特别适用于体外培养人间充质干细胞。
背景技术：
间充质干细胞，英文名称为mesenchymal stem cells (MSC)，也有其它名称，如 骨髓基质细胞、脂肪干细胞等，是指单个或一群符合国际统一标准的细胞(DominiciM， Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotentmesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapyposition statement. Cytotherapy，2006 ；8 (4) :315_7)。在骨髓中，MSC属于非造血干细胞，具备向成 骨、成软骨和成脂肪细胞分化的能力，具有免疫调节和造血支持作用。最近的研究表明，MSC 也存在于其它组织，包括脂肪、脐带、胎盘和肌肉等。体外培养的MSC可以分泌多种生物活 性物质，具有促进新生血管形成，促进神经组织、骨组织、肝脏组织和胰岛组织损伤修复的 作用。因此，自体或异体MSC已经用于临床试验研究，以治疗移植物抗宿主病、肝脏纤维化、 脊髓损伤、糖尿病、外周血管病等多种疾病。另外，作为组织工程化骨和软骨构建中重要的 种子细胞，MSC也用于股骨头坏死、骨折后骨不连和软骨损伤的治疗。然而，涉及多种疾病 的细胞治疗需要一定的细胞量。为进行以MSC为基础的细胞治疗，人们通常获取少量的骨 髓，或获取脐带、脂肪或胎盘组织，在体外通过贴壁生长筛选并扩增MSC，待细胞量达到治疗 所需量时，收获MSC用于以上疾病的治疗。可见，体外扩增MSC是实施MSC细胞治疗的关键 步骤之一。通常，人们利用经筛选、适于人MSC生长的牛血清，作为细胞增殖的主要刺激物， 体外培养扩增MSC。然而，研究表明，在培养过程中，MSC可以吞噬培养体系中的牛蛋白，使 异种蛋白内在化，每IO8MSC中牛蛋白含量达到10-30mg(Spees几，GregoryCA, Singh H， Tucker HA, Peister A, Lynch PJ, Hsu SC, Smith J, Prockop DJ.Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymalstem cells for cell and gene therapy. Mol Ther 2004 ;9 :747_56)。因此，使用牛血清培养人MSC用于细胞治疗，不 仅将使病人暴露于罹患人畜共患病的风险，也可能因移植MSC死亡释放牛蛋白，引起机体 免疫反应，造成血清病或其它免疫性疾病。此外，每批次血清的活性是不同的，对批次间收 获的细胞的稳定性，有一定影响。因此，利用一种无动物血清成分的培养基，培养扩增MSC， 对治疗的安全性和有效性，都是十分必要的。为此，人们一直在寻找动物血清替代物，用于人MSC的培养。有人用血清替代物 Ultroser G替代牛血清，培养人骨髓MSC，获得了较好的效果(Meuleman N, TondreauT, Delforge A, Dejeneffe M, Massy M, Libertalis M, Bron D, Lagneaux L. Humanmarrow mesenchymal stem cell culture serum-free medium allows betterexpansion than classical alpha-MEM medium. Eur J Haematol 2006;76:309-16)。 然而，UltroserG本身就含有牛血清成分，这种方式的替代并不能从根本上解决异体蛋白污染问题 (Korhonen M. Culture of human mesenchymal stem cells inserum-free conditions :no breakthroughs yet. Eur J Haematol 2006 ;78 :167)。之后，有人提出应用人血小板浓缩 液替代牛血清，并获得了较好的效果。但是，血小板供者是否完全正常，这种使用方式能否 引起传染病的传播，以及能否保障所获得MSC的批次间稳定性等，都是必须考虑的问题。因 此，研制化学成分清晰明确、无动物血清成分的MSC培养基，是很有必要的。有人曾报道一种人脐带血MSC的无血清体系，血清替代成分为碱性成纤维细胞生 长因子(bFGF)、人白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITSE)和氢化考的松，可简称 为 FAITH，据报道效果较好(Liu CH,ffu ML, Hwang SM. Optimization of serumfree medium for cord blood mesenchymal stem cells. Biochemical EngineeringJournal, 2007 ；33 1-9)。然而，利用该体系进行人脐带MSC培养，发现细胞呈球形生长方式(见图1)；而且， 随着培养时间的延长，细胞出现自发分化现象，细胞的本质发生了变化。这可能与加入高 浓度的氢化考的松有关。皮质类激素，包括地塞米松和氢化考的松，在一定浓度下虽然能 刺激MSC增殖，也能使MSC发生非特异性分化(Williams JT, Southerland SS, Souza J， Calcutt AF,Cartledge RG. Cellsisolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating intomultiple mesodermal phenotypes. Am Surg. 1999 ；65 :22_6)。 因此可以认为，以bFGF-ITSE和氢化考的松等为主的血清替代物进行MSC培养，其本身的稳 定性和对干细胞多能性的维持，可能存在诸多不肯定的因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种无血清、化学成分清晰的适用于培养间充质干细胞的培养基。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种用于培养间充质干细胞的 培养基，命名为无血清培养基，缩写为SF-M(Serum-Free Medium)，该培养基组成包括(1) 经过改良的基础培养基IMDM ；⑵细胞生长因子组合；(3)胰岛素；⑷微量元素；(5)脂类 物质；(6)维生素类物质；(7)激素类物质；(8)蛋白质分子；(9)氨基酸类物质；(10)其它 化合物。所述(1)经过改良的基础培养基IMDM，是在商售IMDM基础上，添加至少包括生 物素(5-50 μ Μ,优选5-30 μ Μ)和谷氨酰胺(5_10 μ Μ,优选5-7. 5 μ Μ)在内的水溶性化合 物；所述水溶性化合物还可包括氯化铁(50-1000ng/mL)、氯化铬(0. 1_10 μ g/L)、氯化铜 (0. 1-lmg/L)、氯化锰 0. 01-0. lmg/L、氯化锌 0. 1-10 μ g/L 以及钼酸钠(lOO-lOOOng/mL)等 一种或多种。所述(2)细胞生长因子组合至少包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，I-IOOng/ mL，优选5-50ng/ml)和表皮生长因子(EGF，l_150ng/mL，优选25-100ng/ml)，还可包括激 活素 A(activin A，1-lOOng/ml，优选 5_50ng/ml)、转化生长因子-β (TGF-β，1-lOOng/mL， 优选5-50ng/ml)、骨形成蛋白(BMP，1-lOOng/mL，优选5_50ng/ml)、白血病抑制因子(LIF， Ι-lOOng/mL，优选 5_50ng/ml)、干细胞生长因子(SCF，1-lOOng/mL，优选 50_10ng/ml)、肝细 胞生长因子(HGF，l-100ng/mL,优选10_50ng/ml)、胰岛素样生长因子_1 (IGF-1，l_150ng/ mL,优选 25-100ng/ml)、促红细胞生成素(ΕΡ0,0. l_50U/mL，优选 0. 5_5U/ml)、血清素(l-100nM/L,优选 5-50nM/l)、血小板源生长因子 BB (PDGF-BB, l_150ng/mL，10_50ng/ml)、 白介素_6(IL-6，l-100ng/mL，优选5_50ng/ml)等其中一种或多种。所述(3)胰岛素添加量为1-100 μ g/mL (优选2. 5-20 μ g/ml)，可为临床级用药或 重组蛋白；所述⑷微量元素至少包括硒(ΙΟ-ΙΟΟηΜ，优选30nM)，以亚硒酸钠或其它化合物 形式提供；所述(5)脂类物质可为胆固醇(10-100 μ g/mL)，还可为亚油酸(l-50mg/L)、亚麻 酸(1-50 μ g/mL)、中链甘油三酯(1-500 μ g/mL)、卵磷脂(0. 1-20 μ g/mL)和注射用大豆油 (1-500 μ g/mL)等其中一种或多种。所述(6)维生素类物质(6)所述维生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种 中至少一种，包括维生素B组如Vit-B5 (1-100 μ Μ)、维生素A (1-200 μ Μ)、维生素C (50 μ g/ mL)、维生素E (10-100 μ g/mL)等其中的一种或多种。所述(7)激素类物质可为地塞米松(低于I(T9M)或氢化考的松(低于5 μ g/mL)。所述(8)蛋白质分子主要为注射用人白蛋白，添加量为l-50mg/mL(优选2_20mg/ ml)，也可包括其它分子，如转铁蛋白(10-100 μ g/ml，优选20-50 μ g/ml)、乙酰辅酶 A(0. 1-lOU/mL，优选 l_5U/ml)、辅酶 I (10-1000ng/ml，优选 25_200ng/ml)等。所述(9)氨基酸类物质指多种氨基酸复合物，包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨 酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、 苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸和甘氨酸等中的一种或多种，添加量为1-100 μ M。所述(10)其它化合物包含有二巯基乙醇(1 X IO-6M-I X 10_4Μ)和其它化合 物，包括还原型谷胱甘肽(0. l-10mg/L)、胶原或纤连蛋白或明胶(10 μ g-10mg/mL)、 wnt-3a(l-100ng/mL，优选 5-50ng/ml)和 Bio (5_250nM，优选低于 IOOnM)中的一种或多种。上述培养基在培养间充质干细胞中的应用也属于本发明内容。所述间充质干细胞 包括人骨髓和人脐带来源的，也包括其它组织或其它动物的间充质干细胞。本发明提供了一种无血清培养基，用于间充质干细胞，尤其是人间充质干细胞的 体外培养。本发明所提供的培养基不含血清或血浆(包括动物或人血清或血浆)，因此，使 用该体系培养间充质干细胞，在细胞治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患 病，以及因细胞治疗引起的人体免疫反应的风险。此外，该培养基化学成分明确清晰，避免 了因培养体系批次间差异，造成所培养的间充质干细胞性质不同的可能性。本发明的培养 基不仅适用于人骨髓和人脐带来源的间充质干细胞的培养，也可适用于其它组织或其它动 物间充质干细胞的培养，应用前景广阔。
图1为不同培养基培养的人脐带MSC细胞形态图2为不同培养基培养的人骨髓MSC表型分析结果图3为不同培养体系人脐带和骨髓MSC增殖特点图4为不同体系培养条件下人骨髓MSC分化特性
具体实施例方式本发明提供一种用于培养间充质干细胞的培养基，命名为无血清培养基，缩写为 SF-M(Serum-Free Medium)，该培养基组成包括⑴经过改良的基础培养基IMDM(Iscove’ s Modified Dulbecco' s Medium) ； (2)细胞生长因子组合；⑶胰岛素；(4)微量元素；⑶脂类物 质；(6)维生素类物质；(7)激素类物质；(8)蛋白质分子；(9)氨基酸类物质；(10)其它化合物。上述培养基中每类物质组成及特点描述如下，其中各物质后所列浓度，为在整体 培养基中的终浓度(1)所述经过改良的基础培养基IMDM，是在商售IMDM基础上，添加至少包括生 物素(5-50 μ Μ,优选5-30 μ Μ)和谷氨酰胺(5_10 μ Μ,优选5-7. 5 μ Μ)在内的水溶性化合 物；所述水溶性化合物还可包括氯化铁(50-1000ng/mL)、氯化铬(0. 1_10 μ g/L)、氯化铜 (0. 1-lmg/L)、氯化锰 0. 01-0. lmg/L、氯化锌 0. 1-10 μ g/L 以及钼酸钠(lOO-lOOOng/mL)等 一种或多种。进行改良后的基础培养基本身可促使间充质干细胞增殖速度增加。(2)所述细胞生长因子组合至少包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，I-IOOng/ mL，优选5-50ng/ml)和表皮生长因子(EGF，l_150ng/mL，优选25-100ng/ml)，还可包括激 活素 A(activin A，1-lOOng/ml，优选 5_50ng/ml)、转化生长因子-β (TGF-β，1-lOOng/mL， 优选5-50ng/ml)、骨形成蛋白(BMP，1-lOOng/mL，优选5_50ng/ml)、白血病抑制因子(LIF， Ι-lOOng/mL，优选 5_50ng/ml)、干细胞生长因子(SCF，1-lOOng/mL，优选 50_10ng/ml)、肝细 胞生长因子(HGF，l-100ng/mL,优选10_50ng/ml)、胰岛素样生长因子_1 (IGF-1，l_150ng/ mL,优选 25-100ng/ml)、促红细胞生成素(ΕΡ0,0. l_50U/mL，优选 0. 5_5U/ml)、血清素 (l-100nM/L,优选 5-50nM/l)、血小板源生长因子 BB (PDGF-BB, l_150ng/mL，10_50ng/ml)、 白介素-6(IL-6，l-100ng/mL，优选5-50ng/ml)等其中一种或多种。这些细胞因子和生长因 子，是始动间充质干细胞增殖的重要组成部分。(3)所述胰岛素添加量为1-100 μ g/mL (优选2. 5-20 μ g/ml)，可为临床级用药或 重组蛋白。胰岛素参与细胞糖代谢，也是其它无血清培养基常用的成分。(4)所述微量元素至少包括硒(IO-IOOnM)，以亚硒酸钠或其它化合物形式提供。 硒不但促进细胞增殖，也是细胞结构组成必要的成分。(5)所述脂类物质可为胆固醇(10-100 μ g/mL)，还可为亚油酸(l-50mg/L)、亚麻 酸(1-50 μ g/mL)、中链甘油三酯(1-500 μ g/mL)、卵磷脂(0. 1-20 μ g/mL)和注射用大豆油 (1-500 μ g/mL)等其中一种或多种。脂类是细胞膜结构的主要成分。(6)所述维生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种中至少一种，包括维生素 B 组如 Vit-B5 (1-100 μ Μ)、维生素 A (1-200 μ Μ)、维生素 C (50 μ g/mL)、维生素 E (10-100 μ g/ mL)等。添加维生素的目的在于基础培养基中维生素含量偏低，添加后能促进细胞增殖。(7)所述激素类物质可为地塞米松(低于10-9M)或氢化考的松(低于5 μ g/mL)。 皮质类激素是血清中促细胞增殖的成分之一，在无血清体系中添加，能促进间充质干细胞 增殖。(8)所述蛋白质分子主要为注射用人白蛋白，添加量为l-50mg/mL(优选2_20mg/ ml)，也可包括其它分子，如转铁蛋白(10-100 μ g/ml，优选20-50 μ g/ml)、乙酰辅酶 A(0. l-10U/mL，优选 l_5U/ml)、辅酶 I (10-1000ng/ml，优选 25_200ng/ml)等。作为一种载 体，白蛋白是细胞物质转运的关键分子。
(9)所述氨基酸类物质指多种氨基酸复合物，可包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙 氨酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨 酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸和甘氨酸等一种或多种的组合，添加量为1-100 μ M。 可以用商购的细胞培养用复合氨基酸的形式提供。氨基酸是细胞蛋白代谢的必需成分。(10)其它化合物所述培养基中还可包含有二巯基乙醇(1 X 10_6Μ-1 X 10_4Μ)和 其它化合物其中一种或多种，其中还原型谷胱甘肽(O. l-10mg/L，作为一种还原剂保护细 胞免受氧自由基的损害)，胶原或纤连蛋白或明胶(10 μ g-10mg/mL)以促进细胞贴壁、 wnt-3a(l-100ng/mL，优选 5-50ng/ml)以及 Bio (5_250nM，优选低于 IOOnM)以调节细胞增 殖。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。下述实施例及试验中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、无血清培养基SF-M的配方
组分添加物及添加量(1)经过改良的基础培 养基IMDM生物素(5μ\0和谷氨酰胺(5_)(2)细胞生长因子组合碱性成纤维细胞生长因子(bFTlF，10ng/mL)和表皮生长因子(KfiF，50ng/mL)(3)胰岛素5Pg./mL(4)微量元素亚硒酸钠30池.(5)脂类物质_醇(WmL)(6)维生素类物质维牛素 C (5(^g/mL)(7)激素类物质地塞米松(ICTmM)(8)蛋A质分子注射用人白蛋白5rag/mL，转铁蛋白100|Jg/ml(9)氨基酸类物质异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、H—氨酸各50μΜ(10)其它化合物二巯基乙醇(IXlO6M)、还原型谷胱甘肽(1. 5mg/L)、I型胶原(ImgZL)实施例2、无血清培养基SF-M的配方
权利要求
一种培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括(1)经过改良的基础培养基IMDM；(2)细胞生长因子组合；(3)胰岛素；(4)微量元素；(5)脂类物质；(6)维生素类物质；(7)激素类物质；(8)蛋白质分子；(9)氨基酸类物质；和(10)其它化合物。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述(1)经过改良的基础培养基 IMDM，是在商售IMDM基础上，添加至少包括生物素(5-50 iiM，优选5-30 iiM)和谷氨酰 胺(5-10 u M，优选5-7. 5 u M)在内的水溶性化合物；所述水溶性化合物还可包括氯化铁 (50-1000ng/mL)、氯化铬(0. 1-10 u g/L)、氯化铜(0. 1-lmg/L)、氯化锰 0. 01-0. lmg/L、氯化 锌0. 1-10 u g/L以及钼酸钠(100-1000ng/mL)等一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述(2)细胞生长因子组合至少 包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，l-100ng/mL，优选5-50ng/ml)和表皮生长因子(EGF， l-150ng/mL，优选 25-100ng/ml)，还可包括激活素 A (activin A, 1-lOOng/ml，优选 5_50ng/ ml)、转化生长因子(TGF-0，l-100ng/mL，优选 5_50ng/ml)、骨形成蛋白(BMP，l-100ng/ mL，优选5-50ng/ml)、白血病抑制因子(LIF，1-lOOng/mL，优选5_50ng/ml)、干细胞生长因 子(SCF，l-100ng/mL，优选 50-10ng/ml)、肝细胞生长因子(HGF，l-100ng/mL，优选 10_50ng/ ml)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1，l-150ng/mL，优选25-lOOng/ml)、促红细胞生成素(EP0， 0. l-50U/mL,优选0. 5-5U/ml)、血清素(l-100nM/L，优选5_50nM/l)、血小板源生长因子 BB (PDGF-BB, l_150ng/mL，10_50ng/ml)、白介素-6(IL_6，1-lOOng/mL，优选 5_50ng/ml)等 其中一种或多种。
4.根据权利要求1或2或3所述的培养基，其特征在于所述(3)胰岛素添加量为 1-lOOy g/mL(优选2. 5-20 y g/ml)，可为临床级用药或重组蛋白；所述(4)微量元素至少包 括硒(lO-lOOnM，优选30nM)，以亚硒酸钠或其它化合物形式提供；所述(7)激素类物质可为 地塞米松(低于10_9M)或氢化考的松(低于5 y g/mL)。
5.根据前述权利要求1至4之一所述的培养基，其特征在于所述(5)脂类物质可为 胆固醇(10-100 i! g/mL)，还可为亚油酸(l_50mg/L)、亚麻酸(1_50 y g/mL)、中链甘油三酯 (1-500 ii g/mL)、卵磷脂(0. 1-20 u g/mL)和注射用大豆油(1-500 u g/mL)等其中一种或多 种。
6.根据前述权利要求1至5之一所述的培养基，其特征在于所述(6)维生素类物 质(6)所述维生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种中至少一种，包括维生素B组如 Vit-B5 (1-100 u M)、维生素 A (1-200 u M)、维生素 C (50 u g/mL)、维生素 E (10-100 u g/mL)等 其中的一种或多种。
7.根据前述权利要求1至6之一所述的培养基，其特征在于所述(8)蛋白质分子主 要为注射用人白蛋白，添加量为l-50mg/mL(优选2-20mg/ml)，也可包括其它分子，如转铁 蛋白(10-100iig/ml，优选 20-50iig/ml)、乙酰辅酶 A(0. 1-lOU/mL，优选 l_5U/ml)、辅酶 I(10-1000ng/ml，优选 25_200ng/ml)等。
8.根据前述权利要求1至7之一所述的培养基，其特征在于所述(9)氨基酸类物质 指多种氨基酸复合物，包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、 L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、胱 氨酸和甘氨酸等中的一种或多种，添加量为1-100 yM。
9.根据前述权利要求1至8之一所述的培养基，其特征在于所述(10)其它化合物包含有二巯基乙醇(1X10_6M-1X10_4M)和其它化合物，包括还原型谷胱甘肽(0. l-10mg/ L)、胶原或纤连蛋白或明胶(10 ii g-10mg/mL)、wnt_3a(1-lOOng/mL，优选 5_50ng/ml)和 Bio(5-250nM，优选低于lOOnM)中的一种或多种。
10.权利要求1-9任一项所述的培养基在培养间充质干细胞中的应用，所述间充质干 细胞包括人骨髓和人脐带来源的，也包括其它组织或其它动物来源的间充质干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种培养间充质干细胞的培养基。该培养基组成包括经过改良的基础培养基IMDM；细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质和其它化合物。本发明所提供的培养基不含血清或血浆(包括动物或人血清或血浆)，因此，使用该体系培养间充质干细胞，在细胞治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病，避免细胞治疗过程中可能引起的人体免疫反应的风险。该培养基化学成分明确，避免了因培养体系批次间差异，造成所培养的间充质干细胞性质不同的可能性。该培养基不仅适用于人骨髓和脐带来源的间充质干细胞的培养，也可适用于其它组织或其它动物间充质干细胞的培养，应用前景广阔。
文档编号C12N5/0775GK101984048SQ20101056487
公开日2011年3月9日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者吕君, 吴祖泽, 常菁, 王立生, 郭子宽, 靳继德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所