专利名称：一种吲哚化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药物化学领域，涉及一种吲哚化合物及其制备方法与用途。
背景技术：
理想的镇痛药应能够完全缓解疼痛，并不导致严重副作用，不会引起药物的耐 受、依赖及滥用。目前，最常用的镇痛药是非甾体抗炎药(NSAID)和阿片类，由于其副作 用和成瘾性，在临床上的应用受到了很大的限制，因此寻找和开发新型镇痛药已成为疼 痛治疗中的重要内容。天然产物一直以来都是药物的重要来源，大麻作为草药治疗疼痛 在民间已有数千年历史。各种研究结果表明，大麻素受体在体内广泛分布，内源性大麻 素和各种合成大麻素参与多水平疼痛信号的调节，在镇痛方面发挥着重要作用。因此， 利用内源性大麻素降解酶中的脂肪酰胺水解酶(Fatty Acid Amide Hydrolase, FAAH) 和单酰基甘油酯酶(Monoacylglycerol Lipase，MGL)筛选化合物，有望发现新型镇痛 药先导化合物(1、AhnK, Johnson DS, Cravatt BF. Fatty acid amide hydrolase as a potential therapeutic target for thetreatment of pain and CNS disorders[J]. Expert Opin Drug Discov. 2009 ;4 (7) :763-784.)。目前陆地资源的不断开发，发现新的 代谢物的可能性日趋减少，带来了对新的生物来源的强烈需求，向海洋要药的研究已掀起 热潮。特殊的生活环境，使得深海微生物代谢产物结构新颖、活性独特，可以预测海洋微生 物将成为开发新型医药品的重要资源(2、Kosta S，Jain R，andTiwari A. Marine Fungi Potential Source of Pharmacological Compounds[J]. Pharmacologyonline,2008,1 (1) 1-3)。然而，由于微生物群落及其栖息环境的特殊性和复杂性，在实验室条件下，难以模 拟和重现其生活的原始环境，致使环境中仍有高达99%的微生物未能得到纯培养。宏基 因组学可避开了环境微生物分离培养的障碍，在挖掘和利用未培养微生物资源、筛选新颖 生物活性物质方面具有极其巨大的潜力(3、Amann, R. I.，Ludwig, W.，Schleifer，K. H.， Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells withoutcultivation[J]. Microbiol. Rev. 1995,59,143-169)。随着疼痛机制的研究、宏基 因组学技术和色谱技术的发展和完善，在不久的将来第一个宏基因组新型天然镇痛药物必 将推向市场。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种吲哚化合物。本发明的第二目的在于提供一种吲哚化合物的制备方法。本发明的第三目的在于提供一种吲哚化合物在制备镇痛药物中的应用。所述一种吲哚化合物的化学名为N-{[1_(对乙酰氨基-苯基)-1-(1Η-吲哚-3 基)-3-羟基]丙烷-2基} -2，2氯乙酰胺，命名为PIHA，分子式为C21H21C12N3O3,相对分子质 量为433，呈油状，结构式为
所述一种吲哚化合物的制备方法包括以下步骤1)大肠杆菌EPI3005C11接种至培养基中进行发酵，收集发酵后的发酵液；所述大 肠杆菌 EPI3005C11 (Escherichia coli EPI3005C11)于 2010 年 9 月 21 日保藏于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO =M 2010243 ；2)将发酵液加入大孔吸附树脂，水洗除去杂质，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部 分，回收乙醇即得浸膏；3)将所得浸膏进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，在氯仿中添加甲醇，收集 得到16个组分；反相薄层分析所得的16个组分，合并氯仿-甲醇洗脱物的第9组分，进行 ODS柱层析，以甲醇和水作为流动相，10%甲醇至100%甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇洗脱 部分，浓缩，干燥，即得PIHA粗品；4)将PIHA粗品加至ODS制备柱，进行液相色谱分析，收集20min PIHA主峰，浓缩， 干燥，即得PIHA。在步骤1)中，所述培养基可为LB培养基，所述发酵的条件为温度37°C，培养时 间10 36h。在步骤3)中，所述氯仿与甲醇的体积比可为5 1。在步骤4)中，所述液相色谱分析可采用Varian型液相色谱仪，二极管阵列检测器 的检测波长可为210nm，以40%甲醇/水为流动相，流速可为8ml/min。本发明利用从深海中提取的微生物进行发酵，分离纯化获得了一种吲哚化合物 N-{[1-(对乙酰氨基-苯基)-1-(1H-吲哚-3基)-3-羟基]丙烷-2基}-2，2氯乙酰胺，命 名为PIHA。PIHA结构独特，具有很强的镇痛活性，具有开发为镇痛药物的潜能，在制备镇痛 瘤药物上有广泛的应用。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。实施例1克隆子的筛选1)深海沉积物样品的富集取出4°C保存的采集于西南印度洋278 !深海的沉积 物样品I0g，于人工海水放线菌富集培养基进行富集培养；2)深海沉积物富集样品DNA提取加入DNA提取缓冲液，使细胞裂解，然后从样品 中直接提取DNA并纯化；3)深海沉积物富集样品宏基因组文库的构建所用质粒载体为R)smid，插入片段 30 401Λ，宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)，获得约4000个克隆子，其中编号为5C11 克隆子的LB发酵液的乙酸乙酯粗提物在lOOug/ml浓度下对FAAH和MGL具有良好的活性，
4其活性均大于70%。4)将包含克隆子 5C11 的大肠杆菌 EPI3005C11 (Escherichia coli EPI3005C11) 于2010年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO :M 2010243。实施例2PIHA的制备1、包含克隆子5C11的大肠杆菌EPI3005C11的发酵大肠杆菌EPI3005C11接种至3ml培养基，37°C、200rpm培养10h。将初级培养物 取Iml接种至500ml培养基，37°C、200rpm培养20h后，接种至100升发酵罐，37°C、60L/min 通气量，200rpm，pH7. 0发酵36h，利用连续流离心机分别收集菌体和菌液。2、发酵液提取80L发酵液上大孔吸附树脂(AB-8，10L)吸附，30L水洗除去杂质后，用33L乙醇洗 脱，收集乙醇洗脱部分，回收乙醇得浸膏63. 48g。3、PIHA的分离与纯化1)取步骤2)所得的浸膏进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，逐步在氯仿中 添加甲醇直至氯仿与甲醇体积比为5 1，硅胶薄层层析检测流分，收集得到16个组分；2)反向薄层分析16个组分，合并氯仿-甲醇25 1洗脱物第9组分(0. 82g)进 行ODS柱层析，以甲醇和水作为流动相，10%甲醇至100%甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇洗 脱部分，浓缩，干燥，即得PIHA粗品；3)将PIHA粗品放至ODS制备柱(SHMADZU C1820X250mm)进行HPLC制备，仪器 Varian, 二极管阵列检测器的检测波长210nm，以40%甲醇/水为流动相，流速Sml/min，收 集20min PIHA主峰，浓缩，干燥，即得PIHA 3mgo4、PIHA 的鉴定通过波谱和理化性质鉴定化合物，确定所得为新的吲哚化合物，化学名为 Ν-{[1-(对乙酰氨基-苯基)-1-(1Η-吲哚-3基)-3-羟基]丙烷-2基}-2，2氯乙酰胺，命 名为PIHA。其结构式如下
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权利要求
1. 一种吲哚化合物，其特征在于其化学名为N- {[1-(对乙酰氨基-苯基)-1- (1H-吲 哚-3基)-3-羟基]丙烷-2基} -2，2氯乙酰胺，命名为PIHA,分子式为C21H21Cl2N3O3,相对 分子质量为433，呈油状，结构式为
2.如权利要求1所述的一种吲哚化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)大肠杆菌EPI3005C11接种至培养基中进行发酵，收集发酵后的发酵液；所述大肠杆 菌EPI3005C11于2010年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为 CCTCC NO :M 2010243 ；2)将发酵液加入大孔吸附树脂，水洗除去杂质，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，回 收乙醇即得浸膏；3)将所得浸膏进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，在氯仿中添加甲醇，收集得到 16个组分；反相薄层分析所得的16个组分，合并氯仿-甲醇洗脱物的第9组分，进行ODS柱 层析，以甲醇和水作为流动相，10%甲醇至100%甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇洗脱部分， 浓缩，干燥，即得吲哚化合物粗品；4)将吲哚化合物粗品加至ODS制备柱，进行液相色谱分析，收集20min吲哚化合物主 峰，浓缩，干燥，即得吲哚化合物。
3.如权利要求2所述的一种吲哚化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培 养基为LB培养基。
4.如权利要求2所述的一种吲哚化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述发 酵的条件为温度37°C，培养时间10 36h。
5.如权利要求2所述的一种吲哚化合物的制备方法，其特征在于在步骤；3)中，所述氯 仿与甲醇的体积比为5 1。
6.如权利要求2所述的一种吲哚化合物的制备方法，其特征在于在步骤3)中，在步 骤4)中，所述液相色谱分析采用Varian型液相色谱仪，二极管阵列检测器的检测波长为 210nm,以40%甲醇/水为流动相，流速为8ml/min。
7.如权利要求1所述的一种吲哚化合物在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
一种吲哚化合物及其制备方法和用途。属于药物化学领域，提供一种吲哚化合物及其制备方法和用途。所述吲哚化合物的化学名为N-{[1-(对乙酰氨基-苯基)-1-(1H-吲哚-3基)-3-羟基]丙烷-2基}-2，2氯乙酰胺，命名为PIHA，分子式为C21H21Cl2N3O3，相对分子质量为433。制备方法包括大肠杆菌EPI3005C11接种至培养基中进行发酵，收集发酵后的发酵液，分离纯化发酵液即得PIHA。PIHA结构独特，具有很强的镇痛活性，具有开发为镇痛药物的潜能，在制备镇痛瘤药物上有广泛的应用。
文档编号C12P17/10GK102070508SQ20101057339
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者丘鹰昆, 吴振, 庄萍, 易志伟, 汤熙翔, 肖湘, 陈琳 申请人:厦门大学, 国家海洋局第三海洋研究所