专利名称：检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测肺炎支原体的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行肺炎支原体检测的方法和试剂盒。
背景技术：
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是引起呼吸道感染的重要致病菌之一， 10% 40%的社区获得性肺炎是由肺炎支原体感染引起的。目前国内临床对于肺炎支原体的检测技术有限，造成了抗生素的滥用，增加了医疗负担。由于肺炎支原体分离培养技术复杂且耗时，其检测技术主要依靠血清学检测和核酸检测。近些年出现的荧光PCR检测技术凭借其快捷，高灵敏度和特异度的优势，越来越广泛的应用于临床肺炎支原体感染检测。 国外已报道多种肺炎支原体荧光PCR检测体系，检测灵敏度和特异度均已经超过血清学检测技术，荧光PCR检测技术逐渐成为临床肺炎支原体检测的“金标准”。针对肺炎支原体检测的荧光PCR技术主要以TaqMan探针检测体系为主，方法灵敏度高，特异度好。目前报道的检测肺炎支原体的荧光PCR检测的基因主要有AIPase operon gene, R印MPl和CARDS toxin gene，其检测灵敏度在几十CFU到几个CFU之间。(参考文献①Daxboeck，F.，G. Khanakah,C. Bauer,M. Stadler,H. Hofmann,and G. Stanek. 2005. Detection of Mycoplasma pneumoniae in serum specimens from patients with mycoplasma pneumonia by PCR. Int. J. Med. Microbiol. 295 :279-285 ；② Dumke, R. , N. Schurwanz, Μ. Lenz, Μ. Schuppler, C. Luck, and Ε. Jacobs. 2007. Sensitive detection of Mycoplasma pneumoniae in human respiratory tract samples by optimized real-time PCR approach. J. Clin. Microbiol. 45 :2726-2730 ；③ Winchell，J. M.，K. A. Thurman, S. L. Mitchell, W. L. Thacker, and B.S.Fields. 2008. Evaluation of three real-time PCR assays for detection ofMycoplasma pneumoniae in an outbreak investigation. J. Clin. Microbiol.46 3116-3118.)虽然肺炎支原体荧光PCR检测技术非常成熟，但是基本所有检测方法都是国外学者报道的，其设计探针引物及体系验证均使用的国外菌株。由于NCBI数据库中还没有国内菌株Pl基因序列，所以这些方法虽然国内也在使用，但对于中国肺炎支原体菌株检测的灵敏度和特异性缺乏真正意义上的比较。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测肺炎支原体的特异性靶序列；本发明的还在于提供上述靶序列的用途，以提高对中国国内肺炎支原体菌株的检测能力。为实现上述目的，通过对本实验室分离到的60株国内肺炎支原体pi基因和NCBI 数据库已报道的Pl基因序列比对，通过BLAST软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，发现了核苷酸完全保守区域^2bp:nt 1676-nt 1937 (相对于肺炎支原体标准菌株MU9)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，该靶序列是检测肺炎支原体的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测肺炎支原体的遗传标记物。进一步，本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。可以使用诸如I^rimer Express Version 3等软件来设计探针和引物。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20_50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补，其5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。本发明探针和引物不但适用于已报道的国外肺炎支原体菌株扩增还适用国内肺炎支原体扩增检测。在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为MpP1-FP 5，-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3，，MpPl-RP :5，-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3，；探针序列为 (FAM) 5，-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3，(BHQl)。本发明提供一种肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR， 同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下Ct值小于等于38的标本为阳性结果；Ct值大于40的标本为阴性性结果；Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25μ 1反应体系时，其优选配置
为
MpPl-FP MpPl-RP
探针
Platium quantitative PCR super Mix UDG MgCl2
Platium Taq
PCR nucleotide Mix (Promega C1141)
Nuclease-Free Water
模板 本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性3min，1个循环；95°C变性
25μΜ0.5μ1 25μΜ0.5μ1 25μΜ 0.2μ1 12.5μ1
50πιΜ2.0μ1
0.25μ1
Ι.ΟμΙ
3.05μ1 5.0μ1IOs, 55 65°C退火30s,45个循环。本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性3min，1个循环；95°C 变性10s，59°C退火30s，45个循环。本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用有效扩增NTC(_)ANDP0S(+)无效扩增NTC(+)AND POS (+)提示体系污染无效扩增NTC(_)AND POS(-)提示体系错误或者试剂失效。只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否者试验需要重复。在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下Ct值小于等于38的标本为阳性结果；Ct值大于40的标本为阴性结果；Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。本发明提供了一种用于肺炎支原体检测的试剂盒，其包括上述遗传标记物或其特异性片段的特异性引物以及配合引物使用的Taqman探针。本发明试剂盒的引物序列为MpPl-FP CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT,MpPl-RP :AACGAGTTCCCTACCAACGAAC，探针序列为FAM-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-BHQ1。本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为肺炎支原体基因组DNA，例如浓度为1.62ng/ul的肺炎支原体基因组DNA。本发明在实施例6对试剂盒的检测时间和检测灵敏度进行了比较实验发现与现有两种商品化试剂盒检测时间相比，本发明试剂盒检测时间可缩短半小时左右，并且其实际检测灵敏度比前两者高一个数量级。可见对于实际标准品的检测灵敏度本发明的试剂盒优于上述两种产品化试剂盒。本发明提供了用于检测肺炎支原体的pi基因保守区域靶序列，以及以该序列为基础设计的引物和探针，具有较强的特异性，利用该引物和探针进行肺炎支原体的荧光定量PCR检测方法进一步简化肺炎支原体的检测的程序、缩短检测周期，用于检测国内的分离肺炎支原体株，可作为检测临床标本的手段，提高肺炎支原体检测的阳性率。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性阳性对照，该试剂盒的推广应用有利于快速、准确地鉴定肺炎支原体的感染情况。
图1为荧光定量PCR检测体系优化结果，图Ia为不同镁离子浓度体系优化检测结果；图Ib为不同退火温度体系优化检测结果；图2为MpPl体系标准曲线图，其中横坐标为阳性模板浓度的对数值，纵坐标为 MpPl体系检测不同浓度阳性模板的Ct值，R2 = 0. 996 ；
图3. MpPl体系real-time PCR的特异度检测，除阳性模板对照外，其余表1中所有模板均无扩增。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例160株肺炎支原体临床分离株Pl基因全长扩增，测序，序列比对和探针、引物设计。普通PCR引物序列为Plprimer-F 5' -ATGCACCAAACCAAAAAAACTGCCT-3‘Plprimer-R 5' -CTAAGCGGGTTTTTTAGGTGGTTGC-3’使用TAKARALA Taq kit(DRR200A)扩增，反应体系
TAKARA LA Taq0.25ul
IOxLA PCR buffer II2. 5ul
dNTP Mixture4ul
primer-F (10 μ M)O.lul
primer-R (10 μ M)O.lul
Nuclease-Free Water 17.05ul 模板Iul扩增条件
94 °C 5min 94 °C Imin
} 30个循环
68 °C 4min 72 °C 5min扩增产物由华大基因公司(BGI)测序及序列拼接，将拼接并经人工校对后的60条 Pl基因序列及NCBI数据库所有已报道pi基因序列使用Vector NTI Suite 6软件序列比对，寻找出保守区域。Pl基因是肺炎支原体本身特有的功能性基因序列，通过对60株国内肺炎支原体Pl基因和NCBI数据库已报道的pi基因序列比对，发现了核苷酸完全保守区域 262bp :nt 1676 nt 1937 (相对于标准菌株MU9)，核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。使用I^rimer Express Version 3软件在保守序列区域设计探针及引物MpPl-FP 5，-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3，，MpPl-RP :5，-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3，；MpPl-探针(FAM)5，-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3，(BHQl)。
虽然引物和探针与靶序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性的扩增出所需的片段。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明的范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明的靶序列或其片段。实施例2实时荧光定量PCR实验参数的优化(1)体系镁离子浓度优化将体系中MgCl2从0. 5ul依次递增为如1，每次增幅 0. 5ul，每个浓度梯度做3个平行样。结果MgCl2添加量为2ul (MgCl2终浓度为4mM)时体系扩增效果最好(图la)。(2)体系退火温度优化体系退火温度从55°C _65°C改变，结果显示59°C左右体系扩增效果最好(图lb)
(3) MpPl实时荧光定量PCR扩增体系及扩增条件的优化
MpPl-FP MpPl-RP
探针
Platium quantitative PCR super
Mix UDG
MgCl2
Platium Taq
PCR nucleotide Mix (Promega C1141)
Nuclease-Free Water
板模
25μΜ0.5μ1 25μΜ0.5μ1 25μΜ 0.2μ1 12.5μ1
50πιΜ2.0μ1
0.25μ1
Ι.ΟμΙ
3.05μ1 5.0μ1
扩增条件
95 °C 95 °C 59 °C
3min IOs 30s
IJ
45个循环
实施例3
体系标准曲线的制作
以标准浓度模板的Ig值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制MpPl体系的
real-time PCR标准曲线。结果显示阳性模板量在8. lfg_8. Ing这个范围内时，其的对数值与Ct值具有非常好的相关性(R2 = 0. 996)。见图2。实施例4MpPl荧光PCR检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价1.灵敏度评价
灵敏度，又称真阳性率，即实际上是肺炎支原体并按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的肺炎支原体MpPl检测体系的real-time PCR检测体系检测8株ATCC标准株和实验室保存的100株肺炎支原体临床分离株DNA。结果，除 NTC对照外，所有108株肺炎支原体MpPl体系检测结果呈阳性。2.特异度评价特异度，又称真阴性率，即实际上不是肺炎支原体而按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的real-time PCR检测呼吸道常见菌株20种及人类染色体(表1)，以肺炎支原体为阳性对照。结果除阳性对照外，其余21种非肺炎支原体模板均为阴性(图3)。表1用于检测MpPl荧光PCR体系特异性模板
权利要求
1.一种用于检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的遗传标记物，其具有SEQ ID NO. 1所示的序列或其特异性片段。
2.用于扩增权利要求1所述遗传标记物的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其核苷酸序列为MpPl-FP :5’ -CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3’，MpPl-RP :5’ -AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3’。
4.与权利要求2或3所述引物配合使用的荧光探针。
5.根据权利要求4所述的荧光探针，其核苷酸序列为(FAM)5， -CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3， (BHQl)。
6.一种肺炎支原体的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，以权利要求1所述的遗传标记物为靶序列，利用权利要求书2或3所述的引物和权利要求4或5所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
7.如权利要求6所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性3min，1个循环；95°C变性10s，59°C退火30s，45个循环。
9.含有权利要求2或3所述引物和/或权利要求4或5所述探针的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其还包括荧光定量反应液、阴性模板和阳性模板， 所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为0. 162fg/ul 1. 62ng/ul的肺炎支原体基因组 DNA。
全文摘要
本发明通过对肺炎支原体基因测序和比对，提供了用于检测肺炎支原体的遗传标记物、实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，本发明还提供了对肺炎支原体进行定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。
文档编号C12N15/11GK102230013SQ20111016759
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者张建中, 赵飞 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所