专利名称：一种基因载体系统及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物载体领域，特别涉及基因载体系统及其制备方法。
背景技术：
基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞以纠正基因的缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的的生物医学新技术。利用载体将外源基因导入靶细胞是一种基因治疗的有效方法，成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。常见的载体包括病毒类载体和非病毒载体。其中，病毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患，在基因治疗历史上首例患者死亡事件以及著名的法国“气泡婴儿”事件，在很大程度上都是由病毒类基因载体的不安全性造成的。非病毒载体多为高分子阳离子聚合物，因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者。阳离子聚合物聚乙烯亚 胺(PEI)是非病毒类载体中受到关注最多的一个，它已经在体外和体内的转染实验中得到应用，但由于其毒性高、转染效率低、在体内运输过程的非特异性吸附以及没有靶向性的缺点，阻碍了它的进一步发展(Boussif O, Zanta M. A, Behr J. P. et al. A VersatileVector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cells in Culture and inVivo-Polyethylenimine. PNASj 1995;92:7297-7301)。肿瘤的理想基因治疗过程为载有基因物质的基因载体在血液中循环，到达肿瘤组织后被肿瘤细胞内吞并完成转染治疗。但是，血液中含有很多带负电的蛋白类物质，带正点的载体容易与其吸附凝聚成大颗粒而发生沉淀(Liu, Y, and Reineke, T.M. Poly(glycoamidoamine)sfor gene delivery. Structural effects on cellularinternalization,buffering capacity,and gene expression.BioconjugateChem. 2007; 18，19-30.);而且，正常体液环境中的细胞表面带负电，带正电的载体也容易接近正常细胞，被正常细胞内吞，因此，载体难于到达肿瘤组织，导致转染效率低。为了提高基因载体体系进入目标组织细胞的效率，常用的方法是(1)引入遮蔽体系。遮蔽体系通常选用带负电的高分子材料，复合在基因载体体系表面，使整个颗粒带负电。避免在血液运输过程中的非特异性吸附。但是，单纯的遮蔽体系会影响基因载体与目标组织的结合效率。(2)引入靶向。在载体上引入对目标细胞具有特异性结合能力的靶向配体，如精-甘-天短肽(RGD短肽)、叶酸等。但是，单纯的靶向配体阻止不了载体体系的非特异性吸附。即使将两者同时引入载体体系，由于遮蔽体系表面所带的负电与细胞表面带负电荷产生斥力，也会影响载体体系与细胞的结合效率，即其转染效率低。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种基因载体系统，转染效率高。本发明提供了一种基因载体系统，包括祀向配体、pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；
所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物；超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物；或者超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ1000，所述聚赖氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000 ；所述基因物质为质粒DNA或SiRNA。优选的，所述靶向配体与pH敏感遮蔽体系的质量比为(O. f 10) :1，ρΗ敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(广80):1，所述阳离子载体与基因物质的质量比为(O. 5 50):1。
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优选的，所述pH敏感遮蔽体系中，所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ800，所述聚赖氨酸的分子量为400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量为300(Tl3000，所述聚谷氨酸的分子量为3000 13000。优选的，在所述靶向配体中，所述聚乙二醇的分子量为100(Γ2000，所述聚赖氨酸的分子量为2000 20000。优选的，所述阳离子载体为聚乙烯亚胺。本发明提供了一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤(A)将基因物质与阳离子载体混合孵育，得到二元复合物；所述基因物质为质粒DNA或SiRNA ；(B)将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合，得到三元复合物；所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物；超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物；或者超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ1000，所述聚赖氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000 ；(C)将所述三元复合物与靶向配体混合，得到基因载体系统；所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的聚合物。优选的，所述超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。优选的，所述超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物；将所述聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物与赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物。优选的，所述靶向配体按照以下方法制备
将聚乙二醇与赖氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物；将所述聚赖氨酸-聚乙二醇聚合物与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽发生反应，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物。优选的，所述步骤(A)中，所述孵育时间为1(Γ30分钟。与现有技术相比，本发明基因载体系统包括靶向配体、pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质。所述pH敏感遮蔽体系含有聚赖氨酸链及聚天冬氨酸或聚谷氨酸链，因此具有PH值敏感性，在中性或偏碱性的环境中，其带有负电荷，可以有效保护阳离子载体和基因物质；在酸性环境下，其电荷翻转，表 现为带正电荷，有利于其接近表面带有负电荷的细胞，从而提高基因载体系统与细胞的结合效率，提高转染效率。同时，靶向配体可以伸展到阳离子载体的外围，提高靶向配体与细胞表面受体的结合率，从而提高基因载体系统与细胞的结合效率。实验结果表明，本发明提供的基因载体系统对Hela细胞转染效率可达4. 4X IO5 8. 8 X 108RLU/mg Protein，对 Huh 7 细胞的抑制效率可达 79% 84%。
具体实施例方式为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明实施例公开了一种基因载体系统，包括祀向配体、pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物；超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物；或者超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ1000，所述聚赖氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000 ；所述基因物质为质粒DNA或SiRNA。按照本发明，所述基因载体系统中，所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的聚合物。所述聚乙二醇的分子量优选为100(Γ2000，更应优选为120(Γ1800，最优选为140(Γ1600 ;本发明对所述聚乙二醇没有特殊限制，可以对聚乙二醇两端的羟基进行改性，优选为一端为氨基，另一端为其他功能化的基团，如乙烯基，本发明对其改性方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。本发明对所述聚乙二醇的来源也没有特殊限制，可以由市场购买。所述聚赖氨酸的分子量优选为2000 20000，更优选为5000 15000，最优选为8000 12000。本发明对所述靶向配体的来源没有特殊限制，优选按照以下方法制备将聚乙二醇与赖氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物；将所述聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽发生反应，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物。在制备靶向配体的过程中，首先以聚乙二醇为引发剂，引发赖氨酸-N-内羧酸酐发生开环聚合，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物。所述聚乙二醇的分子量优选为100(Γ2000，更应优选为120(Tl800，最优选为140(Tl600 ;本发明对所述聚乙二醇没有特殊限制，可以对聚乙二醇两端的羟基进行改性，优选为一端为氨基，另一端为其他功能化的基团，如乙烯基，本发明对其改性方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。本发明对所述聚乙二醇的来源也没有特殊限制，可以由市场购买。本发明对所述赖氨酸-N-内羧酸酐的来源没有特殊限制，可以由市场够买；所述赖氨酸-N-内羧酸酐可以带有保护基，也可以不带有保护基。所述反应的溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果聚聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物，所述透析所用的透析袋的截留量为 300(T4000Da。得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物，将其与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽发生反应，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物。本发明对所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽的来源没有特殊限制，可以由市场购买。所述反应的时间优 选为2(T30h，所述反应的温度优选为6(T80°C。所述反应的催化剂优选为偶氮异丁腈。所述反应的溶剂优选为N，N- 二甲基甲酰胺。按照本发明，所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物、超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物或超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为600 1000，优选为600 800 ;所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，优选为4000 8000 ；所述聚天冬氨酸的分子量为100(Γ25000，优选为300(Γ13000 ;所述聚谷氨酸的分子量为100(Γ25000，优选为300(Γ13000。所述pH敏感遮蔽体系优选为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物。所述超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物中超支化的聚乙烯亚胺分子量优选为60(Γ800，所述聚赖氨酸的分子量优选为400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量优选为300(Γ13000。本发明对所述pH敏感遮蔽体系的来源没有特殊限制，当其为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物时，优选按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物；将所述聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物与赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物。在制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物时，首先以聚酰亚胺为引发剂，与天冬氨酸-N-内羧酸酐反应，所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1:广1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物；得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物后，将其与赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物。所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1:广1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干处理，所述透析所用的透析袋的截留量为 3000 4000Da。当所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物时，优选按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。在制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物时，以聚乙烯亚胺为引发剂，将其与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的体积比为I: f 1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干处理，所述透析所用的透析袋的截留量为300(T4000Da。当所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的无规共聚物时，优选按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。在制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的无规共聚物时，以聚乙烯亚胺为引发剂，将其与谷氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的体积比为I: f 1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的无规共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干处理，所述透析所用的透析袋的截留量为300(T4000Da。按照本发明，所述基因载体系统中的所述阳离子载体的作用为担载基因物质，其优选为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺的分子量优选为200(Γ4000，更优选为2500。本发明对所述阳离子载体的来源没有特殊限制，可以由市场购买。按照本发明，所述基因载体系统中的所述基因物质为质粒DNA或siRNA。所述质 粒DNA优选为荧光素酶质粒DNA ;所述siRNA优选为沉默荧光素酶的Luc siRNA,其序列为5' -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。按在本发明，在所述基因载体系统中，所述靶向配体与pH敏感遮蔽体系的质量比优选为(O. Γ10):1,更优选为(21):1 ;ρΗ敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(Γ80):1,更优选为(1(Γ70) :1 ;所述阳离子载体与基因物质的质量比为(O. 5 50) :1，更优选为(2 40) : I。本发明提供了一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤(A)将基因物质与阳离子载体混合孵育，得到二元复合物；所述基因物质为质粒DNA或siRNA ;(B)将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合，得到三元复合物；所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物；超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物；或者超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ1000，所述聚赖氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000 ；
(C)将所述三元复合物与靶向配体混合，得到基因载体系统；所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的聚合物。按照本发明，首先将基因物质与阳离子载体混合孵育。所述阳离子载体的作用为担载基因物质，其优选为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺的分子量优选为200(Γ4000，更优选为2500。本发明对所述阳离子载体的来源没有特殊限制，可以由市场购买。所述基因物质为质粒DNA或siRNA。所述质粒DNA优选为荧光素酶质粒DNA ;所述siRNA优选为沉默荧光素酶的Luc siRNA，其序列为Y -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。所述阳离子载体与基因物质的质量比为(O. 5 50): 1，更优选为(2 40):1。所述混合孵育的溶剂优选为水，为了混合孵育的效果更好，优选首选将基因物质与阳离子载体分别溶于水，形成水溶液后再将两者的水溶液进行混合孵育，所述基因物质水溶液的浓度优选为O. 02^2mg/mL ;所述阳离子载体水溶液的浓度优选为O. 02 2mg/mL。所述混合孵育的时间优选为1(Γ30分钟。基因物质与阳离子载体混合孵育后，得到二元复合物。然后，将所述二元复合物与PH敏感遮蔽体系混合。所述混合时所用的溶剂优选为水。为了保证混合均匀，优选将pH敏感遮蔽体系溶于水，形成水溶液后再与二元复合物进行混合，所述PH敏感遮蔽体系水溶液的的浓度优选为O. 02 2mg/mL，其pH值优选为7. 4。所述混合的时间优选为1(Γ30分钟。所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物、超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物或超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ1000，优选为600 800 ;所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，优选为4000 8000 ;所述聚天冬氨酸的分子量为1000 25000，优选为3000 13000 ;所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，优选为3000^13000.所述pH敏感遮蔽体系优选为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物。所述超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物中超支化的聚乙烯亚胺分子量优选为60(Γ800，所述聚赖氨酸的分子量优选为400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量优选为300(Γ13000。本发明对所述pH敏感遮蔽体系的来源没有特殊限制，当其为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物时，优选按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物；将所述聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物与赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物。在制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物时，首先以聚酰亚胺为引发剂，与天冬氨酸-N-内羧酸酐反应，所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1:广1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物；得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物后，将其与赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物。所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1:广1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟 知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干处理，所述透析所用的透析袋的截留量为 3000 4000Da。当所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物时，优选按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。在制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物时，以聚乙烯亚胺为引发剂，将其与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的体积比为I: f 1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干处理，所述透析所用的透析袋的截留量为300(T4000Da。当所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的无规共聚物时，优选按照以下方法制备将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。在制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的无规共聚物时，以聚乙烯亚胺为引发剂，将其与谷氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，所述反应的溶剂优选为二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的体积比为I: f 1:10。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果制备超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的无规共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干处理，所述透析所用的透析袋的截留量为300(T4000Da。按照本发明，将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合后，得到三元复合物。最后，将所述三元复合物与靶向配体混合，得到基因载体系统。所述混合时所用的溶剂优选为水。为了保证混合均匀，优选将靶向配体溶于水，形成水溶液后再与三元复合物进行混合，所述靶向配体水溶液的浓度优选为O. 02 2mg/mL。所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的聚合物。所述聚乙二醇的分子量优选为100(Γ2000，更应优选为120(Tl800，最优选为140(Tl600 ;本发明对所述聚乙二醇没有特殊限制，可以对聚乙二醇两端的羟基进行改性，优选为一端为氨基，另一端为其他功能化的基团，如乙烯基，本发明对其改性方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。本发明对所述聚乙二醇的来源也没有特殊限制，可以由市场购买。所述聚赖氨酸的分子量优选为200(Γ20000，更优选为500(Γ15000，最优选为800(Tl2000。本发明对所述靶向配体的来源没有特殊限制，优选按照以下方法制备将聚乙二醇与赖氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物；
将所述聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽发生反应，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物。在制备靶向配体的过程中，首先以聚乙二醇为引发剂，引发赖氨酸-N-内羧酸酐发生开环聚合，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物。所述聚乙二醇的分子量优选为100(Γ2000，更应优选为120(Tl800，最优选为140(Tl600 ;本发明对所述聚乙二醇没有特殊限制，可以对聚乙二醇两端的羟基进行改性，优选为一端为氨基，另一端为其他功能化的基团，如乙烯基，本发明对其改性方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。本发明对所述聚乙二醇的来源也没有特殊限制，可以由市场购买。本发明对所述赖氨酸-N-内羧酸酐的来源没有特殊限制，可以由市场够买；所述赖氨酸-N-内羧酸酐可以带有保护基，也可以不带有保护基。所述反应的溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺。所述反应时间优选为6(T80h，更优选为62 78h。所述反应的温度优选为2(T40°C。所述反应结束后，如果聚聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物带有保护基，可以对所述保护基进行脱除。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，可以按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述反应结束后，优选经过透析并冻干，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物，所述透析所用的透析袋的截留量为 300(T4000Da。得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物，将其与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽发生反应，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物。本发明对所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽的来源没有特殊限制，可以由市场购买。所述反应的时间优选为2(T30h，所述反应的温度优选为6(T80°C。所述反应的催化剂优选为偶氮异丁腈。所述反应的溶剂优选为N，N- 二甲基甲酰胺。将得到的基因载体系统进行细胞转染，结果表明，本发明提供的基因载体系统对Hela细胞转染效率可达4X IO5 8X 108RLU/mgProtein，对Huh 7细胞的转染效率可达79% 84。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的基因载体系统及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。实施例I将3克分子量为3000的聚乙二醇溶于30mLDMF中，得到第一溶液；将ε -苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐溶于30mLDMF中，得到第二溶液。将第二溶液注射到第一溶液中，30°C反应72小时，反应结束后用乙醚沉降，过滤干燥后，溶解在三氟乙酸中，加入溴化氢的乙酸溶液，在室温下脱保护2小时，然后用乙醚沉降，干燥后用水溶解，3500Da的透析袋透析3天，换水6次，产物冷冻干燥后得到聚乙二醇-聚赖氨酸的共聚物。将Imol聚乙二醇-聚赖氨酸的共聚物与Imol带巯基的RGD和Imol偶氮二异丁腈溶解在30mL无水无氧的DMF中，在70°C下反应24小时，得到精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的聚合物，即靶向配体。实施例2-9分别将聚乙烯亚胺(PEI)和天冬氨酸-N-内羧酸酐溶于二氯甲烷和DMF的混合溶剂中，二氯甲烷和DMF的体积比为1:2。将两者混合，在30°C下反应72小时。然后加入ε -苄 氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐的二氯甲烷和DMF的混合溶液，35°C反应72小时，反应结束后用乙醚沉降，过滤干燥后，溶解在三氟乙酸中，加入溴化氢的乙酸溶液，在室温下脱保护2小时，然后用乙醚沉降，干燥后用水溶解，3500Da的透析袋透析3天，换水6次，产物冷冻干燥后得到聚乙二醇-聚天冬氨酸-聚赖氨酸的嵌段共聚物共聚物，记为PEI-b-PLAA-b-PLL。使用不同分子量的引发剂PEI,改变赖氨酸-NCA和天冬氨酸-NCA的摩尔量，可以得到不同分子量和组成的PEI-b-PLAA-b-PLL。其分子组成以及在不同pH值是的粒径和电位数值如表I所示。表I实施例2、的原料、比例及产物的颗粒大小和表面电位
权利要求
1.一种基因载体系统，包括靶向配体、PH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质； 所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物； 所述PH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物；超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物；或者超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ1000，所述聚赖氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000 ； 所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
2.根据权利要求I所述的基因载体系统，其特征在于，所述靶向配体与PH敏感遮蔽体系的质量比为(O. f 10) :1，pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(广80) :1，所述阳离子载体与基因物质的质量比为(O. 5^50) :10
3.根据权利要求I所述的基因载体系统，其特征在于，所述pH敏感遮蔽体系中，所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ800，所述聚赖氨酸的分子量为400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量为3000 13000，所述聚谷氨酸的分子量为3000 13000。
4.根据权利要求I所述的基因载体系统，其特征在于，在所述靶向配体中，所述聚乙二醇的分子量为100(Γ2000，所述聚赖氨酸的分子量为200(Γ20000。
5.根据权利要求I所述的基因载体系统，其特征在于，所述阳离子载体为聚乙烯亚胺。
6.一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤 (A)将基因物质与阳离子载体混合孵育，得到二元复合物； 所述基因物质为质粒DNA或siRNA ; (B)将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合,得到三元复合物； 所述PH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物；超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物；或者超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为60(Γ1000，所述聚赖氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量为100(Γ25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000 ； (C)将所述三元复合物与靶向配体混合，得到基因载体系统； 所述靶向配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的聚合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物按照以下方法制备 将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐和赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物按照以下方法制备 将聚乙烯亚胺与天冬氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物； 将所述聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸共聚物与赖氨酸-N-内羧酸酐发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述靶向配体按照以下方法制备 将聚乙二醇与赖氨酸-N-内羧酸酐反应，得到聚赖氨酸-聚乙二醇的共聚物；将所述聚赖氨酸-聚乙二醇聚合物与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽发生反应，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，所述孵育时间为10 30分钟。
全文摘要
本发明提供一种基因载体系统，包括靶向配体、pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；所述靶向配体为精-甘-天短肽、聚乙二醇和聚赖氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽体系为超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的规则共聚物；超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚天冬氨酸的无规共聚物；或者超支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和的聚谷氨酸的无规共聚物；所述超支化的聚乙烯亚胺分子量为600~1000，所述聚赖氨酸的分子量为1000~25000，所述聚天冬氨酸的分子量为1000~25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000~25000；所述基因物质为质粒DNA或siRNA。所述基因载体系统可与细胞有效结合，转染效率高。
文档编号C12N15/85GK102816795SQ201210310840
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者田华雨, 董璇, 陈学思, 郭兆培 申请人:中国科学院长春应用化学研究所