一种用于检测赤羽病病毒的引物对及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测赤羽病病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2；还公开了一种包含上述引物对的赤羽病病毒的检测试剂盒及其检测方法。本发明一种用于赤羽病病毒的引物对，在特异引物对的基础上，优化了PCR条件，扩增出了赤羽病病毒的核苷酸序列，并优化了检测条件和检测体系制备了检测该病毒的试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达8pg，可以快速准确检测赤羽病病毒。
【专利说明】—种用于检测赤羽病病毒的引物对及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种用于检测赤羽病病毒的引物对及其应用。【背景技术】
[0002]赤羽病是由赤羽病病毒(Akabane virus, AKV)引起的牛、羊等动物流产、死产、死胎、胎儿畸形、以及先天性关节弯曲一积水性无脑综合征的一种动物虫媒传染病。1990年时证实该病在我国存在。赤羽病病毒属于布尼病毒科(Bunyaviridae)布尼病毒属辛布(simbu)病毒血清群的一个亚群，为单股负链RNA病毒。目前，赤羽病的诊断主要通过病毒分离、琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验和ELISA试验等方法。AKA给畜牧业造成了严重的经济损失，是我国动物疾病防制和国际动物贸易中的重点检疫对象。因此有必要加强对该病的研究与检测监控，防止该病在我国的发生、传播和大规模流行。赤羽病在全球范围内大范围流行和传播，严重威胁着动物健康和畜牧业发展，对人类健康、社会稳定和农业经济发展也带来不良影响。常规诊断方法是病原分离鉴定和血清学方法，但这些方法存在敏感性低、特异性差，操作费时费力等局限性。
【发明内容】
[0003]发明目的:本发明所要解决的技术问题是一种用于赤羽病病毒的引物对。本发明还要解决的技术问题是提供一种赤羽病病毒的检测试剂盒。
[0004]技术方案:为实现上述目的，本发明的一种用于检测赤羽病病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0005]一种赤羽病病毒的检测试剂盒，它包含所述的引物对。
[0006]上述的赤羽病病毒的检测试剂盒，包括:
[0007]1)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P125 μ L，核苷酸序列如SEQ ID NO:2 的下游引物 Ρ225μ L，2XPCR pre_mix250 μ L，ddH20150 μ L 组成；
[0008]2)阴性对照:非赤羽病病毒的DNA片段500 μ L ;
[0009]3)阳性对照:赤羽病病毒的DNA片段500 μ L。
[0010]上述的赤羽病病毒的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
[0011]1)抽提赤羽病病毒的质粒；
[0012]2) PCR扩增:PCR反应体系为50 μ L体系，反应体系中含PCR pre-mixlO μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，H2036 μ L，瞬时离心混匀；PCR工作程序为:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s, 58°C退火 lmin30s, 72°C延伸 lmin, 15 个循环；72°C再延伸 IOmin0
[0013]3) PCR扩增产物分析。
[0014]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明一种用于赤羽病病毒的引物对，在特异引物对的基础上，优化了 PCR条件，扩增出了赤羽病病毒的核苷酸序列，并优化了检测条件和检测体系制备了检测该病毒的试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达6pg,可以快速准确检测赤羽病病毒。【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:PCR方法特异性实验的电泳图；其中，泳道I为DNAmaker，泳道2、3、4为本发明的赤羽病病毒的DNA扩增产物。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:试剂盒的制备。
[0017]1、病毒及病料的来源和处理
[0018]赤羽病临床病料于2012年10月采自河南牛的内脏器官。取0.5g内脏组织于无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻溶3次后5500rmp离心3min，取上清于_20°C保存。
[0019]2、试剂
[0020]PCR pre-mix、蛋白酶 K 购自大连 Takara 公司；DNA Marker、GoldView 购自南京上高生物公司；引物由Sigma公司合成。其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。
[0021]1、引物的设计与合成
[0022]根据GenBank中EHD的全基因序列，使用引物设计软件Primer5.0设计一对检测引物。AKV 上游引物 Pl 为:5’-TAAGTATGGGCAGCAGCTCAAC-3’ ；
[0023]下游引物P2 (5，-TCAGCAATCCAGCGAGCTAA-3’)，预期扩增片段大小约为 250bp。
[0024]2、阳性对照:即含有赤羽病病毒的DNA片段
[0025]3、阴性对照:非赤羽病病毒的DNA片段
[0026]实施例2:检测方法
[0027]按照以下步骤进行检测:
[0028](I)样品处理:取赤羽病临床病料于2012年10月采自河南牛内脏器官。取0.6g内脏组织于无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻溶3次后6000rmp离心4min，取上清于_20°C保存。
[0029](2)病毒DNA的提取:将可疑病料组织悬浮液冻融3次，离心取上清450 μ L，加入蛋白酶K至终浓度500μ g/mL，加入SDS至终浓度10g/L，55°C水浴30min，用苯酚、苯酚-氯仿(体积比1:1)混合液及氯仿各抽提I次，吸取水相，加入1/10体积的3mol/LNaAc (pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇沉淀，12000r/min4°C离心15min,沉淀悬浮于超纯水中，-20°C保存备用。
[0030](3)PCR扩增:PCR反应体系为50 μ L体系，反应体系中含PCR pre-mixlO μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，H2036 μ L，瞬时离心混匀；PCR工作程序为:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，58。。退火 lmin30s，72°C延伸 lmin, 15 个循环；72°C再延伸 IOmin,
4°C保存。
[0031](4)PCR扩增产物分析:结束后取8 μ L PCR扩增产物加于1%琼脂糖凝胶孔中放于电压为180V的电泳槽里电泳lOmin，于紫外投射仪中观察结果。
[0032]从图1可以看出:赤羽病病毒扩增出了一条约250bp的片段。
[0033]以上所述仅是本发明 的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种用于检测赤羽病病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQID NO:1 和 SEQ ID NO:2。
2.—种赤羽病病毒的检测试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的赤羽病病毒的检测试剂盒，其特征在于包括: 1)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P125 μ L，核苷酸序列如SEQ IDNO:2 的下游引物 Ρ225μ L，2XPCR pre-mix250 μ L, ddH20150 y L 组成； 2)阴性对照:非赤羽病病毒的DNA片段500μ L ; 3)阳性对照:赤羽病病毒的DNA片段500μ L0
4.权利要求3所述的赤羽病病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)抽提赤羽病病毒的DNA； 2)PCR扩增:PCR反应体系为50 μ L体系，反应体系中含PCR pre-mixlO μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，Η2036 μ L，瞬时离心混匀；PCR工作程序为:94°C预变性3min ;94°C变性 30s，58。。退火 lmin30s，72°C延伸 lmin，15 个循环；72°C再延伸 IOmin0 3)PCR扩增产物分析 。
【文档编号】C12N15/11GK103820579SQ201410075749
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】詹爱军 申请人:江苏博爱生物科技有限公司