一种筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法
【专利摘要】本发明建立了一种直接筛选和鉴定出miRNAs调控的基因组DNA的方法。该方法是将生物素标记到研究的目的miRNAs上，利用生物素和链霉亲和素之间的亲和力将生理状况下与生物素标记的miRNAs靶向结合在一起的基因组DNA分离和纯化出来，然后将分离纯化的DNA进行克隆和测序获得DNA序列信息，通过生物信息学分析DNA序列所在的基因位置和基因名称，获得调控基因组DNA的miRNAs的所有靶标基因。通过本发明建立的方法可以应用到所有靶向基因组DNA的miRNAs的功能研究。
【专利说明】[0001] 一种筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法 【技术领域】
[0002] 本发明涉及一种筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法，为miRNAs的功能研究 中寻找其调控的可能靶基因提供了一种简单、实用的方法。 【背景技术】
[0003] miRNAs是一类由大约19-23个碱基组成的单链RNA分子，是一种不能编码蛋白质 但是具有重要调控作用的小RNA。成熟的miRNA通过碱基互补配对可以结合到靶基因的相 关序列上面，现在已知报道的结合位点可以位于基因 mRNA的3'和5'非翻译区，也可能位于 基因的启动子区域。现在已知miRNAs在包括细胞分化、凋亡、增殖、发育、造血和肿瘤等多 种生命活动中具有重要的调控功能。由于miRNA发挥调控生命活动的作用是通过与调控靶 基因的表达实现的，所以对于miRNAs革E基因的寻找和确定对于miRNAs的功能研究具有重 要的意义。但是由于miRNAs和靶基因之间的互补结合可以通过碱基的不完全匹配，因此一 个miRNA可能会调控很多种的祀基因，所以导致miRNAs的寻找十分困难。现在对于miRNAs 靶基因的寻找主要是通过生物软件的预测，但是生物软件预测具有不真实性、假阳性率较 高、工作量太大等缺陷，所以使用实验方法直接分离和筛选出miRNAs调控的靶基因具有了 十分重要的价值。基因的启动子等基因组区域由于存在很多的甲基化等修饰，使得基因组 区域DNA的折叠和裸露程度都很复杂，对于miRNAs与这些区域的结合更加难以预测，因此 建立一种在正常生理状态下直接筛选和鉴定出miRNAs调控的基因组DNA对于miRNAs的功 能研究具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可以直接且准确筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方 法。
[0005] 本发明的技术方案如下： (1) 将miRNAs与靶基因组DNA互补结合的RNA链进行生物素标记，转染细胞后，利用甲 醛将miRNAs和与之结合的DNA、蛋白交联在一起； (2) 通过生物素（biotin)和链霉亲和素（streptavidin)之间的强亲和力作用，将生物 素标记的miRNAs以及结合在一起的DNA进行亲和沉淀分离和纯化； (3) 通过克隆和测序鉴定分离纯化出来的DNA序列，利用生物信息学分析DNA序列所在 基因的名称，鉴定出miRNAs调控的靶基因。
[0006] 本发明可以筛选和鉴定出miRNAs调控的任意一个基因组DNA序列和相应的基因 名。同时，通过本发明建立的方法可以应用到所有靶向基因组DNA的miRNAs的功能研究。
[0007] 已经通过实验证明该方法能够有效的将miRNA-373调控的上皮钙粘蛋 白（epithelia cadherin， E-cadherin)和冷休克结构域蛋白 C2 (Cold shock domain-containing protein C2，CSDC2)的启动子区域DNA进行了分离和纯化，同时将分离 纯化到的DNA通过克隆和测序获得DNA序列，利用生物信息学分析获得了 DNA序列所在的 基因名称，并通过分子生物学实验证实了 miRNA-373能够促进这些基因的转录水平升高， 证实了 miRNA-373能够调控这些基因的表达。因此本发明成功构建了一种筛选和鉴定出 miRNA调控的基因组DNA的实验方法。该方法的建立将对miRNA的功能研究具有重要的意 义，同时因为已经证实miRNAs在癌症和肿瘤等疾病的发生中具有重要的调控作用，所以该 方法的建立也有助于寻找与肿瘤等疾病发生、发展相关的肿瘤基因，为肿瘤等疾病的治疗 和药物开发提供靶位点，对于肿瘤等疾病的治疗相关药物的研发具有重要的应用价值和前 旦 -5^ 〇 【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1 :生物素标记的miRNA-373通过启动子调控E-cadherin的表达。
[0009] 图 2 :Streptavidin_Biotin 亲和沉淀流程图。
[0010] 图3 :miR-373靶基因 E-cadherin和CSDC2的启动子能够被沉淀。
[0011] 图4 :DNA克隆测序流程图。
[0012] 图5 :miR-373调控未知靶基因的表达。 【具体实施方式】
[0013] 实施例1 miRNA进行生物标记和转染 将miRNA-373的反义链3'末端进行生物素标记，使用转染试剂Lipofectamine 2000 转染进细胞中，24小时后使用Trizol对细胞总RNA进行提取。反转录成cDNA后利用实时 定量PCR方法检测miRNA-373对靶基因 E-cadherin的表达调控作用，使用扩增引物为： E-cadherinRTF :5' -CCTGGGACTCCACCTACAGA-3'， E-cadherinRTR:5' - GGATGACACAGCGTGAGAGA-3'。
[0014] actinRTF: 5, - CGTGGACATCCGCAAAGAC-3,， actinRTR:5' - TCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'。
[0015] 生物素标记的miRNA-373序列： miRNA-373anti-3biotin :5' -GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU-3' -biotin。
[0016] 实施例2细胞培养及细胞转染 正常乳腺癌细胞MCF-7来自美国ATCC公司。在37°C、5% C02、90%相对湿度培养箱中 用DMEM完全培养液(加10%新生牛血清、2 mM L-谷氨酸、青霉素和链霉素)进行培养，待细 胞密度至50%-60%。用脂质体Lipofectamine 2000转染试剂将生物素标记的miRNA-373 转染转入MCF-7细胞中。转染之前换成无血清无抗生素的培养液，转染6小时后，换成有血 清和抗生素的培养液继续培养。
[0017] 实施例 3 Streptavidin-Biotin pull-down 实验 如上述用脂质体Lipofectamine2000将生物素标记的miRNA-373转染到MCF-7细胞 中，转染24小时后每皿细胞10mL培养液中加入270 μ L 37%福尔马林溶液(终浓度为1%)室 温处理l〇min，使蛋白质和RNA充分交联。然后加入lmL 10x Glycine (甘氨酸）室温5min 终止反应。吸掉培养皿中的液体，用10mL预冷的lxPBS洗涤细胞两次，用lmL lxPBS (2% Cocktail，RNase Inhibitor 100U/mL)刮下细胞，800g，3min收获细胞于 1.5mL RNase-Free 离心管中。每管细胞加入500 μ L lysis buffer打匀，冰上静置30min。进行超声处理打断 基因组DNA，超声工作条件：200W，超声5秒，间隙5秒，超声15次。静置于冰上5分钟后， 于4°C离心机14000g离心30s。将上清转移至一新的1. 5 mL RNase-Free离心管中，加入 30yL平衡好的streptavidin珠子，室温孵育lh。室温孵育lh后，4°C离心机500g 5min 离心获得珠子，用wash buffer洗漆珠子3次，最后4°C离心机500g 5min离心获得珠子。 用加入蛋白酶K (Proteinase K)和RNAase的悬液重悬珠子，42°C水浴锅处理1小时，然后 在65 °C下处理20分钟完全逆转交联作用。完全逆转交联作用的产物利用染色体免疫共沉 淀相关试剂盒回收DNA，具体操作：向每管样品中各加入lml的Bind reagent A，混勻，每次 转移600 μ L的上述溶液至离心柱内，12000g，离心30秒，重复上一步将所有的溶液都转移 到离心柱内离心，然后加入500 μ L的wash reagent B至柱中，12000g离心30秒，去收集管 内液体，最后加入Elution buffer至滤膜中央，室温静置3分钟，13000g离心1分钟，收集 管内即沉淀下来的DNA，-20°C冰箱保存。
[0018] 实施例4 DNA克隆及鉴定 Streptavidin-Biotin亲和沉淀实验中洗脱沉淀的DNA经快速末端平滑化试剂盒 (New England BioLabs)进行平末端化处理，样品于室温放置30°C分钟后再70°C 10分钟 处理是平末端化酶失活。然后用DNA末端加 A试剂盒(上海生工)是DNA末端加上一个碱基 A，样品于72°C反应10分钟后，等体积加入溶于2. 5M NaCl的20% PEG-8000,于冰上放置1 小时以沉淀DNA，4°C，12000g离心10分钟后用75%乙醇清洗沉淀DNA，于室温干燥DNA后加 水溶解。溶解的DNA链连接到大连宝生物T-easy载体中，转化到DH5 α感受态细胞中，挑 取单克隆扩增培养并测序。测序结果经VectorNTI分析获取目的DNA序列后，使用UCSC和 NCBI进行序列分析，获得DNA序列所在基因的位置和基因名称。
[0019] 表1测序分析获得的miR-373调控的靶基因
【权利要求】
1. 一种筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法，其特征在于包括： (1) 将miRNAs与靶基因组DNA互补结合的RNA链进行生物素标记，转染细胞后，利用甲 醛将miRNAs和与之结合的DNA、蛋白交联在一起； (2) 将生物素标记的miRNAs以及结合在一起的DNA进行Streptavidin-Biotin亲和沉 淀分离和纯化； (3) 通过克隆和测序鉴定分离纯化出来的DNA序列，鉴定出miRNAs调控的靶基因。
2. 根据权利要求1所述的筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法，其特征在于所述 miRNAs 为 miRNA-373。
3. 根据权利要求2所述的筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法，其特征在于将 miRNA-373的反义链3'末端进行生物素标记。
4. 根据权利要求1或2所述的筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法，其特征在于转 染MCF-7细胞。
【文档编号】C12Q1/68GK104087669SQ201410326335
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】向双林, 魏科, 颜峰, 胡翔, 张健 申请人:湖南师范大学