一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用的制作方法

一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用。本发明公开的一组引物组合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物对组成：(1)SEQ?ID?No.1所示的DNA分子和SEQ?ID?No.2所示的DNA分子；(2)SEQ?ID?No.3所示的DNA分子和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子；(3)SEQ?ID?No.5所示的DNA分子和SEQ?ID?No.6所示的DNA分子；(4)SEQ?ID?No.7所示的DNA分子和SEQ?ID?No.8所示的DNA分子。本发明对及时诊断、及时治疗发病犬，及时预测流行趋势，预防流感大流行，以及开展大规模犬流感病毒的流行病学监测有着积极的意义。
【专利说明】—种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种引物组合物及其应用，特别涉及一种能同时检测H3N2亚型犬流感病毒，H3N8亚型犬流感病毒，H1N1/2009亚型流感病毒和季节性H3N2亚型人流感病毒的引物组合物及其应用，属于病毒检测领域。

【背景技术】
[0002]犬对多种流感病毒均易感，由于犬和人的高度接触性，流感病毒可能通过患犬而感染人类，威胁公共卫生健康。病毒学和血清学调查表明我国犬群中主要流行的是犬H3N2、H1N1/2009和人季节性H3N2流感病毒。而欧美犬群中主要流行的是H3N8亚型犬流感病毒，也不排除其传播到中国犬群的可能性。一旦引起犬流感病毒在犬中的大流行，将会对犬和人类造成不可估量的损失和伤害。因此，对这些病毒做好及时的监测是非常有必要的。这就迫切需要建立一种能够同时检出这四种病毒的通用性良好的检测方法。
[0003]传统的流感病毒检测方法为:采用鸡胚进行病毒分离培养(需时2-3天)，然后采用血凝抑制试验进行流感病毒亚型的鉴定(需时I天)。传统的检测方法费时、费力，不能做出快速而及时的诊断，而且由于病毒的变异频率非常高，常常导致这些方法无法检出病毒，出现漏检的情况。因此，临床上，迫切需要一种能快速鉴别诊断犬流感病毒的检测方法，以确保可以及时发现及时治疗，对预防犬流感的大流行以及人类感染具有重要的意义。


【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用。
[0005]本发明提供一组引物组合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物对组成:
[0006](I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0007](2) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子；
[0008](3) SEQ ID N0.5 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.6 所示的 DNA 分子；
[0009](4) SEQ ID N0.7 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.8 所示的 DNA 分子；
[0010]所述SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.5所示的DNA分子、SEQ ID N0.7所示的DNA分子为上游引物；
[0011]所述SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.6所示的DNA分子、SEQ ID N0.8所示的DNA分子为下游引物；
[0012]所述SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子分别为扩增H3N8亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ IDN0.4所示的DNA分子分别为扩增季节性H3N2亚型人流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子分别为扩增H1N1/2009亚型流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子分别为扩增H3N2亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物；
[0013]所述H3N8 亚型犬流感病毒具体为 A/canine/California/70645-4/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0014]所述季节性H3N2亚型人流感病毒具体为A/Jiangxi/262/05 (H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0015]所述H1N1/2009 亚型流感病毒具体为 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或A/Beijing/132/2010(HlNl)；
[0016]所述H3N2 亚型犬流感病毒具体为 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)。
[0017]上述引物组合物中，所述引物由如下(I)-⑷所示的引物对组成:
[0018](I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0019](2) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子；
[0020](3) SEQ ID N0.5 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.6 所示的 DNA 分子；
[0021](4) SEQ ID N0.7 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.8 所示的 DNA 分子。
[0022]一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的引物组合物；
[0023]所述H3N2 亚型犬流感病毒具体为 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
[0024]所述H3N8 亚型犬流感病毒具体为 A/canine/California/70645-4/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0025]所述季节性H3N2亚型人流感病毒具体为A/Jiangxi/262/05 (H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0026]所述H1N1/2009 亚型流感病毒具体为 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或 A/Beijing/132/2010 (HlNl)。
[0027]一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:以样品的cDNA为模板，以上述任一所述的引物组合物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有148bp的片段，则样品候选为含有H3N8亚型犬流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有303bp的片段，则样品候选为含有季节性H3N2亚型人流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有407bp的片段，则样品候选为含有H1N1/2009亚型流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有544bp的片段，则样品候选为含有H3N2亚型犬流感病毒的样品；
[0028]所述148bp的片段为SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子为引物扩增得到的；
[0029]所述303bp的片段为SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子为引物扩增得到的；
[0030]所述407bp的片段为为SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子为引物扩增得到的；
[0031]所述544bp的片段为为SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子为引物扩增得到的。
[0032]上述方法中，所述PCR的体系为:ddH206.5 μ 1，2XPCR扩增缓冲液12.5 μ 1，上述任一所述的引物组合物中浓度为20μπ?Ο1/μ I的各上游引物各0.5 μ 1，上述任一所述的引物组合物中浓度为20 μ mol/μ I的各下游引物各0.5 μ 1，CDNA2 μ I ；
[0033]所述2 XPCR扩增缓冲液的商品名称具体为2 XEasyTaq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2 X ；
[0034]所述PCR 的反应程序为 94 °C 5min ；94°C 30s，57°C 30s, 72 °C 35s, 30 个循环；72°C 1min ；4°C 24h ；
[0035]所述H3N2 亚型犬流感病毒具体为 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
[0036]所述H3N8 亚型犬流感病毒具体为 A/canine/California/70645-4/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0037]所述季节性H3N2亚型人流感病毒具体为A/Jiangxi/262/2005A/Jiangxi/262/05(H3N2)、 A/Beijing_Xicheng/11542/2011(H3N2)、 A/Bei jing-Huairou/1458/2012 (H3N2) , A/Anhu1-Baohe/1127/2012 (H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0038]所述H1N1/2009 亚型流感病毒具体为 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或 A/Beijing/132/2010 (HlNl)。
[0039]上述任一所述的引物组合物在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0040]上述试剂盒在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0041]上述任一所述的应用中，所述H3N2亚型犬流感病毒为A/canine/Beijing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
[0042]所述H3N8 亚型犬流感病毒为 A/canine/California/70645_4/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0043]所述季节性H3N2亚型人流感病毒为A/Jiangxi/262/05 (H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012 (H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0044]所述H1N1/2009 亚型流感病毒为 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或 A/Beijing/132/2010 (HlNl)。
[0045]本发明提供了一组能同时检测H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和H1N1/2009亚型流感病毒的引物组合物，并在此基础上建立了一种能同时检测这四种病毒的多重RT-PCR方法。本发明提供的方法较血凝抑制传统方法更快捷，且覆盖范围广，不仅能够检出经典类型毒株，还能检出近年来最新的流行变异株，具有很好的覆盖性和通用性。本发明的方法不仅可以检测临床采集的样品如鼻咽拭子，而且也可对病毒尿囊液进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，成为犬流感病毒诊断和流行病学调查的有用检测工具。本发明对及时诊断、及时治疗发病犬，及时预测流行趋势，预防流感大流行，以及开展大规模犬流感病毒的流行病学监测有着积极的意义。

【专利附图】

【附图说明】
[0046]图1为特异性检测。
[0047]图2为灵敏度检测。
[0048]图3为敏感性检测。

【具体实施方式】
[0049]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0050]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0051]Trizol 购自 invitrogen 公司，产品目录号为 15596-026。
[0052]Ribolock Rnase Inhibitor 购自 fermentas 公司，产品目录号为 E00381。
[0053]dNTP Mix购自fermentas公司，产品目录号为ROl9I。
[0054]RevertAid Reverse Transcriptase 购自 fermentas 公司，产品目录号为 EP0441,内含 5 X React1n Buffer (pH 8.3 的 250 mM Tris-HCl, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50mMDTT)。
[0055]2XEasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2X。
[0056]H3N2 亚型犬流感病毒 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/418/2010 (H3N2)在文献“Sun Y., SunS., Ma J., Tan Y., Du L., Shen Y., Mu Q., Pu J., Lin D., and Liu J..1dentificat1n andcharacterizat1n of avian—origin H3N2 canine influenza viruses in northernChina during 2009-2010.Virology 435 (2)，301-307 (2013) ” 中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0057]季节性H3N2 亚型人流感病毒 A/Jiangxi/262/05(H3N2)在文献“Sun Y.，BiY.，Pu J., Hu Y.，Wang J.，Gao H.，Liu L，Xu Q., Tan Y.，Liu Μ.，Guo X.，Yang H.，andLiu J.Guinea pig model for evaluating the potential public health risk ofswine and avian influenza viruses.Plos One 5 (11)，el5537 (2010)，，中公开过，A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Bei jing-Huairou/1458/2012 (H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2) ^A/Henan-Muye/35/2012 (H3N2)在文献“黄维娟，成艳辉，李希妍，赵翔，郭俊峰，王钊，谭敏菊，李明，隋竑豉，隗合江，陈瑶瑶，肖宁，蓝雨，王大燕，舒跃龙.2011-2012年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析[J].病毒学报，2013，29 (3): 258-264”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0058]H3N8 亚型犬流感病毒 A/canine/California/70645-4/2006 (H3N8)，A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)，A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)，A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)在文献 “Rivailler，P.，Perry, 1.A.，Jang, Y.，Davis, C.T.，Chen L.M.，Dubovij E.J.，andDonisj R.0.Evolut1n of canine and equine influenza(H3N8)viruses co-circulatingbetween 2005 and 2008.Virology 408 (I)，71-79 (2010) ” 中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0059]H1N1/2009 亚型流感病毒 A/California/04/2009 (HlNl)在文献 “Garten，R.J.，Davis, C.T.，Russell, C.A.，Shuj B.，Lindstromj S.，Balishj A.，Sess1ns, W.M.，Xu，X.，Skepnerj E.，Deydej V.，Okomo-Adhiamboj M.，Gubareva, L.，Barnes, J.，Smith, C.B.，Emery, S.L.，Hillman, M.J.，Rivaillerj P.，Smagalaj J.，de Graafj M.，Burke, D.F.，Fouchierj R.A.，Pappas, C.，Alpuche-Arandaj C.M.，Lopez-GatelI, H.，Olivera，H.，Lopez, 1.，Myers, C.A.，Faixj D.，Blair, P.J.，Yuj C.，Keene, K.M.，Dotson, P.D.Jr.，Boxrudj D.，Sambolj A.R.，Abidj S.H.，St George, K.，Bannermanj T.，Moore, A.L.，Stringer, D.J.，Blevins, P.，Demmler-Harrisonj G.J.，Ginsberg, M.，Krinerj P.，Waterman, S.，Smolej S.，Guevara, H.F.，Belongiaj E.A.，Clark, P.A.，Beatrice, S.T.，Donisj R.，Katz, J.，Finellij L.，Bridges, C.B.，Shaw, M.，Jerniganj D.B.，Uyekij T.M.，Smith, D.J.，Klimov, A.1.and Coxj N.J.Antigenic and genetic characteristicsof swine-origin 2009 A(HlNl) influenza viruses circulating in humans.Science 325 (5937)，197-201 (2009)” 中公开过，A/canine/Beijing/cau2/2009(HlNl)和 A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)在文献“Degui Lin，Shasha Sun,LijieDuj Jingjiao Ma，Linghong Fan, Juan Pu，Yipeng Sun, Jingyi Zhao, Honglei Sunand Jinhua Liu.Natural and experimental infect1n of dogs with pandemicH1N1/2009 influenza virus.Journal of General Virology93，119-123(2012)” 中公开过，A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 A/Bei jing/132/2010 (HlNl)在文献“Yipeng Sun, QiXuj Ye Shen，Linqing Liuj Kai Wei，Honglei Sun,Juan Pu,Kin-Chow Chang，JinhuaLiua.Naturally Occurring Mutat1ns in the PA Gene Are Key Contributorsto Increased Virulence of Pandemic H1N1/09 Influenza Virus in Mice.J.Virol.2014, 88(8):4600.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0060]犬瘟病毒(OTV-WZ)在文献“刘巧荣，包新奇，孙明，王芳，乔明明，李佳，陈曦，秦亚嫂，陈西钊.感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析[J].中国比较医学杂志，2011,21(4):37-41”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0061]犬细小病毒(CPV/BJ005/07)在文献“宋永奇，李玉燕，吕艳丽，韩博.犬细小病毒VP2基因序列分析[J].中国农学通报，2008，24(7):26-31”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0062]实施例1、临床样品检测
[0063]一、临床样品的采集
[0064]临床棉拭子:鼻拭子或咽拭子。4°C保存，24小时内送实验室检测。
[0065]二、样品处理
[0066]将棉拭子分别浸入ImlPBS溶液(含I万单位青霉素、链霉素)中，充分抢动，抒干后弃去拭子，将溶液4°C 8000rpm离心5min，取上清液为样本液，4°C保存备用。
[0067]三、阳性对照为临床感染H3N2亚型犬流感病毒和实验分别感染H3N8亚型犬流感病毒、H1N1/2009亚型流感病毒或季节性H3N2亚型人流感病毒的犬的鼻拭子或咽拭子。4°C保存，24小时内送实验室检测，按照步骤二的方法进行处理。阴性对照为灭菌双蒸水，4°C保存备用。
[0068]四、设计并合成针对H3N2亚型犬流感病毒，H3N8亚型犬流感病毒，H1N1/2009亚型流感病毒和季节性H3N2亚型人流感病毒HA基因高度保守区域的引物，如表1所示。
[0069]表1引物组合物
[0070]

【权利要求】
1.一组引物组合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物对组成: (1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子； (2)SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子； (3)SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子； (4)SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子； 所述SEQ ID N0.1所示的DNA分子、SEQ ID N0.3所示的DNA分子、SEQ ID N0.5所示的DNA分子、SEQ ID N0.7所示的DNA分子为上游引物； 所述SEQ ID N0.2所示的DNA分子、SEQ ID N0.4所示的DNA分子、SEQ ID N0.6所示的DNA分子、SEQ ID N0.8所示的DNA分子为下游引物； 所述SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子分别为扩增H3N8亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子分别为扩增季节性H3N2亚型人流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子分别为扩增H1N1/2009亚型流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子分别为扩增H3N2亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于:所述引物组合物由如下(1)-(4)所示的引物对组成: (1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子； (2)SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子； (3)SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子； (4)SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子。
3.一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求I或2所述的引物组合物。
4.一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的方法，包括如下步骤:以样品的cDNA为模板，以权利要求1或2所述的引物组合物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有148bp的片段，则样品候选为含有H3N8亚型犬流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有303bp的片段，则样品候选为含有季节性H3N2亚型人流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有407bp的片段，则样品候选为含有H1N1/2009亚型流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有544bp的片段，则样品候选为含有H3N2亚型犬流感病毒的样品； 所述148bp的片段为以SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子为引物扩增得到的； 所述303bp的片段为以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子为引物扩增得到的； 所 述407bp的片段为以SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子为引物扩增得到的； 所述544bp的片段为以SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子为引物扩增得到的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述PCR的体系为:ddH206.5 μ 1，2XPCR扩增缓冲液12.5 μ 1，权利要求1或2所述的引物组合物中浓度为20μπιο1/μ I的各上游弓丨物各0.5 μ 1，权利要求1或2所述的引物组合物中浓度为20μπ?Ο1/μ I的各下游引物各0.5 μ 1，CDNA2 μ I ； 所述2XPCR扩增缓冲液的商品名称具体为2XEasyTaq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2 X ； 所述 PCR 的反应程序为 94 V 5min ；94 V 30s, 57 V 30s, 72 V 35s, 30 个循环；72°C 1min ；4°C 24h。
6.权利要求1或2所述的引物组合物在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用。
7.权利要求3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104131009SQ201410363681
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】孙怡朋, 刘金华, 王倩 申请人:中国农业大学