F85-20蛋白及其编码基因及其作为β-葡萄糖苷酶的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种F85-20蛋白及其编码基因及其作为Β-葡萄糖苷酶的应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现新的β-葡萄糖苷酶F85-20，在以对硝基苯酚葡萄糖苷(pNPG)为底物，pH 6.0条件下，最适温度为65℃，在50℃温育2小时后，仍能保留80％的活力；在4℃下，不同pH缓冲液中孵育24小时后，在pH 4.0-7.5范围内均能保留超过70％的剩余活力。
【专利说明】F85-20蛋白及其编码基因及其作为β -葡萄糖苷酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种F85-20蛋白及其编码基因及其作为 β-葡萄糖苷酶的应用。
【背景技术】
[0002] 据统计，每年全球植物通过光合作用合成纤维类物质达到50亿吨。纤维素 (Cellulose)是植物细胞壁的重要组分，是自然界中最丰富的可再生资源。纤维素酶 (Cellulase)是一类能将纤维素水解为低聚葡萄糖及葡萄糖的酶，很多自然界微生物均含 有纤维素酶。由于纤维素酶可以广泛应用于纺织、造纸、食品及生物燃料等工业，近年来吸 引了越来越多学者的研究兴趣。然而，在纤维素酶水解的过程中，产生的大量纤维二糖及 寡糖会强烈抑制纤维素酶的活性，导致纤维素水解效率的急剧下降，整个生产效率的降低。 β -葡萄糖苷酶可以高效催化纤维二糖及寡糖转化为葡萄糖，因此将该酶加至纤维素酶中， 会解除产物抑制，使纤维素酶恢复高效力，从而保证整个水解过程连续而稳定。
[0003] 工业中，纤维素的水解温度一般为50°C，很少有酶在该温度下保持比较长时间的 催化效力及稳定性。这就限制了生物燃料工业的高效发展，也是制约生物燃料降低生产成 本的重要因素。为了使酶达到较高的耐热性及热稳定性，很多学者从嗜热微生物中筛选新 酶，但是它们很少可以适用在工业条件中。自然界中，不可培养微生物约占所有微生物的 99%。大部分筛选β-葡萄糖苷酶的研究仍然禁锢在可培养的1%的微生物中。近10年 来，随着测序技术与高通量筛选技术的发展，人们逐渐开始研究不可培养微生物中蕴含的 资源，采用的是日臻成熟的宏基因组技术，并发现了大量具有优秀性质的酶，说明了宏基因 组技术发掘新酶的广阔前景。
[0004] 在宏基因组技术筛选新酶的研究中，筛选效率从土壤等自然环境到动物消化道， 再到人工驯化的反应器依次递增。这与驯化的强度及选择压力是相关的。在自然环境中， 比如森林土壤，需要若干年，微生物才能将生物质降解，在动物消化道中，这种反应需要若 干天，但是水解效率依旧不高，这就是食草动物食量大的原因；而对于人工驯化的反应器， 三天即可达到90%的转化率。本研究从人工驯化反应器中筛选β-葡萄糖苷酶，保证了其 高效性。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种蛋白。
[0006] 本发明提供的蛋白，F85-20,是如下1)或2)的蛋白质：
[0007] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
[0008] 2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
[0009] 上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨 基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0011] 上述DNA分子为如下1) -5)中任一所述的DNA分子：
[0012] 1)编码区为序列表中序列1 ;
[0013] 2)编码区为序列表中序列1自5'末端第19-1404位核苷酸；
[0014] 3)编码区为序列表中序列1自5'末端第11-1404位核苷酸；
[0015] 4)在严格条件下与1)或2)或3)杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；
[0016] 5)与1)或2)或3)具有90%以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0017] 上述严格条件可为用0. IX SSPE (或0. I XSSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0018] 含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发 明保护的范围。
[0019] 上述方法中，所述表达载体为pET_28a载体，所述重组载体在本发明的实施例为 将序列表中序列1自5'末端第11-1404位核苷酸插入pET-28a载体的Nco I与Hind III 酶切位点间得到的载体；
[0020] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。
[0021] 上述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
[0022] 所述目的菌为大肠杆菌，具体为BL21DE3。
[0023] 上述蛋白在作为β_葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖苷酶中的应用也是本发明保 护的范围。
[0024] 上述的蛋白或上述DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或 重组菌在制备β-葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖苷酶中的应用也是本发明保护的范围。
[0025] 所述β -葡萄糖苷酶的酶学特征具体为：最适pH值为6. 0,最适温度为65°C。
[0026] 本发明的另一个目的是提供一种制备β_葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖苷酶的 方法。
[0027] 本发明的方法，为发酵上述的重组菌，即得到β -葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖 苷酶。
[0028] 上述方法中，所述发酵为在IPTG诱导下发酵培养。
[0029] 上述的蛋白在降解生物质中的应用也是本发明保护的范围，所述生物质为玉米 -H- 〇
[0030] 本发明的实验证明，本发明发现新的β-葡萄糖苷酶F85-20,在以对硝基苯酚葡 萄糖苷（PNPG)为底物，pH 6. 0条件下，最适温度为65°C，在50°C温育2小时后，仍能保留 80%的活力；在4°C下，不同pH缓冲液中孵育24小时后，在pH 4. 0-7. 5范围内均能保留超 过70 %的剩余活力。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为对F85-20三维结构及活性位点的预测
[0032] 图2为F85-20诱导表达SDS-PAGE图谱
[0033] 图3为温度对F85-20活性的影响
[0034] 图4为F85-20的温度稳定性
[0035] 图5为F85-20的最适pH及pH稳定性
[0036] 图6为F175-3及F85-20对纤维素的水解产物研究
[0037] 图7为F175-3及F85-20与F175-3对玉米芯的水解产物曲线。
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例1、F85-20基因的克隆
[0041] 前期研究中，利用Fosmid载体构建了干式发酵污泥系统的宏基因组文库。经测序 及softberry预测0RF，以及NCBI及Pfam数据库注释。得到F85-20基因，该基因的核苷酸 序列为序列表中序列1自5'末端第19-1404位核苷酸，其编码的蛋白命名为F85-20,其氨 基酸序列为序列表中序列2自Ν'末端第1-462位氨基酸。经过比对，F85-20蛋白与来自 bacterium UASB270的β-葡萄糖苷酶有最高的60%相似性，预测其为β-葡萄糖苷酶。
[0042] 实施例2、F85-20作为β -葡萄糖苷酶的应用
[0043] 1、重组载体的构建
[0044] 以人工合成的序列1为模板，用F85-20F与F85-20R为引物，采用TAKARA公司的 PrimeStar高保真酶进行PCR扩增，得到1413bp的PCR产物，其核苷酸序列为序列1。
[0045] F85-20F:5' ~CATGCCATGGAGATACAAATGAATAAACAT~3,包含 Nco I 酶切位点
[0046] F85-20R:5' -CCCAAGCTTGGCATAAAGGGCCTCC-3，包含 Hind III 酶切位点
[0047] 上述PCR扩增的体系如下：
[0048]
[0049]
【权利要求】
1. 一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质： 1) 由序列表中序列2所不的氣基酸残基组成的蛋白质； 2) 将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
2. 编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)-5)中任一 所述的DNA分子： 1) 编码区为序列表中序列1 ; 2) 编码区为序列表中序列1自5'末端第19-1404位核苷酸； 3) 编码区为序列表中序列1自5'末端第11-1404位核苷酸； 4) 在严格条件下与1)或2)或3)杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子； 5) 与1)或2)或3)具有90%以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重 组菌。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所 述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。
6. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将所述重组载体导入目 的菌中得到的重组菌。
7. 权利要求1所述的蛋白在作为￠-葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖苷酶中的应用； 所述0 -葡萄糖苷酶的酶学特征具体为：最适pH值为6. 0,最适温度为65°C。
8. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述的表达 盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制备3-葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖苷 酶中的应用。
9. 一种制备3 -葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖苷酶的方法，为发酵权利要求6所述的 重组菌，即得到3-葡萄糖苷酶或纤维素酶或木糖苷酶。
10. 权利要求1所述的蛋白在降解生物质中的应用，所述生物质为玉米芯。
【文档编号】C12N15/56GK104388409SQ201410654095
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】吴晓磊, 王蒙, 来国莉, 聂勇, 耿爽 申请人:北京大学