专利名称：抑制性卡巴B蛋白(IkB)的截短形式，及其重组产物和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及掏转录因子，尤其是转录因子NFkB的激活的蛋白质。本发明还涉及这些蛋白质的重组产物，特别是体内重组产物，以及涉及编码这些蛋白质的核酸，其表达及其传递载体，其治疗和预防的应用，特别是通过基因治疗的方法来治疗成年呼吸窘迫综合征(ARDS)，哮喘、同种异体移植，排斥反应，脉管炎，和血管再狭窄，及其他主要由NFkB的抑制造成的疾病。
在炎症过程中，相当多的各种基因的表达在上皮细胞和内皮细胞中被上调，这些基因包括那些编码白细胞介素、转录因子、粘附分子，和血系统成分的基因。许多这些基因的转录涉及到转录因子NFkB。
转录因子NFkB在细胞质中被组成型表达。翻译后的修饰允许已完成转录的因子从细胞质转运到细胞核中，从而使得NFkB一样蛋白可诱地基因的转录。所述转运受一种被称为IkB的抑制蛋白的磷酸化和降解的控制，所述IkB与NFkB形成复合物，从而可在细胞质中得以维持。用适当的信号刺激细胞可导致IkB的修饰，这反过来会使IkB与NFkB解离。
IrB蛋白与NFkB的结合遮掩了NFkB的核定位信号(NLS)。根据细胞的类型和细胞发育的不同时期，用特异性的试剂刺激细胞，IkB就受到某种方式的修饰使它不能结合NFkB，从而使NFkB从IkB上解离下来。据信能导致这种修饰作用的信号涉及氧自由基的产生，或激酶的活化并引起IkB在其特殊部位的磷酸化；特别是在32Ser，36Ser和42Tyr这几个位点上的磷酸化。结果是其NLS被曝露出来，而NFkB易位至细胞核，在那里它能在控制基因表达的区段内结合特异性DNA序列。与这些位点结合的NFkB就引起与炎症过程有关的基因的转录。
转录因子NFkB最初是从成熟B细胞分离出的，在B细胞中，NFkB结合在K轻链增强子中的一段+聚体序列的基序上。尽管最初认为NFkB只是特异性地针对这种细胞类型和细胞发育的这个时期，但从那以后从很多类型的细胞中都鉴定出了NFkB一样蛋白，而且正如上文讨论过的，已显示出NFkB更广泛地涉及基因转录的诱导。在几个可诱导的基因中鉴定出有功能活性的NFkB结合位点进一步支持了上述观点。
NFkB是一种异二聚体蛋白，由一个50KD的亚单元(P50)和一个65KD的亚单位(P65)组成。P50和P65的cDNA已被克隆并显示在一段含300个氨基酸的区段上有同源性。P50亚单位与分离自哺乳动物和鸟类的C-rel原癌基因产物有显著同源性，并与果蝇背腹的基因产物有同源性。近来，已从血清刺激的成纤维细胞中将NFkB家族的另一个成员，relB克隆成一种立即早期反应基因。
p50和p65都能形成同源二聚体，尽管经们的特性不同p50的同源二聚体有较强的DNA结合亲和力但不能反式激活转录，而p65同源二聚体虽只能微弱地结合DNA却能反式激活转录。p50被合成为110KD的前体(p110)的氨基末端部分，此p110并无结合DNA和形成的二聚体的活性。p110的羧基末端部分有8个锚蛋白重复单位，这是在几种涉及细胞周期控制和分化的蛋白质中发现的一种基序。对与4kb p50前体RNA同时诱导的一段较短(2.6kb)的RNA类进行克隆发现，不管是经交替剪切或是用有区别的启动子，都能各自独立地表达110KD蛋白质的C末端部分。
现已鉴定出五种IkB家族的成员IkBα，IkBβ，p105/IkBγ，p100/IkBΔ，和IkBε(Baeuerle and Baltimore，Cell 87，13-20(1996))。所有IkB样家族成员均含有多个锚蛋白重复单位，它是抑制NF-kB激活所必需的。
所有三种IkBα样蛋白均有5个锚蛋白重复单位。RL/IF-1已被克隆并显示能表达在经肝切除术后30分钟内再生的肝中。对缺失突变的研究揭示pp40的5个锚蛋白重复单位中的4个是抑制DNA结合活性和与C-rel结合所必需的，研究还显示C末端区也是必需的。有关以110KD p50前体进行的单特并抗体研究已证实C末端部分(有IkB活性的部分)遮住了位于p50的氨基末端区中的核定位信号(NLS)。Brown等人在Science 267，1485-1488(1995)中报道了一个IkB的缺失突变体，它缺少54个NH2-末端氨基酸，该突变既未被信号作蛋白酶解，也未被信号磷酸化，并仍能完全抑制NFkB.Scheinman等人和Auphan等人报道由糖皮质激素诱导的免疫抑制是通过诱导IkB合成而介导的(Science，270，283-286 and 286-290(1995))。
本发明的一个目的是提供IkB样突变蛋白，它在体内不会失活，并因此仍能抑制NFkB和阻碍或防止对炎症的诱导。本发明因此提供了一种生物活性蛋白质，上述蛋白质通过抑制核因子卡巴B(NFkB)介导的对炎症反应的激活作用来模拟IkB的活性，该蛋白质选自由具有SEQID NO1序列的IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)截短蛋白组成的组。
本发明的一个较优选方面是提供了能编码截短蛋白的cDNAs。一个更为优选的方面是提供了编码Δ(1-44)IkBα蛋白的cDNA(SEQ IDNO2)。
另一方面，本发明涉及治疗哺乳动物的呼吸系统疾病，特别是成年呼吸窘迫综合症(ARDS)，同种异体移植物排斥反应，哮喘，炎性关节炎，脉管炎及再狭窄的方法，通过对需要这样的治疗的哺乳动物施以治疗有效剂量的蛋白质，该蛋白质选自由IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)截短蛋白组成的组，这是通过在体内或体外将能编码选自由IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)截短蛋白组成的组的一种蛋白质的核酸传递至哺乳动物细胞中，使之在细胞中表达以产生治疗有效量的蛋白质来实现的。在一个优选实施方案中，该核酸是能编码Δ(1-44)截短蛋白的核酸(SEQ ID NO2)。
图1.本发明的IkBα N末端截短的突变蛋白的氨基酸序列(SEQID NO1(Δ1-44))和编码这种IkB突变蛋白的cDNA核酸序列。
图2.IkB突变蛋白在Uzos细胞中抑制NFkB的激活。
图3.IkB突变蛋白对激活作用诱导的蛋白水解的抗性。
图4.IkB突变蛋白在LacI报道基因共转染实验中对gelB启动子活性的抑制作用。
图5.人内皮细胞中以逆转录病毒为基础的表达。
图6.抑制细胞因子诱导的CAM表达。
图7.抑制趋化因子的产生。
图8体内预防性基因治疗。
陈述以下定义是为了说明和解释本文描述本发明所用到的各种术语的意义和范围。
术语“治疗”意指对哺乳动物某一疾病的任一种治疗，包括(i)防止疾病，即，便疾病的临床症状不再发展；(ii)抑制疾病，即，限制临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即，使临床症状消退。
术语“有效量”意指对正接受治疗的疾病发展期足以能提供治疗效果的剂量。此剂量随病人，病情和受影响的治疗效果的不同而改变。
本文用到的术语“转化的”和“转染的”表示在靶细胞中引入一段编码一种IkB突变蛋白的多降核苷酸，如cDNA。
“可操作地连接”指使各成分能行使正常功能的连接。因此，一编码序列“可操作地连接”至一个调控序列是指某种构型，其中编码序列能在这些序列的控制下被表达。
“调控序列”指在某一特殊宿主生物体中表达一个可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。
“表达系统”是指DNA序列含有可操作地连接的所需编码序列和调控序列，以使被这些序列转化的细胞就能产生编码蛋白。为实现转化，表达系统可能包含在一个载体上；然而，有关的DNA也可能整合进宿主染色体。
“载体”是指由单链，双链、环状或超螺旋DNA组成的一个DNA分子。载体上含有，以恰当的距离可操作地连接的因子，以便能允许功能性基因表达，所述因子为启动子，5′mRNA前导序列，转录起始位点，核酸盒，3′未翻译区和聚腺苷酸化位点。在特殊应用中可除去一个或多个这些因子。核酸盒中可包含一个限制性酶切位点以便插入需表达的核酸序列。在功能性载体中核酸盒包括的需要表达的核酸序列带有翻译起始和终止位点。
如本文所用到的，术语“药学可接受的”指一种载体介质，它不受活性成分的生物活性的效力的干扰，对它所施予的宿主没有毒性。
如本文所用到的，术语“药学可接受的”指一种载体介质，它不受活性成分的生物活性的效力的干扰，对它所施予的宿主没有毒性。
如上所述，本发明涉及抑制性卡巴B蛋白(IkBα)的截短形式，它选自由IkBα(SEQ ID NO1)的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)，和Δ(1-44)截短蛋白组成的组。一个较优选的实施方案是抑制性卡巴B蛋白的N末端截短形式Δ(1-44)(表示为IkB-NT)，其序列见图1。这些IkB蛋白的截短形式(IkBΔ290，IkBΔ281，IkBΔ267，IkBΔ243，和IkB-NT)能抵抗炎症诱导的蛋白酶的水解作用，并保留结合NFkB和抑制其转录活性的能力。这些特点使重组的IkB蛋白截短形式能作为NFkB激活的有效抑制物而发挥功能，因而暗示它将具有显著的抗炎活性。编码IkB-NT的cDNA可在肺毛细管内皮细胞中表达以治疗成年呼吸窘迫综合征(ARDS)，哮喘，脉管炎和炎性关节炎。此外，移植的器官或静脉移植物可用此制剂处理以抑制同种异体移植排斥反应。血管内皮可在PTCA后通过一个导管而用某种截短蛋白处理以抑制再狭窄。
IkB-NT截短突变体(编码第45-第17位氨基酸)有超过作为NFkB激活作用的抑制物的IkB分子和IkB突变蛋白的好几种显著优点，这种截短为体缺IkBα的44个NH2末端的氨基酸，它们调节该蛋白的信号依赖性降解作为对活性信号的反应。第32和36位残基的丝氨酸被磷酸化，第22和23位的赖氨酸被遍在蛋白化(Scherer etal.，PNAS(USA)92，11259-11263(1995))，而第42位的酪氨酸(Imbert etal.，Cell86，787-798(1996))被磷酸化以对活化信号作出反应。这些事件致使IkBα从NFkB上分离，从而使NFkB激活而IkBα降解。因此，在IkB-NT截短突变体上所有三个关键信号位点的缺失就产生了一种NFkB抑制物，它能抵抗依赖于激活作用的蛋白水解降解作用。此外，这种截短突变体在作为基因治疗方式被表达时将比带氨基酸取代基的IkkBα突变体免疫原性更弱。此外，IkBβ应首先被磷酸化才能抑制NFkB的激活，而未磷酸化的IkBα就能抑制NFkB(Kremer et al.，J.BiolChem 271，16310-16316(1996))。
本文所述的IkB突变蛋白由具有规定的化学结构的蛋白物质组成。然而，其精确的结构取决于很多因素，特别是已知发生在蛋白质上的化学修饰作用。例如，由于所有蛋白质均带有可电离的氨基和羧基，则显然抑制物应以酸性或碱性盐形式，或中性形式被获得。更为明显的是，通过用糖分子衍生化(糖基化作用)或其他化学衍生化作用，一级氨基酸序列可被扩大所述化学衍生化作用包括将诸如脂，磷酸，乙酰基及类似的基因与抑制物共价接合或离子接合，常通过与糖类的结合出现这种情况。这些修饰作用可以在体外或体内发生，在体内发生是由一个宿主细胞通过后的加工系统完成。应理解，不管这种修饰作用是如何发生的，只要IkB突变蛋白活性的未被破坏，就打算在限定IkB突变蛋白时包括它。当然我们期望这种修饰作用能增加或减弱分子的生物活性，而这样的经化学修饰过的分子也将包括在本发明的范围之内。
编码人全长IkB(1-317个氨基酸)的cDNA分离自一个cDNA序，该序是用标准的PCR扩增方法从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的mRNA中制备出的。该cDNA用限制性核酸内切酶EcoRI和XbaI消化后被连接至一个真核表达质粒(pBJneo)中，产生了质粒pIkB-fl。用编码全长人IkB的质粒作模板经PCR扩增而构建IkB截短突变体(编码氨基酸1-289，1-280，1-266和45-317。较优选的缺失突变体(IkB-NT)缺少至少最初44个氨基末端的氨基酸；预期一直缺失到des-Ser70的N末端缺失突变体也有效，des-Ser70是第一个锚蛋白重复单位的起点。
有关克隆，扩增、表达和纯化的其他方法对于熟练技术人员而言是显而易见的。代表性的方法揭示在Sambrook，Fritsch，and Maniatis，分子克隆，实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)。
本发明的表达产物，即IkB突变蛋白，对防止和治疗各种哺乳动物疾病是有用的，其中显示出抗炎症的作用。尤其是，本发明的突变蛋白显示出可预防和治疗人的成年呼吸窘迫综合征(ARDS)，同种异体移植物排斥，哮喘，炎性关节炎，脉管炎和血管再狭窄。
本发明的突变蛋白同样可用于IkB抗体的产生及它们随后用作诊断和药物筛选工具的用途。表达载体可用于生产被NFkB抑制哺乳动物细胞，以此来评价免疫反应。
本发明的另一方面涉及药物组合物，它含有作为活性成分的本发明蛋白质或其药物可接受的盐类，并与药物可接受的天毒的载体相混合。这种组合物可被制备成非肠道用药(皮下，肌肉内或静脉内注射)的形式，特别是制备成液体溶液或悬浮液形式；也可制备成口服或经面颊用药，特别是片剂或胶囊形式；也可制备成肺或鼻内用药，特别是粉末，滴鼻液或气雾剂形式；还可制备成直肠或穿皮用药的形式。
该组合物可以以单位剂量形式很方便地用药，并可以用药学领域已知的任何方法制备，例如在Remingtoris Parmaceutical Sciences，17thed.，Mack Publishing Company，Easton，PA.，(1985)中所描述的方法。
可将本发明的化合物经预期的一段等时间传递给受试对象，比如，经一周至一年的时间，这一过程可通过单独施用一个受控制的释放系统(它带有足以应付所需释放时期的活性成分)来完成。为了这个目的，可利用各种受控释放系统，如单结石或贮式微囊，储存移植片，渗透泵，泡胶囊，脂质体，穿皮补片，离子电渗装置，和其他可注射的剂量形式。定位于需要传递活性成分的位点是某些受控释放装置的一种附加特征，它有利于治疗某些疾病。
受控放制剂的形式之一包括分散或用胶囊包裹在一个缓慢降解的，无毒，无抗原性聚合物(如共聚酶(乳酸/羟基乙酸))中的蛋白质或其盐，正如Kent，Lewis，Sanders and Tice在其探索性工作美国专利No.4,675,189中所述。该化合物，或最好是其相对不溶性盐，也可配制在胆固醇或其他以脂为基质的小丸，或以Silastomer为基质的移植片中。其他的缓慢释放，储存移植片或注射的制存剂对于熟练技术人员来说是显而易见的。例如，见，《持续的控制中的药物传递系统的释放》，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978以及R.W.Baker，《生物活性因子的受控释放》，John Wiley & Sons，NewYork，1987。
尽管有可能传递一有效剂量的突变蛋白自身至靶组织，蛋白降解作用和低传递效率的问题使我们更希望在原位最好是在胞质中表达本发明的突变蛋白，借此，NFkB介导的转录激活有可能通过阻止NFkB迁移进核内而被抑制。
在一个实施方案中，本发明提供了一个并源cDNA序列，正如本文所述，它在靶细胞中被组成型表达并编码一种IkB突变蛋白。该IkB突变蛋白编码序列与一个并源启动子序列可操作地连接，以致突变蛋白被持续表达。典型的启动子包括但不限于CMV，SV40和热激蛋白。
在另一个实施方案中编码本发明的突变蛋白一个cDNA序列被可操作地连接上一个并源可诱导的启动子序列，以使表达可被专一性的外源刺激物发动。适当的外源刺激物既可通过补体级联自然增加提供，也可通过将外来药物引入靶细胞而提供，还可通过某些其他的非化学的外在刺激物，如照射而提供。代表性的可诱导启动子系统是，描述在U.S.Patent No.5,364,791(Vegeto et al)的类固醇“基因开关”技术，由Gossen et al.，在PNAS 89，5547-5551(1992)所报道的四环素敏感系统。
我们期望本发明在体内或体外均可实施，只要是适合于所治疗的病症，所用到的治疗制度，和病人的整体健康。根据所选择的治疗方案，很多技术均可用于介导cDNA进入靶细胞。其中很多技术在体内或体外转染中同样有用；然而，熟练的技术人员应理解某种技术更适合于具体情况并能被相应地引导。总而言之，这些技术可分为物理类、化学类和生物类，下文将更详细地讨论。
生物转染技术中包括对逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒，痘病毒和细胞质粒的应用。
逆转录病毒载体来自逆转录病毒，它们是经随机地整合自己的基因组到宿主基因组中而复制出的。逆转录病毒载体比其他病毒载体可携带更大的遗传信息。但，逆转录病毒载体有其固有的安全问题包括已在病人体内存在的污染病毒或逆转录病毒的基因而产生病毒产物。它们能使逆转录病毒载体重新，获得其复制潜力并成为一个有完整功能的病毒。逆转录病毒载体在肌肉，脑和其他不增殖的细胞中很有用。合适的逆转录病毒载体描述在WO92/07573中。
腺病毒是一种线性，双链DNA病毒。一方面腺病毒血清型与呼吸道感染有关，另一方面也存在非传染性血清型。腺病毒有一个中等大小的基因组，可在细胞核内复制。腺病毒通过受体进入细胞，而其病毒DNA再转移至细胞核并被表达。它们对呼吸道上皮有亲和力，可能有用于肺病和气管病的治疗。它们也可用于出靶上皮细胞。它们可产生高滴度，而且相对较稳定，由于它们是DNA病毒，故可以用一种气溶胶来传送。这些病毒应用起来相对较简便，而且因为它们不进入染色体，也就减少了对有关插入诱变的担心。对腺病毒载体的应用和发展有一些限制。由于腺病毒的基因组是线性的，它们就不太稳定并更易发生转录错误。用于产生腺病毒载体的细胞系只生产出低水平的感染性病毒载体，并留存有天然，野生型病毒。更有甚者，腺病毒的抗体有可能针对这些被转化的腺病毒而发挥作用。较适用的腺病毒载体均描述在Rosenfeld etal.，Science，252，432(1991)。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒家族并由一个约4至6kb的单链DNA组成。AAV载体在宿主细胞中很稳定，并无证据表明AAV改变了细胞基因表达或引起了基因重排。AAV所能携带的遗传物质的最小量有限，只有约5kb的DNA能被包装进一个AAV载体。
痘病毒载体是大病毒并有几个可插入基因的位点。它们具有热稳定性，可在室温保存。安全性研究表明痘病毒载体有复制缺陷，不能从宿主转到宿主或转到环境中。与其他病毒一样，它也有其固有的重组和形成感染性颗粒的安全问题。痘病毒经吞噬作用被吸收，并因此将进入不同类型的细胞中。
质粒是，发现于细胞中的，双链DNA其复制，转录，翻译均独立于细菌基因组之外。已发现细菌来源的质粒是足以传递基因的载体。从质粒上除去复制基因以防止它传给子代细胞。例如，当质粒被注射进肌肉组织时，它就被细胞吸收。它并不整合进染色体，而是自主地转录和翻译。
化学和物理载体避免了应用生物载体所带来的有关安全的担心。本发明的实践中应用的方法包括，但不限于脂质体，脂，和两亲物，细胞受体，磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染，显微注射，电穿孔，以及多肽-DNA复合物。
脂质体是中空，球形载体，由磷脂组成。全身注射时，脂质体在肝、脾、肺和网状内皮系统中与细胞膜融合或被吸入细胞内。为增加击靶的专一性，将直接针对特殊细胞受体的单克隆抗体或配体附着在脂质体表面。
脂质体内的DNA受到保护，不会被降解。此外，应用脂质体克服了细胞屏障的限制带来的问题。脂质体有进行生物插入的好处，而且它不象病毒那样会产生复制的危险。
细胞受体靶向的基因传递是另一种方法。所有细胞在其表面均有能结合很多种因子或配体的一般性受体和独特的受体。结合受体的配体常常被吸收并成为基因激活的信号传导途径的一部分。通过击靶一个独特的受体，结合在配体上的一个基因被特异的细胞吸收，这时并无需考虑不需要的细胞类型，或者说也不必克服进入细胞时细胞表面的抗性。
磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染是广泛应用的转染方法。被转染的DNA经吞噬或吞饮进入胞质。根据细胞类型的不同，最多有20％的培养细胞类型能在任何时候被转染。
当核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物形式存在时培养中的细胞对DNA的吸收受到明显促进。Graham和Van der Eb(1973)(他们发展了将腺病毒和SV40的DNA导入粘附细胞的方法)描述了在中性PH条件下(pH7.05)最适于形成磷酸钙-DNA共沉淀物的钙浓度(125mM)和DNA浓度(5-30μg/ml)。此外，他们确定了沉淀反应的最佳时间(20-30分钟)以及随后将细胞暴露于沉淀物的最佳时间(5～24小时)。他们的工作为将克隆的DNA导入许多不同种的哺乳动物细胞打好了基础，并直接引导出细胞稳定转化及克隆DNA瞬时表达的可靠方法。对该方法的许多小改动已有描述，大多数均涉及在沉淀反应中混合各组分的顺序和方式的变更。通过结合另外的步骤，如在转染程序之后甘油振荡和/或氯奎处理，均能增加该方法的功效。用丁酸钠处理也显示能增强猴和人细胞中带有SV40增强子的持粒的表达。
DEAE-葡聚糖最初可用作易化剂以将脊髓灰质炎病毒RNA和SV40还有多瘤病毒的DNA导入细胞。这个方法，稍经改动后继续被广泛用于转染病毒的基因组和携带病毒序列的质粒。尽管DEAE-葡聚糖的作用机制尚不清楚，但我们认为该聚合物有可能结合至DNA上并抑制核酸酶的作用，和/或该聚合物结合至细胞并促进细胞内吞DNA。
经DEAE-葡聚糖介导的转染与经磷酸钙共沉淀物介导的转染在三个重要的方面有不同。第一，DEAE-葡聚糖介导的转染一般只用于克隆基因的瞬时表达而不用于细胞的稳定转化。第二，它作用于诸如BSC-1，CV-1和COS这样的细胞系时效力很高，但许多对其他类型的细胞结果不理想，可能是由于这种聚合物有毒。第三，用DEAE-葡聚糖转染所用的DNA量比用磷酸钙共沉淀时的少。用100-200ng超螺旋质粒DNA可获得105猴细胞的最大转染效力；若DNA用量再大些(＜2-3μ)就能产生抑制作用。与经磷酸钙介导的转染相反，磷酸钙介导的转染需要高浓度的DNA以促进沉淀的形成，而在DEAE-葡聚糖转染法中从不应用载体DNA。
已描述了DEAE-葡聚糖转染的很多变异形成。其中有两种重要的改变对方法的效力产生了很大影响所用的DEAE-葡聚糖的浓度以及细胞暴露于DEAE-葡聚糖混合物的时间长度。既可用相对较高的DEAE-葡聚糖浓度(1mg/ml)作用较短时间(30分钟至1.5小时)，也可用较低浓度(250μg/ml)作用较长时间(达8小时)。第一个转染方法较为有效，但它涉及当细胞暴露于易化剂时监控细胞对外界压力的早期信号的反应。第二种技术较不严格，也因此而更可信。
聚阳离子PolybreneTM能使低分子量DNA(如质粒DNA)有效而稳定地导入用其它方法较难成功转染的细胞条中。
Polybrene已被用作DNA转染入某类细胞的易化剂，该类细胞已被证实对用磷酸钙共沉淀进行的转染有相对抗性。这种方法在用质粒DNA对CHO细胞进行稳定转化时很有效，产生了比磷酸钙-DNA共沉淀法多约15倍的转化子。不过两种方法在高分子量DNA转化的效力中并无区别。目前尚不知Polybrene介导的转染到底是能用于克隆DNA的瞬时表达还是适于对除CHD以外的其他细胞系的稳定转化。
原生质体融合是将本发明的cDNA导入靶细胞的另一种方法。在这个方法中，由带有高拷贝目的质粒的细菌衍生而得的原生质体直接与培养的哺乳动物细胞混合。细胞膜融合之后，(通常借助聚乙二醇，PEG)，细菌的内含物被传至哺乳动物细胞的胞质中，而质粒DNA则被转移至核。对许多通常用于瞬时表达试验的细胞系而言，原生质体融合并不象转染一样有效，但对那些不能有效的内吞DNA的细胞系原生质体融合则是有用的。原生质体融合常产生随机整合到宿主染色体上的多拷贝的质粒DNA。
可通过将原生质体(从携带目的质粒DNA的细菌制备而得)与培养的哺乳动物细胞融合，而将克隆的DNA导入哺乳动物细胞中。在有氯霉素存在时培养细菌以扩增质粒DNA，然后用溶菌酶处理去掉细胞壁。得到的原生质体在哺乳动物单层细胞上离心，所得的混合物用聚乙二醇(PEG)处理以促进融合。该过程中，细菌DNA和质粒DNA均被转移至哺乳动物细胞内。再除去PEG，细胞在含卡那霉素的新鲜细胞培养基中培养以抑制任何幸存细菌的生长。原生质体融合既被用于克隆基因的瞬时表达，也被用于建立哺乳动物细胞的稳定细胞系。
原生质体融合已被用于将免疫球蛋白基因稳定导入B细胞以及将珠蛋白基因导入小鼠红白血病细胞。此方法的好处就是其高效性，但操作很费时，而共转化通常是不可能的。因而目的基因必须总是携带在含有所需的可选择的标记的质粒上。
电穿孔涉及到对哺乳动物细胞施用短时、高压电泳冲以便在胞质膜上形成纳米大小的孔。DNA可通过这些孔，也可以作为伴随着孔的关闭而重新分布膜成分的结果直接被导入细胞质中。电穿孔可能非常有效，且它既可用于克隆基因的瞬时表达，也可用于建立携带有整合的目的基因拷贝的细胞系。与磷酸钙介导的转染和原生质体融合相比，电穿孔常产生带有外源DNA的一个，或至多几个整合拷贝的细胞系。
该方法被用于瞬时表达和稳定转化，但转染效力差别很大。必须完成一系列预备实验以确定对某一特定的细胞系能导致可接受的瞬时表达或稳定转化水平的条件。
电穿孔转染效力受很多因素的影响1)所用电场的强度。低电压下，培养的细胞的胞质膜的改变不足以让DNA分子通过；在较高电压下，细胞被不可逆地损坏了。对大多数哺乳动物细胞系而言，在电压介于250V/cm和750v/cm之间时可达到瞬时表达的最高水平(例如用CAT活性试验来测量)。典型情况下，有20％至50％的细胞在此处理中幸存。2)电脉冲的长度。通常，一个单一的电脉冲可穿透细胞。有些电穿孔设备允许实验人员控制脉冲的长度和形状；在其他设备中，脉冲的特性仅决定于所提供的电源的电容。可利用的数据指示电穿孔所需的最佳电脉冲长度是20-100毫秒。如果细胞暴露于电脉冲后在电穿孔室中再温育1-2分钟就能增加瞬时表达的效力。3)温度。一些研究人员报道当细胞在电穿孔期间维持在室温下可获得瞬时表达的最高水平；其他人将细胞维持在0℃而获得了更好的结果。这些矛盾可能是因为同类型的哺乳动物细胞对穿过电流的反应不同造成的，也可能是电穿孔期间用大电压(＞1000v/cm)和/或延长的电脉冲(＞100毫秒)产生的热量不同造成的。4)DNA的构象和浓度。尽管线性或环状DNA均可经电穿孔转染，但用线性DNA时获得了瞬时表达和稳定转化的较高水平。用浓度范围为1μg/ml至40μg/ml的DNA可获得有效转染。5)培养基的离子组成。细胞悬浮于缓冲盐溶液(如HEPES缓冲的盐小)比悬浮于非离子物质(如甘露醇或蔗糖)缓冲溶液中转染效力要高很多倍。电穿孔有一个主要的优点对于其他技术，如磷酸钙-DNA共沉淀技术效果打折扣的细胞系，电穿孔可以很好地发挥作用。然而，仍需进行周密的工作以确定所研究的特殊细胞系的最佳条件。现已有许多不同电穿孔仪器可以商购，而厂家亦为它们的应用提供了详细的操作说明。
将DNA导入细胞的另一个重要方法是将DNA与化学修饰的蛋白质结合。这些修饰过的蛋白质能通过化学附着的合成多聚赖氨酸肽结合DNA，并结合至靶细胞上的特异受体。当这些复合物经特并受体介导的内吞作用被吸收后，DNA编码的基因可被靶细胞表达。用转铁蛋白/多聚赖氨酸/DNA复合物以及脱唾液酸糖蛋白/多聚赖氨酸/DNA复合物都做了实验。使用共价，化学结合的天然配体(1)将DNA特异地靶向不同组织；(2)提供更有效的吸收过程。这些方法的使用受限，因为它们需用化学或酶方法在体外修饰配体以产生能结合DNA的化合物。另外也可以应用Ledley et al.，描述在WO94/25608中的结合DNA的蛋白质技术。
脂质体作为体外和体内传递载体的用途已被染入研究。这些方法大多涉及将DNA或RNA包裹在脂质体中，再将脂质体与细胞膜融合。然而，也有人揭示了另一种转染方法，其中DNA与一种合成的阳离子脂或两亲物混合并经融合被导入细胞。
施用能编码本发明的IkB突变蛋白的核酸的一种较优选方法是用一种非病毒载体，最好是一种阳离子两亲物(如，DOTMA)来转染，它们描述在美国专利NO.4,897,355，WO95/14381，WO96/18372，WO96/01840，WO96/01841和Proc.Nat.Acad.Sci(USA(93，3176-3181(1996)，在此列入本文参考文献。
该DNA转染方法可用作治疗炎症的方案的一部分。既可以通过从受感染病人体内抽出细胞，体外用合适的基因转染再将成功转染的细胞重新注入病人体内来进行治疗；也可以通过用合适的使转染能在体内发生的载体对受感染的病人全身性直接施用适当DNA来进行治疗。体内程序按以下方式进行，它采用自文献(Anderson，Science 226，401-409(1984)；Williams et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.83，2655-2670(1986))。从病人体内提取出适宜量的组织细胞(从107-109)。该组织细胞可来源于各种器官，如肝，脾，血液或皮肤，但最可能是来源于骨髓。对组织进行胰酶消化或其它必需的方式就制备出细胞以便能进行组织培养，细胞在适当的培养基上生长适宜的时间(如1天至2周)，然后加入适于所治疗的特殊遗传病的DNA/DOTMA脂质体复合物，以与前面所述的方法一致的组合物进行转染。细胞培育适当的时间，约4至72小时，然后洗涤被成功转染的细胞并重新注入受感染病人体内。
体内转染过程可按Nicolau et al.，Proc，Nat，Acad，Sci 80，1068-1072(1983)所述进行。DNA脂质体复合物，或双包被的DNA复合物，或共价修饰的双包被复合物按Eppstein et al.文献同上所描述的来制备。这种共价修饰的复合物将带有附着的抗体，蛋白质，激素，糖类或其他化学修饰以便将它们击靶特殊的目的细胞。例如，该复合物可带上皮细胞的抗体，以便将复合物击靶上皮细胞；或者它们可带有针对骨髓细胞的某一特殊亚群的抗体，从而将复合物击靶这些细胞。对受感染病人用药可以是静脉内注射(IV)，皮下注射(SC)，腹膜内注射(IP)，肌肉内注射(IM)，局部施用，或经气溶胶至鼻或肺。治疗方案既可涉及单一治疗，也可经常按需要要为多种治疗的联合，IV剂量可以以团块形式给予，也可以是慢速输入。
给出以下实施例是为了使本领域的技术人员能更清楚地理解并实践本发明。它们不应被看作是对本发明范围的限制，而仅仅是作为本发明的举例说明和代表。
实施例1构建IkB质粒用PCR扩增法从人脐静脉内皮细胞cDNA库(Stategene，LaJolla，(A)中分离编码人全长IkB(1-317氨基酸)的cDNA。按厂家(GeneAmp kit，Perkin Elmer，NorwalK，CT)提供的条件进行PCR扩增，使用以下寡核苷酸引物(限制性内切酶位点均以划线表示)正向5′ccgcgtctagacagctcgtccgcgccatgttcc 3′(SEQ ID NO3)反向5′ccgccgaattcatacaagtccatgttctttcagcc 3′(SEQ ID NO4)30个扩增循环，每一次均是94℃1分钟(变性)，55℃1.5分钟(退火)，72℃2分钟(延伸)。该cDNA经限制性内切酶EcoRI和Xbal消化后被连接至一个真核细胞表达质料pBJneo(Lin et al，Science249，677-679(1990))上从而产生了质粒pIkB-fl。IkB-NT截短突变体(编码氨基的46-317)的构建是经PCR扩增完成，用到编码全长人IkB的质粒作模板。PCR反应的进行(如上所述)用到以下寡核苷酸引物(限制性酶切位点均以划线表示)正向5′ggctctagaatggtcaaggagctgcaggag 3′(SEQ ID NO5)反向5′ccgccgaattcatacaagtccatgttctttcagcc 3′(SEQ ID NO6)用Xbal和EcoRI限制酶消化885bp的PCR扩增子，并亚克隆到pBJneo真核表达质粒以产生质粒pIkB-NT。
在羧基端有缺失的IkB的其他类似的截短突变体，亦如上所述按与全长IkB相同的方法制备出来。PCR扩增所用的正向引物与上相同，反向引物如下IkB截短物引物IκB 1-289cgcgaattcatagctctcctcatcctcactctc (SEQ ID NO7)IκB 1-280cgcgaattccagcatctgaaggttttctagtgtc(SEQ ID NO8)IκB 1-266cgcgaattcctgtatccgggtgcttgggcggcc(SEQ ID NO9)IκB 1-242cgcgaattcatcagccccacacttcaacaggag(SEQ ID NO10)实施例2 构建对照和标记质粒从人基因组DNA中经PCR扩增人胶原酶B启动子区(核苷酸-670至+7)。人基因组DNA是使用商业提供的试剂盒(Turbogen，Invitrogen)从一种人EBV转化的B细胞系中得到的。人胶原酶B启动子区带有一个NF-KB识别位点(Sato et al.，Oncogene8395(1993))。PCR扩增如上述按厂家说明进行，用到以下寡核苷酸引物5′gcgaagcttctagaggctgctactgtcccctttactg 3′(SEQ ID NO11)5′cgcgcatgccctccttgacaggcaagtgctgctc 3′(SEQ ID NO12)扩增的DNA经Hind3和Sph1限制性内切酶消化并连接进能编码β-半乳糖苷酶的质粒pSDK-LacZ(亦称作pSDK-LacZpA)中，(Logan et al.，Development 117，905-906(1993))，并被称为pGelB。人、小鼠和突变的小鼠3×NFkB/LacZ质粒(pNFkB/LacZ)的制备是通过将以下寡核苷酸连接进质粒pSDKLacZ-TK的Hind III和SalI的位点，而质粒pSDKLacZ-TK带有最少的胸腺嘧啶核苷激酶启动子，它能指导LacZ报道基因的表达人3X NFκB5′agc TTG GGG ATT TCCGAT CGG GAC TTT CCG ATCGGG GAT TTCCGA C CCC TAA AGG CTA GCC CCT AAA GGC TAG CCC CTA AAGGCA GCT 3′(SEQ ID NO13)鼠3x NFκB5′AGC TTG GGA CTT TCCGAT CGG GAC TTT CCG ATCGGG ACT TTCCGAC CCT GAA AGG CTA GCC CTG AAA GGC TAG CCC TGA AAGGCA GCT 3′(SEQ ID NO14)突变小鼠3x NFκB
5′AGC′TTC TCA CTT TCCGAT CCT CAC TTT CCG ATCGTC ACT TTCCGAG AGT GAA AGG CTA GGA GTG AAA GGC TAG GAG TGA AAGGCA GCT 3′(SEQ ID NO15)NFkB识别因子均以划线表示。插入序列的方向经DNA序列分析证实。
实施例3 转染和测定的方法U20S细胞(骨肉瘤细胞系，ATCC登录号HTB96)在McCyoy′s5A培养基(Gibco/BRL Gaithersburg MD)中在37℃ 5％ CO2的培养箱中培养，所述培养基中含有10％胎牛血清，并含有青霉素/链霉素。在对数生长期(70％铺满)用含2mM EDTA的PBS处理而收获细胞。离心和洗涤后，将细胞重新悬浮于PBS缓冲液中，其中含有Hepes(1.3g/100ml)，和50μg/ml的质粒，细胞浓度为107个细胞/ml。细胞悬浮液在4℃保温30分钟，再用107BioRad(Hercules，CA)电穿孔器以250mV，960μF的设置在室温下电穿孔。然后细胞中加入6ml组织培养基以稀释，并在Costar微孔板中培养。20小时后更换培养基。刺激前10小时，培养基用OptiMEM(Gibco/BRL)培养基替代。测定前18小时时，往微孔里加入12-肉豆寇13-乙酸佛波醇(PMA)至终浓度为25ng/ml。
用冷PBS培养基洗涤后，细胞被刮入0.25ml PBS中收集。再洗涤，然后细胞重新悬浮于60μl的溶液中，该溶液含0.25M蔗糖，10mM TrisHcl pH7.4，10mM EDTA。经干冰/乙醇浴和37℃融解这样3个冷冻循环，细胞被裂解。离心去除细胞核和碎片，取出上清用于测定。细胞裂解物中的蛋白质含量用Pierce(Rockford IL)蛋白质测定试剂盒按厂家说明进行测定。细胞裂解产物中的β-半乳糖苷酶活性用4-甲基umbelifery β-D半乳糖苷(MUG，Sigma#M1633)作底物进行测定。测定均在96孔板上按说明书进行。与含5μg亘白质(1-10μl)的细胞裂解产物保温后水解出的底物总量用CytoFluorII荧光计(Millipore Bedford，MA)进行荧光测定。
实施例4 NFkB激活的抑制本实施例证实在U20S细胞中IkB-NT抑制了NFkB的激活。被按实施例3所术，用能编码全长或截短形式的IkBα的质粒(pIKB fl和pIkB-NT，见实施例1)和有LacZ报道序列和人NF-KB识别位点的质粒(实施例2的pNFkB/LacZ)。共转染细胞。在未经刺激的和经PMA刺激的细胞中测量由NFkB驱动的LacZ活性。作为对照，用pGelB，突变的NFkB识别位点的质粒(实施例2)，或pCMV-LacZ(对IkB无反应)，而不是pNFkB/LacZ共转染细胞。所测得的β-半乳糖苷酶活性与细胞裂解产物中的蛋白质含量统一标准；结果见图2。
可见到pGelB细胞可对PMA激活作用起反应；IkB-fl和IK-NT均显著降低了此反应。与之相似，表示为3X NF-KB(pNFkB/LacZ)的细胞的反应也被IkB-NT显著地减小。所观察到的IkB-NT相对于IkB-fl较大的抑制作用被归结于前者对降解作用的抗性。如果缺失NF-KB的识别位点，就没有LacZ的表达和β-半乳糖苷酶活性。已知CMV-LacZ匠表达不依赖IkB。
实施例5本实施例证实IkB突变蛋白可抵抗激活作用诱导的蛋白水解作用。用抗IkBα单克隆抗体经免疫印迹来定量U20S细胞被激活0，5，或15分钟后全长IkBα蛋白和截短的IkBα蛋白含量。用编码全长以及截短形式的NFkB的质粒瞬时转染U20S细胞。再制备出细胞裂解产物，用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质再做免疫印迹。
对每一份样品，用50μg实施例1的质粒电穿孔107U20S。36小时后将它们培养在Optimen培养基中，72小时后用50ng/ml TNF-α(Genzyme)刺激0，5，或15分钟。4℃下，在溶解缓冲液中溶解细胞。所述缓冲液中有50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1mM EDTA，1.5mM MgCl2，100mM NaF和10mM焦磷酸钠，1mM PMSF，1mM原钒酸钠，10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮肽素。离心溶胞产物以去除细胞碎片和胞核，在15％的SDS-PAGE凝胶上的每一泳道中加150μg蛋白质。用ECL方法按厂家说明进行免疫印迹。抗IkBα-MAD-3抗体(Santa CruZ Biotechnology#SD-203)被用作全长IkBα和羧基端截短的IkBα的第一抗体，而#SC-271被当作IkB-NT的第一抗体来用。结果见图3。
实施例6本实施例证实IkB截短物抑制gelB启动子的活性。用LacZ报道基因的质粒(pGelB)和IkBα全长或截短形式共转染U20S细胞。测量在未刺激或PMA激活的细胞中β-半乳糖苷酶的活性。结果见图4。
所有IkB截短物均抑制NFkB活性，其中IkB-NT是最有效的。
实施例7附加型逆转录病毒载体的构建及病毒的产生带有全长IkB的附加型逆转录病毒表达载体(pWZRneo-IkB)或带截短的IkB-NT的附加型逆转录病毒载体(PMZRneo-IkB-NT)均按Kinsella and Nolan(Human Gene Therapy 7，1405-1413(1996)的方法来构建。对该附加型载体作如下修饰用BspH1切割LZRA-LacZ(A)产生一个7.5kb的片段，其中含有EBV EBNA-1和on序列。pWZLNeo用BspH1切割以除去apmr序列产生一个5.48kb的片段。将7.5kb和5.48kb的片段连接起来就产生一个杂合EBV附加型逆转录病毒载体(pWZRone)，它有新霉素抗性。
将每种载体转染进高滴度兼嗜性包装细胞系ФNX-A中(如Kinsella和Nolan所述(文献同上))，从而产生三种能产生逆转录病毒的细胞系Ф-IkB/WT，Ф-IkB/NI和Ф-载体。
实施例8以逆转录病毒为基础在人内皮细胞中表这IkBα-突变蛋白本实施例证实利用一种逆转录病毒启动子在人内皮细胞中表达的IkB突变蛋白能抵抗激活作用诱导的蛋白水解作用。人肺微血管内皮细胞(HLMVEC)购自Clonetics，在DMEM/F12培养基(含5％胎牛血清和10ng/ml FGF)中，37℃在6.5％CO2的培养箱内培养。IkB突变蛋白经如下的逆转录病毒转染作用在HLMVEC中被过度表达。从每种生产者细胞系中收获逆转录病毒培养上清，而(培养在T-75培养瓶中)的HLMVEC用10ml的Ф-IkB/WT，Ф-IkB/NT或Ф-vector的逆转录病毒培养上清进行转录，并补加12μg/ml DEAE葡聚糖+10ng/mlFGF。16小时后更换培养基，在分析前，感染后细胞还将扩充培养1周。
用免疫印迹法定量测定转录的HLMVEC±激活中对全长IkBα蛋白和截短IkBα蛋白的表达。转导的HLMVEC培养在T-75瓶中铺满，并用新鲜培养基±0.1ng/ml的IL-1和TNFα温育6小时。细胞溶解产物和免疫印迹按实施例5制备。抗IkBαMAD-3多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology #SC-203)被用于检测全长IkB，SC-271被用于检测IkB-NT。结果见图5。
实施例9IkBα突变蛋白在体外抑制炎症介质本实施例证实IkB短物的稳定表达在细胞因子激活的人肺微血管内皮细胞中(HCMVEC)抑制了细胞粘附分子(ICAM，VCAM和e-选择素)以及MCP-1和IL-8趋化因子的诱导。ICAM，VCAM和e-选择素按下述用单克隆抗体(R & D Systems，α-ICAM BBA-3，α-vCAM BBA5，和α-ELAM BBA2)，HLMVEC用带有neo-载体Ф-vector对照的逆转录病毒构建体转导，或用N末端截短的IkBФ-NT转导，将此HLMVEC在96孔板上加或不加IL-1/TNF(0.1ng/ml)培养6小时。用PBS洗细胞，用4％缓冲的福尔马林固定10分钟，用含0.5％BSA的PBS(PBSB)洗3次，再用含10％标准羊血清的PBSB封闭。0.1μg/ml单克隆抗体被加入一式三份的孔中作用90分钟，再加HRP-偶联的羊抗小鼠IgG作用30分钟。用IPD作底物来检测免疫反疫活性，并用分光光度计检测OD值的变化(Molecular Dynamics)。表达表示成在细胞因子刺激的HLMVECФ-vector对照细胞中所测到的最大反应的百分率。结果见图6。
IE8和MCP-1的表达和分泌在条件培养基中测得，该培养基来自在24孔板上加或不加IL-1/TNF(0.1ng/ml)培养的HLMVEC/Ф-vector或HLMVEC/Ф-NT细胞。在24和48小时时收获条件培养基，而MPC-1和IL8水平则严格按厂家说明用ELISA(R & DSytems)检测。结果见图7。
实施例10IkB-NT突变蛋白在体内抑制炎症本实施例证实IkB-NT的局部应用抑制了兔肺部的免疫复合物诱导的急性炎症。带有一个CMV启动子及牛生长激素多聚腺苷酸化序列，并能调节IkBα-NT或一个报道基因氯霉素乙酰转移权衡利弊(CAT)的质粒已构建出来。P10管连接至一个30号针经气管将100μg纯化质粒滴入兔子肺部。滴注质粒DNA24小时后，如Mulligan et al.，所述(J.Clin Invest 88，1396-1406)通过形成IgG免疫复合物诱导了肺部炎平。简而言之，含有3mg兔BSA-IgG的300μl水被滴注通过麻醉兔的气管，随后马上静脉注射0.5ml含1mg BSA的PBS(尾静脉)。在肺内形成了免疫复合物，而4-24小时后就测到了急性炎症，方法是测肺的支气管灌洗液(BAL)中的细胞流入。处死动物，肺滴注10mlPBS以便洗出BAL中的细胞，使用Coulter计数器通过计数每100μl一等份样品中总细胞数而定量细胞流量，从24小时的时间点得到的结果见表8，从图中可见处理组小鼠的BAL细胞计数比对照组的低一个数量级。
虽本发明已就其特殊的实施方案作了描述，但本领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的真正精神和范围的前提下可以做各种改变，也可以等价取代。此外，必须进行很多修饰工作以适应一种的情况，材料，物质的组成，过程，过程的某一步或多步，以符号本发明的目标、精神和范围。所有这类修饰均包括在此附加的权利要求的范围中。所有上文引用的病人和出版物在此均列入参考文献中。
序列表(1)一般资料(I)申请人a)姓名F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)州BS(E)国家Switzerland(F)邮编CH-4070(G)电话061-688 13 95(H)传真061-688 13 95(I)电传962292/965542 hlr ch(ii)发明的题目抑制性卡巴B(IkB)蛋白的截短形式，及其重组产物和应用(iii)序列数15(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机(C)操作系统(D)软件(2)SEQ ID NO1的资料(I)序列特征(A)长度317氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑构型未知(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO1的序列描述Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro1 5 10 15Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser20 25 30Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu35 40 45Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu50 55 60Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu65 70 75 80Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln85 90 95Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln100 105 110Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu115 120 125Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly130 135 140Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val145 150 155 160Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu165 170 175Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile180 185 190His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp195 200 205Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala210 215 220Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly225 230 235 240Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu245 250 255Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu260 265 270Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser275 280 285Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro290 295 300Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu305 310 315(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度819个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴构型未知(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO2的序列描述ATGGTCAAGG AGCTGCAGGA GATCCGCCTC GAGCCGCAGG AGGTGCCGCG CGGCTCGGAG60CCCTGGAAGC AGCAGCTCAC CGAGGACGGG GACTCGTTCC TGCACTTGGC CATCATCCAT 120GAAGAAAAGG CACTGACCAT GGAAGTGATC CGCCAGGTGA AGGGAGACCT GGCCTTCCTC 180AACTTCCAGA ACAACCTGCA GCAGACTCCA CTCCACTTGG CTGTGATCAC CAACCAGCCA 240GAAATTGCTG AGGCACTTCT GGGAGCTGGC TGTGATCCTG AGCTCCGAGA CTTTCGAGGA 300AATACCCCCC TACACCTTGC CTGTGAGCAG GGCTGCCTGG CCAGCGTGGG AGTCCTGACT 360CAGTCCTGCA CCACCCCGCA CCTCCACTCC ATCCTGAAGG CTACCAACTA CAATGGCCAC 420ACGTGTCTAC ACTTAGCCTC TATCCATGGC TACCTGGGCA TCGTGGAACT TTTGGTGTCC 480TTGGGTGCTG ATGTCAATGC TCAGGAGCCC TGTAATGGCC GGACTGCCCT TCACCTCGCA 540GTGGACCTGC AAAATCCTGA CCTGGTGTAC CTCCTGTTGA AGTGTGGGGC TGATGTCAAC 600AGAGTTACCT ACCAGGGCTA TTCTCCCTAC CAGCTCACCT GGGGCCGCCC AAGCACCCGG 660ATACAGCAGC AGCTGGGCCA GCTGACACTA GAAAACCTTC AGATGCTGCC AGAGAGTGAG 720GATGAGGAGA GCTATGACAC AGAGTCAGAG TTCACGGAGT TCACAGAGGA CGAGCTGCCC 780TATGATGACT GTGTGTTTGG AGGCCAGCGT CTGACGTTA 819(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO3的序列描述CCGCGTCTAG ACAGCTCGTC CGCGCCATGT TCC 33(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO4的序列描述CCGCCGAATT CATACAAGTC CATGTTCTTT CAGCC 35(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO5的序列描述GGCTCTAGAA TGGTCAAGGA GCTGCAGGAG 30(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO6的序列描述CCGCCGAATT CATACAAGTC CATGTTCTTT CAGCC 35(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO7的序列描述
CGCGAATTCA TAGCTCTCCT CATCCTCACT CTC 33(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO8的序列描述CGCGAATTCC AGCATCTGAA GGTTTTCTAG TGTC 34(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO9的序列描述CGCGAATTCC TGTATCCGGG TGCTTGGGCG GCC 33(2)SEQ ID NO10的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO10的序列描述CGCGAATTCA TCAGCCCCAC ACTTCAACAG GAG 33(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO11的序列描述GCGAAGCTTC TAGAGGCTGC TACTGTCCCC TTTACTG 37(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO12的序列描述CGCGCATGCC CTCCTTGACA GGCAAGTGCT GCTC 34(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征(A)长度88个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO13的序列描述AGCTTGGGGA TTTCCGATCG GGACTTTCCG ATCGGGGATT TCCGACCCCT AAAGGCTAGC 60CCCTAAAGGC TAGCCCCTAA AGGCAGCT 88(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度88个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEQ ID NO14的序列描述AGCTTGGGAC TTTCCGATCG GGACTTTCCG ATCGGGACTT TCCGACCCTG AAAGGCTAGC 60CCTGAAAGGC TAGCCCTGAA AGGCAGCT 88(2)SEQ ID NO15的资料(i)序列特征(A)长度88个碱基对(B)类别核酸(c)链型单链(D)拓朴构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(xi)SEO ID NO15的序列描述AGCTTCTCAC TTTCCGATCC TCACTTTCCG ATCCTCACTT TCCGAGAGTG AAAGGCTAGG 60AGTGAAAGGC TAGGAGTGAA AGGCAGCT 88
权利要求
1.一种生物活性蛋白质，该蛋白质通过抑制核因子卡巴B(NFkB)介导的炎症反应的激活而模拟了IkB的活性，该蛋白质是IkBα的一种截短形式。
2.权利要求1的生物活性蛋白质选自由具有序列SEQ ID NO1的IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)组成的组。
3.由SEQ ID NO1Δ(1-44)限定的权利要求1的生物活性蛋白质。
4.一种缩码权利要求1至3的蛋白质的核酸序列。
5.由SEQ ID NO2限定的权利要求4的核酸序列。
6.一种表达载体，含有权利要求4或5的核酸序列，此序列与表达该序列所必需的调节因子可操作地连接。
7.权利要求6的载体，进一步含有一个可诱导的启动子。
8.权利要求6或7的载体为质粒。
9.权利要求8的载体，是质粒pIkB-NT。
10.一种权利要求1至3的蛋白质的抗体。
11.用于制备权利要求1至3的生物活性蛋白质的方法包括a)用权利要求6至9的载体转化宿主细胞b)在适于扩增载体并表达蛋白质的条件下培养该宿主细胞；以及c)从培养基中收获细胞。
12.权利要求1至3的生物活性蛋白质，作为治疗活性剂。
13.权利要求1至3的生物活性蛋白质作为治疗活性剂，以治疗成人呼吸窘迫综合症，同种异体移植物排斥反应，哮喘，炎性关节炎，脉管炎和(血管)再狭窄。
14.权利要求6至9表达载体，作为治疗活性剂。
15.权利要求6至9的表达载体，作为治疗活性剂，以治疗成人呼吸窘迫综合症，同种异体移植物排斥反应，哮喘、炎性关节炎、脉管炎、和(血管)再狭窄。
16.一种药物组合物，包括权利要求1至3的蛋白质和药学可接受的载体物质。
17.权利要求1至3的生物活性蛋白质，用以制备药物组合物的用途。
18.权利要求1至3的一生物活性蛋白质，用来制备药物组合物以治疗成人呼吸窘迫综合症，同种异体移植物排斥反应，哮喘，炎性关节炎，脉管炎和(血管)理狭窄的用途。
19.权利要求6至9的表达载体用以制备治疗有效剂量的权利要求1至3的蛋白质的用途。
20.权利要求4和5的核酸序列，用以产生权利要求1至3的蛋白质的用途。
21.权利要求4和5的核酸序列用以产生权利要求6至9的表达载体的用途。
22.权利要求1至3的生物活性蛋白质无论何时都能由权利要求11中要求的方法制备。
23.基本上由上文所描述到的产物，药物组合物，过程和方法。
全文摘要
在此提供了抑制性卡巴B蛋白(IkBα)的截短形式，能编码截短物的核酸，表达和传递载体，及其治疗性和预防性应用。
文档编号C12N15/12GK1157828SQ9611978
公开日1997年8月27日 申请日期1996年12月13日 优先权日1995年12月15日
发明者G·A·皮特兹 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司