专利名称：一种抑制肿瘤坏死因子的抗炎融合蛋白的制备及其应用的制作方法
技术领域：
生物工程药物技术背景肿瘤坏死因子α(TNF-α)是介导炎症反应的主要细胞因子之一，既具有抗肿瘤、抗病毒的生物学作用，也是炎性组织坏死、脓毒性休克等炎症损伤和类风湿关节炎等自身免疫疾病主要因素之一。TNF-α主要由单核巨噬细胞合成、分泌。反过来又以自分泌和旁分泌的方式激活单核巨噬细胞，使其产生释放大量IL-1、IL-6、IL-8、PGE2等炎性介质，激发炎症的连锁反应，加重炎症损伤。
TNF-α都是通过细胞膜上受体来发挥其生物学活性的。已知的TNF-α受体有两种，即TNF受体1和2(TNFR I和TNFR II)，它们的分子量分别为55kD和75kD。TNF-α的大多数生物学效应是通过TNFR I产生的。而TNFR II因其胞质段缺乏死亡结构域(Death Domain，DD)，可能主要参与刺激T细胞增殖，介导CD8+T细胞凋亡和清除，与II型糖尿病、急性肾病、类风湿性关节炎、哮喘等许多自身免疫疾病的发生与发展有关。
TNFR II全长439个氨基酸残基(aa)，其中胞外区是与TNF-α识别并结合的区域，由4个30～40个氨基酸长度，富含Cys的保守结构域组成。体内存在TNFR II胞外区部分从细胞膜上游离脱落的可溶性TNFR II(sTNFR II)。它能与TNF-α结合，但不产生生物效应，反而竞争抑制TNFR I与TNF-α的结合，因而具有抗炎的作用。基因工程表达的sTNFR II也证实具有中和TNF-α引起的炎症反应的作用。
血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是中枢和外周神经系统的重要递质，具有免疫调节作用。VIP分子为一直链肽，由28个氨基酸残基构成，分子量约3kD，属胰高血糖素-胰泌素家族。VIP能抑制活化的巨噬细胞和单核细胞，抑制IL-6、TNF-a、IL-12和趋化因子的产生，具有较强的抗炎作用。
发明内容
采用基因重组技术，根据人sTNFR II和VIP相对应的cDNA基因序列，设计一对引物，以人外周血单核细胞总RNA为模板，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人sTNFR II基因，人工化学合成VIP编码序列及一个(GlyGlyGlyGlySer)2柔性连接肽编码序列。将sTNFR II基因序列和VIP序列连接成融合基因，插入到原核表达载体pET32α载体的多克隆位点。转化大肠杆菌，IPTG诱导表达VIP-sTNFR II融合蛋白。VIP-sTNFR II融合蛋白经分离纯化后，可制成针剂、粉剂、滴剂等各种药剂，采用静脉滴注、静脉注射、肌注或局部注射等方式，用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)、哮喘等自身免疫疾病和胸膜炎、脑膜炎等炎症疾病。本发明技术主要包括以下技术方法1.人sTNFR II基因序列的扩增和VIP基因序列的合成方法，VIP-sTNFR II融合基因连接方法；2.VIP-sTNFR II融合基因在原核或真核细胞诱导表达方法；3.VIP-sTNFR II融合蛋白的提取和纯化方法；4.VIP-sTNFR II融合蛋白在疾病治疗方面的应用方法。
实现方式本发明技术根据sTNFR II可竞争抑制TNF-a引起的炎症反应和VIP可抑制单核、巨噬细胞活化，抑制炎性因子的合成和分泌的分子机制，将二种抗炎分子有机地结合起来，形成融合蛋白，可以从多个层面和多种机制来抑制炎症反应，缓解炎症症状。比单独采用重组的sTNFR II或VIP来治疗类风湿性关节炎的效果更好。此发明技术可通过以下具体的步骤实现1.RT-PCR扩增编码人TNFR II胞外段(123～825aa)cDNA基因序列用Ficoll分离液从人外周血中获得单个核细胞，Trizol试剂盒提取单核细胞总RNA，以单核细胞总RNA为模板，以P1(5′-CAGGATCCGTCGGACTGGAGCTCT-3′)和P2(5′-CCCAA GCTTCAATCAGTCCAACTGGAAG-3′)为引物，RT-PCR法扩增TNFRII胞外段cDNA基因。
2.根据VIP编码序列，人工化学合成VIP cDNA基因和(GlyGlyGlyGlySer)2柔性连接肽编码序列，并使连接肽序列位于VIP cDNA基因3′端。
3.VIP-sTNFR II融合基因重组表达质粒载体的构建及鉴定回收的TNFR II胞外段基因扩增片段和VIP及连接肽编码序列先后用BamH I和Hind III酶切后，定向克隆于原核表达载体pET32a(+)中，并使VIP序列与sTNFR II基因序列连接成融合基因，构建成重组表达载体pET-VIP-sTNFR II。转化大肠埃希菌DH5α和BL21(DE3)，筛选阳性克隆。用限制性内切酶图谱分析和DNA测序对重组体进行鉴定。
4.重组蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达将筛选出的阳性重组子菌落扩增培养，至细菌增殖至OD600时，加入IPTG至终浓度为1mg/ml，37℃诱导VIP-sTNFR II融合蛋白表达4小时。
5.VIP-sTNFR II融合蛋白的抽提4℃4500转每分钟(rpm)离心收集细菌，弃上清，加10ml超声缓冲液重悬细菌，冰上超声破菌(20Hz持续20s，重复10次)，4℃10000rpm离心15min，沉淀物即为VIP-sTNFR II融合蛋白表达形成的包涵体。用含2mol/L尿素的TE缓冲液(50mM Tris，1mMEDTA，PH 8.0)15ml洗涤包涵体，离心沉淀，弃上清液。加15ml Buffer A(8mol/L尿素，50mmol/L磷酸缓冲液，PH 7.2)，反复振荡，4℃过夜溶解包涵体。4℃10000rpm离心15min，取上清获得变性VIP-sTNFR II融合蛋白。
6.VIP-sTNFR II融合蛋白疏水层析纯化用疏水层析纯化变性VIP-sTNFR II融合蛋白，使其得到部分复性。采用Phenyl-Sepharose FF为疏水层析介质，磷酸缓冲液为流动相。缓冲液A为50mmol/L磷酸缓冲液，PH 7.2；缓冲液B为含3.0mmol/L NaCl的50mmol/L磷酸缓冲液。在变性VIP-sTNFR II融合蛋白溶液钟加入饱和NaCl，直到溶液的电导率与缓冲液B相同。疏水层析柱先用缓冲液B平衡，再加入变性VIP-sTNFR II融合蛋白溶液，然后用33％-100％的缓冲液B与缓冲液A的梯度稀释液线性洗脱，逐管收集洗脱液，并在280nm处测定各段蛋白浓度。
7.VIP-sTNFR II融合蛋白进一步离子交换层析纯化合并浓度较高的蛋白溶液，对含30％的聚乙二醇20000(PEG20000)的TBS(30mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，PH 8.6)透析浓缩。浓缩蛋白液上样到Source 30Q阴离子交换层析柱，用PH 8.6-5.0的梯度TBS液线性洗脱，收集蛋白峰。获得纯度超过96％的VIP-sTNFRII融合蛋白。对含30％的聚乙二醇20000(PEG20000)的TBS(30mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，PH 7.4)浓缩目的蛋白，供免疫性质及生物活性鉴定。
8.VIP-sTNFR II融合蛋白免疫鉴定Western blot鉴定2.0μg纯化蛋白经12％SDS-PAGE电泳分离，切下凝胶电转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭过夜，以兔抗人TNFR II多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG为二抗，用化学发光法显示蛋白条带。
9.检测VIP-sTNFR II融合蛋白对TNF-α生物学活性的抑制作用(MTT法)以小鼠成纤维细胞L929胞为靶细胞，接种到96孔板内培养，每孔1×105细胞。分别在生长有细胞的孔内加入梯度稀释的标准TNF-α和梯度稀释的VIP-sTNFR II融合蛋白，并设L929细胞阴性对照组(只加入L929细胞，未加入VIP-sTNFR II融合蛋白及TNF-α)及空白对照组(未加入L929细胞、sTNFR II及sTNF2α)，每组设3个复孔。37℃5％CO2培养12～14h，加入10μl/孔MTT(5mg/ml)，继续培养4h。弃上清，每孔加入二甲亚砜(DMSO)100μl，在570nm波长下测定吸光度OD值。计算细胞死亡率细胞死亡率(％)＝(阴性对照组OD值-实验组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100％。计算出VIP-sTNFR II融合蛋白抑制TNF-α标准品细胞毒作用的效率。
10.检测VIP-sTNFR II融合蛋白中VIP的生物学活性采用竞争抑制脂多糖(LSP)诱导的细胞凋亡实验检测VIP-sTNFR II融合蛋白的生物活性。LSP可诱导细胞产生炎性因子，包括TNF，从而诱导细胞凋亡。细胞培养与接种同上。分别在生长有细胞的孔内加入梯度稀释的标准LSP，然后分别加入梯度稀释的VIP-sTNFR II融合蛋白或VIP单抗。以加有LSP的细胞为阴性对照，以未加任何药剂处理的细胞为空白对照。37℃5％CO2培养12～14h，MTT法测定细胞的存活率。计算VIP-sTNFR II融合蛋白抑制LSP诱导的细胞凋亡作用，并与抗VIP单抗的抑制效果进行比较。
11.纯化制备的VIP-sTNFR II融合蛋白可制成粉针剂、滴剂、喷雾剂等各种药剂，可采用局部注射、静脉注射、鼻腔、口腔喷雾、雾化吸入等多种用药方式，用于类风湿性关节炎、哮喘等许多自身免疫疾病及胸膜炎、脑膜炎等炎症疾病的治疗。推荐静脉注射的剂量为1-10mg每个成人每天；局部注射的剂量为1-2mg每个局部每天；喷雾吸入的剂量为5-10mg每个成人每天。
上述步骤3构建VIP-sTNFR II融合基因及表达质粒载体方法中，VIP序列放在sTNFR II序列的氨基端(N-端)和羧基端(C-端)所表达产生的融合蛋白都可能具有生物学活性，也都可以制备成药剂用于类风湿性关节炎等疾病的治疗。
上述方法构建的VIP-sTNFR II融合基因也可采用真核细胞表达系统表达VIP-sTNFR II融合蛋白，表达、纯化的融合蛋白生物活性甚至更高，也可获得预期的治疗效果。
上述步骤5、6、7中，VIP-sTNFR II融合蛋白的纯化采用其他的蛋白液相层析纯化方法、亲和层析纯化方法等也都可以获得预期纯度和生物活性的目的融合蛋白，可制备成药剂用于类风湿性关节炎等疾病的治疗。
权利要求
1.本发明技术涉及一种抑制肿瘤坏死因子的抗炎融合蛋白的制备及其应用技术。其主要特征是采用基因工程技术构建可溶性TNF-α受体2(sTNFR II)与血管活性肠肽(VIP)的融合基因，在原核细胞中诱导表达VIP-sTNFR II融合蛋白，疏水层析结合离子交换层析纯化目的融合蛋白，制备成针剂、滴剂和喷雾剂等药剂，用于类风湿性关节炎等疾病的治疗。
2.权利要求1所述的发明技术，其特征是VIP-sTNFR II融合蛋白中的VIP序列可位于sTNFR II的氨基端，也可位于sTNFR II的羧基端，具有相似的功能作用。
3.权利要求1所述的发明技术，其特征是VIP-sTNFR II融合蛋白可采用原核细胞表达，也可采用真核细胞表达相同表达，所表达纯化的融合蛋白具有生物学活性和药效作用。
4.权利要求1所述的发明技术，其特征是VIP-sTNFR II融合蛋白可制成针剂、粉剂、滴剂等各种药剂，采用静脉注射、肌注、局部注射或喷雾吸入等多种方式，用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、哮喘等各种自身免疫疾病和胸膜炎、脑膜炎等各种炎症疾病。
全文摘要
本发明技术介绍了一种抑制肿瘤坏死因子的抗炎融合蛋白的制备及其应用技术。其主要特征是采用基因工程技术扩增人可溶性TNF－α受体2(sTNFR II)基因，并使sTNFR II基因与人工合成的血管活性肠肽(VIP)编码序列连接成融合基因，采用原核细胞表达系统诱导表达VIP－sTNFR II融合蛋白，疏水层析结合离子交换层析纯化目的融合蛋白，制备成针剂、滴剂和喷雾剂等药剂，用于类风湿性关节炎等自身免疫疾病和胸膜炎、脑膜炎等炎症疾病的治疗。
文档编号A61K9/12GK101036782SQ20061006722
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者王虹 申请人:广州蓝星生物科技开发有限公司