来自啤酒花的单萜糖基转移酶及其利用方法
【专利摘要】本发明的目的在于，提供来自啤酒花的单萜糖基转移酶及使用该酶的单萜糖苷的制造方法。本发明提供来自啤酒花的单萜糖基转移酶及使用该酶的单萜糖苷的制造方法。本发明还提供转导来自啤酒花的单萜糖基转移酶基因的转化体及该转化体的制备方法。
【专利说明】来自啤酒花的单萜糖基转移酶及其利用方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及具有将单萜进行糖基化的活性的蛋白质及编码该蛋白质的多核苷酸、 利用该蛋白质的单萜糖苷的制造方法、高表达单萜糖基转移酶的转化体以及根据所述方法 制备的单萜的糖苷及其利用。此外，本发明还涉及抑制具有将单萜化合物进行糖基化的活 性的蛋白质的表达的植物及其利用。 【背景技术】
[0002] 类萜、特别是单萜（C10)、倍半萜（C15)等分子量较小的类萜类是植物的主要香气 成分，不仅应用于食品、酒类的香味，还广泛应用于直至化妆品、香水的工业产品中。已知以 芳樟醇为代表的单萜虽在植物细胞内合成，但一部分作为糖苷积累，例如已报道的有十字 花科拟南芥（Arabidopsis thaliana)的轻化芳樟醇（hydroxide Linalool)的糖苷（非专 利文献1)。还已知不仅在模式植物中,在作为产业上重要的作物的大麻科啤酒花（Humulus lupulus)(非专利文献2)、山茶科茶树（Camellia sinensis)(非专利文献3-6)、姜科姜 (Zingiber officinale)(非专利文献7)中，也积累有单廠糖苷。而且，从在植物界中的广泛 报道来看（非专利文献8)，认为糖苷通常的形态是作为香气成分的前体。对于将作为香气 前体物质的萜糖苷的糖用酶或非酶方法切除，从而使香气成分挥发的人工控制，也从产业 应用的见解上予以了研究（非专利文献9)。
[0003] 但是，至今为止，虽然已从茶树中分离出切断单萜糖苷的糖的酶（β-樱草糖苷 酶（β-primeverosidase))(非专利文献10)，但对于在单廠上附加糖（进行糖基化）的 分子机制还不明了。虽报道了通过拟南芥的UDP-sugar依赖性糖基转移酶（UDP-sugar dependent glycosyltransferase :UGT)的全面性的活性筛选，一部分UGT酶在试管内与 单萜反应，但未示出生理性作用、其活性的意义（非专利文献11)。因芸香科甜橙（Citrus sinensis)中也积累了单萜糖苷，所以，虽进行了对于单萜的UGT筛选，但还未成功鉴定出 具有活性的UGT酶基因（非专利文献12)。
[0004] 大麻科啤酒花（Humulus lupulus)是啤酒的主要原料，主要产于德国、捷克所在的 欧洲、加拿大、美国所在的北美大陆。啤酒的香气中，作为来源于啤酒花的香气成分，可列举 以芳樟醇为代表的单萜类。啤酒花的球花表皮中，存在用于贮存香气成分而特殊分化的被 称为蛇麻素的腺毛。认为很多香气成分在蛇麻素中积累。另一方面，虽已报道了啤酒花、啤 酒中积累有作为香气成分前体的芳樟醇、香叶醇的糖苷等萜类的糖苷，但对其生成酶还不 清楚（非专利文献2、10及13)。
[0005] 专利文献1 :国际公开公报W097/11184
[0006] 非专利文献 1 :Aharoni et al (2003)Plant Celll5, 2866-2884
[0007] 非专利文献2 :Kollmannsberger et al (2〇〇6)Mschr. Brauwissenschaft59, 83_89
[0008] 非专利文献 3 :Guo et al (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1532-1534
[0009] 非专利文献 4 :Nishikitani et al (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 929-931
[0010] 非专利文献 5 :Moon et al (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 1815-1819
[0011] 非专利文献 6 :Ma et al (2001) Phytochemisty56, 819-825
[0012] 非专利文献 7 :Sekiwa et al (1999) Biosci. Biotech. Biochem. 63, 384-389
[0013] 非专利文献 8 :Winterhalter and Skouroumounis(1997)Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 55, 73-105
[0014] 非专利文献 9 :Herman (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 5836-5863
[0015] 非专利文献 10 :Mizutani et al (2002) Plant Physiol. 130, 2164-2176
[0016] 非专利文献 11 :Caputi et al (2008) Chem. Eur. J. 14, 6656-6662
[0017] 非专利文献 l2 :Fan et al(2〇10) Genome53, 816-823
[0018] 非专利文献 13 :Nedjma, M. , et al (2006) Congress Proceedings of European Brewery Convention71, 1-13
【发明内容】
[0019] 本
【发明者】进行了深入研究，结果成功地鉴定了啤酒花中催化单萜的糖基化反应的 酶及编码该酶的基因序列。本发明基于上述见解。
[0020] 即本发明如下。
[0021] [1] -种蛋白质，其选自以下（a)?（c)中的任一项，
[0022] (a)蛋白质，其由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列组成；
[0023] (b)蛋白质，其由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列中1?95个氨基酸发生缺失、 取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有将单萜化合物进行糖基化的活性；
[0024] (c)蛋白质，其具有相对于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序列 同一性的氨基酸序列，且具有将单萜化合物进行糖基化的活性。
[0025] [2]根据[1]中所述的蛋白质，其中，所述单萜化合物为香叶醇或芳樟醇。
[0026] [3] -种多核苷酸，其选自以下（a)?（e)，
[0027] (a)多核苷酸，其含有SEQ ID NO: 1、3或5的碱基序列；
[0028] (b)多核苷酸，其编码由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0029] (c)多核苷酸，其编码由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列中1?95个的氨基酸 发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，且所述蛋白质具有将单萜化 合物进行糖基化的活性；
[0030] (d)多核苷酸，其编码相对于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序 列同一性的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有将单萜化合物进行糖基化的活性；
[0031] (e)多核苷酸，其为与由SEQ ID N0:1、3或5的碱基序列的互补碱基序列组成的多 核苷酸在高严格条件下杂交的多核苷酸，且编码具有将单萜化合物进行糖基化的活性的蛋 白质。
[0032] [4] 一种非人转化体，其转导了 [3]中所述的多核苷酸。
[0033] [5]根据[4]中所述的转化体，其中，所述多核苷酸为插入至表达载体的多核苷 酸。
[0034] [6]根据[4]中所述的转化体，其为植物体。
[0035] [7] -种提取物，其为[4]中所述的转化体的提取物。
[0036] [8] -种食品、香料、医药品或工业原料，其含有[7]中所述的提取物。
[0037] [9] -种具有对单萜化合物进行糖基化的活性的蛋白质的制造方法，其包括培养
[4]中所述的非人转化体。
[0038] [10] -种单萜糖苷的制造方法，其包括：包含使[1]中所述的蛋白质与UDP-糖、 单萜化合物反应而对所述单萜化合物进行糖基化的工序。
[0039] [11]根据[10]中所述的方法，其中，所述UDP-糖为UDP-葡萄糖。
[0040] [12]根据[10]中所述的方法，其中，所述单萜化合物为香叶醇或芳樟醇。
[0041] 通过利用本发明的蛋白质及编码该蛋白质的多核苷酸，可高效制造萜化合物的糖 苷。此外，因本发明的转化体中萜化合物的糖苷含量高，所以，可从这些转化体中高效提取、 纯化萜化合物的糖苷。 【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1 :表示啤酒花H1UGT的重组蛋白质表达的结果（SDS-PAGE)。
[0043] 图2 :表示啤酒花H1UGT重组蛋白质的香叶醇糖基化活性。
[0044] 图3 :表示啤酒花H1UGT的重组蛋白质的芳樟醇糖基化活性。 【具体实施方式】
[0045] 以下，详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，其目的不是将 本发明仅限于该实施方式。本发明只要不脱离其主要内容，可以各种方式实施。
[0046] 另外，本说明书中引用的全部文献及公开公报、专利公报及其他的专利文献作为 参照编入本说明书中。此外，本说明书包含作为本申请优先权主张的基础的2012年2月6 日申请的日本国专利申请（日本特愿2012-022982号）的说明书及附图中记载的内容。
[0047] 以下，详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，其目的不是将 本发明仅限于该实施方式。本发明只要不脱离其主要内容，可以各种方式实施。
[〇〇48] 本
【发明者】首次阐明了负责啤酒花单萜化合物的糖基化反应的酶蛋白质为 H1UGT119、H1UGT127、H1UGT279 及 H1UGT251。
[0049] H1UGT119的CDS序列及推定氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 1及2。H1UGT127的 ⑶S序列及推定氨基酸序列分别为SEQIDN0:3及4。而且，H1UGT279 的⑶S序列及推定 氨基酸序列分别为SEQ ID N0:5及6。此外，H1UGT251的⑶S序列及推定氨基酸序列分别 为SEQ ID N0:7及8。这些多核苷酸及酶可根据后述的实施例中记载的方法、公知的基因工 程的方法、公知的合成方法等获得。
[0050] 1.来自啤酒花的单萜糖基转移酶
[0051] 本发明提供选自以下（a)?（c)中任一项所述的蛋白质（以下称为"本发明的蛋 白质"）。
[0052] (a)蛋白质，其由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列组成；
[0053] (b)蛋白质，其由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列中1?95个氨基酸发
[0054] 生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有将单萜化合物进行糖基 化的活性；
[0055] (c)蛋白质，其具有与SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列有80%以上序列同一 性的氨基酸序列，且具有将单萜化合物进行糖基化的活性。
[0056] 上述（a)?（c)中所述的蛋白质中，"SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列"在某 些实施方式中为"SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列"、"SEQ ID N0:2或4的氨基酸序列"、 "SEQ ID N0:2或6的氨基酸序列"或"SEQ ID N0:4或6的氨基酸序列"。
[0057] 在其他实施方式中，上述（a)?（c)中所述的蛋白质中，"SEQ ID N0:2、4、6或8的 氨基酸序列"为"SEQ ID N0:8的氨基酸序列"。
[0058] 上述（b)或（c)中所述的蛋白质，代表性的为天然存在的SEQ ID N0:2、 4、6或8的多肽的突变体，但也包含使用例如"Sambrook&Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press2001，'、 "Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sonsl987_1997，'、 "Nuc. Acids. Res.，10, 6487(1982) "、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982) "、 "Gene，34,315(1985)"、"Nuc.Acids.Res.，13,4431 (1985)，，、"Proc.Natl.Acad.Sci. USA，82, 488 (1985) "等中记载的定点诱变法而人为获得的蛋白质。
[0059] 本说明书中，作为"由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列中1?95个氨基
[0060] 酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有将单萜化合物进行 糖基化的活性的蛋白质"，可列举由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列中，例如，1?95个、 1?90个、1?85个、1?80个、1?75个、1?70个、1?65个、1?60个、1?55个、1? 50个、1?49个、1?48个、1?47个、1?46个、1?45个、1?44个、1?43个、1?42 个、1?41个、1?40个、1?39个、1?38个、1?37个、1?36个、1?35个、1?34个、 1?33个、1?32个、1?31个、1?30个、1?29个、1?28个、1?27个、1?26个、1? 25个、1?24个、1?23个、1?22个、1?21个、1?20个、1?19个、1?18个、1?17 个、1?16个、1?15个、1?14个、1?13个、1?12个、1?11个、1?10个、1?9个 (1?多个）、1?8个、1?7个、1?6个、1?5个、1?4个、1?3个、1?2个或1个氛 基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有将单萜化合物进行糖 基化的活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或附加的数量通常越小越优 选。
[0061] 此外，作为此种蛋白质，可列举具有与SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列有80% 以上、81 %以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、 89 %以上、90%以上、91 %以上、92%以上、93 %以上、94%以上、95%以上、96 %以上、97% 以上、98%以上、99%以上、99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以 上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上或99. 9%以上序列同一性的氨基酸序列，且具有 将单萜化合物进行糖基化的活性的蛋白质。上述序列同一性的数值通常越大越优选。
[〇〇62] 在此，"将单萜化合物进行糖基化的活性"是指在作为苷元的单萜化合物的羟基上 附加 UDP糖中所含有的糖（进行糖基化）的活性。附加糖的羟基无特别限定。
[〇〇63] 将单萜化合物进行糖基化的活性可通过用如下公知的方法进行分析而确认，在包 含1?500ng (优选为50?200ng，最优选为100ng)本发明的蛋白质、1?1000 μ Μ(优选为 100?700 μ Μ，最优选为500 μ M) UDP糖（例如UDP-葡萄糖）及1?500 μ Μ (优选为100? 500 μ Μ，最优选为250 μ Μ)单萜化合物（例如芳樟醇或香叶醇）的ρΗ6. 0?8. 0的中性区的 缓冲液（例如磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液）中，在20?40°C的温度下孵育后，纯化所述 单廠，将纯化的单廠进行LC-MS分析（液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry))等。
[0064] 糖基化反应通常在1分钟?12小时左右结束。
[〇〇65] 以下表示可相互取代的氨基酸残基的例子。同一组中所含有的氨基酸残基可相互 取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2 -氨基丁酸、蛋氨酸、 邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天 冬氨酸、异谷氨酸、2 -氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨 酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4 一二氨基丁酸、2,3 -二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3 -羟基脯氨酸、 4 一羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。
[〇〇66] 本发明的蛋白质可通过使编码该蛋白质的多核苷酸（参照后述的"本发明的 多核苷酸"）在适合的宿主细胞内表达而得到，也可通过Fmoc法（9-芴甲氧羰基法）、 tBoc法（叔丁氧羰基法）等的化学合成法制造。此外，还可利用Advanced Automation Peptide Protein Technologies 公司制、拍金埃尔默（Perkin Elmer)公司制、Protein Technologies 公司制、PerSeptive 公司制、Applied Biosystems 公司制、SHIMADZU 公司制 等的肽合成仪进行化学合成。
[0067] 本发明中，"单萜化合物"是指以以下的异戊二烯为结构单元的烃，除了由植物、昆 虫及菌类等制作出的生物体物质以外，也包含化学合成的化合物。
[0068]
【权利要求】
1. 一种蛋白质，其选自以下（a)?（c)中的任一项， (a) 蛋白质，其由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列组成； (b) 蛋白质，其由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列中1?95个氨基酸发生缺失、取 代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有将单萜化合物进行糖基化的活性； (c) 蛋白质，其具有相对于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序列同一 性的氨基酸序列，且具有将单萜化合物进行糖基化的活性。
2. 根据权利要求1中所述的蛋白质，其中，所述单萜化合物为香叶醇或芳樟醇。
3. -种多核苷酸，其选自以下（a)?（e)， (a) 多核苷酸，其含有SEQ ID NO: 1、3或5的碱基序列； (b) 多核苷酸，其编码由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列组成的蛋白质； (c) 多核苷酸，其编码由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列中1?95个的氨基酸发生 缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，且所述蛋白质具有将单萜化合物 进行糖基化的活性； (d) 多核苷酸，其编码相对于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序列同 一性的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有将单萜化合物进行糖基化的活性； (e) 多核苷酸，其为与由SEQ ID NO: 1、3或5的碱基序列的互补碱基序列组成的多核 苷酸在高严格条件下杂交的多核苷酸，且编码具有将单萜化合物进行糖基化的活性的蛋白 质。
4. 一种非人转化体，其转导了权利要求3中所述的多核苷酸。
5. 根据权利要求4中所述的转化体，其中，所述多核苷酸为插入至表达载体的多核苷 酸。
6. 根据权利要求4中所述的转化体，其为植物体。
7. -种提取物，其为权利要求4中所述的转化体的提取物。
8. -种食品、香料、医药品或工业原料，其含有权利要求7中所述的提取物。
9. 一种具有对单萜化合物进行糖基化的活性的蛋白质的制造方法，其包括培养权利要 求4中所述的非人转化体。
10. -种单萜糖苷的制造方法，其包括：包含使权利要求1中所述的蛋白质与UDP-糖、 单萜化合物反应而对所述单萜化合物进行糖基化的工序。
11. 根据权利要求10中所述的方法，其中，所述Μ)Ρ-糖为UDP-葡萄糖。
12. 根据权利要求10中所述的方法，其中，所述单萜化合物为香叶醇或芳樟醇。
【文档编号】A61K8/97GK104093837SQ201380008332
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2012年2月6日
【发明者】小埜荣一郎, 鹤冈伸夫 申请人:三得利控股株式会社