量肝毒性标记物(AST和ALT)。[0081 ] 2-1:纤维化(Masson 三色(MT))染色
[0082]肝细胞的纤维化进展时，合成胶原以填充损伤的位点，而MT染料与胶原反应以显色标记纤维化部分的蓝色。通过MT染色分析获得的组织样品以检查纤维化的程度。
[0083]具体地，以下列方式实施MT染色。
[0084]将用石錯固定的组织切片脱錯，且随后用Bouin氏溶液固定并用Weigert氏铁苏木精Biebrich猩红酸性品红苯胺蓝溶液或2%亮绿染色，之后进行观察。纤维组织显示为蓝色，且细胞质、肌肉和角蛋白显示为红色，且细胞核显示为深褐色。
[0085]结果，如图2a和2b所示，用TAA处理以诱导肝纤维化的组(TAA+/E-MSC-)与未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)相比显示了蓝色区域的增加，且用间充质干细胞治疗的组(TAA+/E-MSC+)与TAA+/E-MSC-组相比显示蓝色区域的显著减少。
[0086]此外，如图2a所见，已观察到在用TAA处理以诱导肝纤维化的组织中，由于肝纤维化形成了团块和表面异常，且该现象通过间充质干细胞的注射有所改善。
[0087 ] 2~2.Picro-Sirius 红染色
[0088]当干细胞的纤维化进展时，合成胶原以填充损伤位点，且MT染料与胶原反应以显色标记纤维化部分的蓝色。获得的组织样品通过Picro-Sirius红染色分析以检查纤维化的程度。
[0089]Picro-Sirius红染色是标记待检查的纤维化的方法，如MT染色。使用这两种染色方法一式两份以检查纤维化抑制的程度。
[°09°] 作为结果，以下列方式实施Picro-sirius红染色。
[0091]将石蜡组织切片脱蜡，且随后用Picro-sirius红染色I小时且用水洗涤，随后干燥并固定。
[0092]作为结果，如图3所见，用TAA处理以诱导肝纤维化的组(TAA+/E-MSC-)与未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)相比显示红色区域的增加，且用间充质干细胞治疗的组(TAA+/E-MSC+ )与TAA+/E-MSC-组相比显示了红色区域的显著减少。
[0093]2-3: HLA-abc IHC染色
[0094]为检查实施例2-1和2-2中确认的肝纤维化缓解效果是否归因于注射入动物的人间充质干细胞，使用人细胞特异性表达因子HLA-abc实施了免疫组化，由此确定残留在组织样品中的间充质干细胞是否显示肝纤维化缓解效果。
[0095]具体地，使用人特异性表达抗原HLA-abc以下列方式实施了IHC染色。
[0096]抗原抗体反应后，用生物素第二抗体处理组织样品。用链霉亲和素-HRP处理后，将组织样品用底物色原体溶液染色以显褐色。具体地，使用Vectorlab R.T.U试剂盒的IHC试剂盒(Vector,目录#PK-7800)实施IHC染色，且使用从Abcam购买的HLA-abc。此外，将包括于试剂盒中的泛特异性通用二抗用作二抗，并将DAB(Vectorlab NOVA红DAB底物试剂盒目录#SK-4800)用于显色。
[0097]作为结果，如图4所见，在正常组和用TAA处理以诱导肝纤维化的组(仅TAA)的肝组织中，未观察到褐色反应，但在TAA处理以诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的组(TAA+E-MSC)的组织中观察到褐色反应，指示发生了抗原抗体反应。组(TAA+E-MSC)的组织的放大观察显示治疗的间充质干细胞的移入(图5)。
[0098]2-4:肝毒性参数的测量(AST和ALT)
[0099]为进一步确认由如实施例2-1至2-3中所确认的肝纤维化的进展引起的肝毒性减轻的效果，对在未处理的正常组(TAA-/E-MSC-)、用TAA处理以诱导肝纤维化的测试组(TAA+/E-MSC-)、和通过TAA处理诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的测试组(TAA+/E-MSC+)中测量作为肝毒性参数的AST(天冬氨酸氨基转移酶)和ALT(丙氨酸氨基转移酶)。氨基转移酶是存在于任何组织中的一种酶，且细胞内氨基转移酶活性高于血清氨基转移酶活性。因此，如果组织损伤，则酶氨基转移酶释放入血液使得氨基转移酶活性增加。然而，由于该酶具有高分子量(约100，000Da)，酶从损伤细胞迀移入血液受到阻碍。因此，如果肝脏、心肌、肌肉和血细胞(其中该酶可容易释放入血液)收到损伤，血清氨基转移酶活性增加，但如果其他器官损伤，则血清氨基转移酶活性基本上不增加。
[0100]使用已知方法测量AST和ALT。具体地，使用其中酶活性基于显色剂的变化而数字量化的方法，所述显色剂添加至分离自收集的血液的血清中AST和ALT底物的降解过程中发生的反应。
[0101]作为结果，如图6中可见，在第21天，用TAA处理以诱导肝纤维化的组中AST和ALT显著增加，而诱导肝纤维化后用间充质干细胞注射的组中AST和ALT显著减少。
[0102]这表明本发明的间充质干细胞对肝纤维化的预防和治疗显示优异的效果。
[0103]实施例3:人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞和骨髓衍生的间充质干细胞之间效果的比较
[0104]比较性评估实施例1中产生的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞和骨髓衍生的间充质干细胞之间对肝纤维化的缓解效果。
[0105]除使用骨髓衍生的间充质干细胞来取代人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞外，以实施例2-1中所述的相同的方式实施MT染色。
[0106]作为结果，如图7中可见，通过TAA处理诱导肝纤维化后用人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞注射的测试组(TAA+E-MSC)与用骨髓衍生的间充质干细胞注射的测试组(TAA+BM-MSC)相比显示减少的蓝色染色区域。这表明本发明的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞对肝纤维化的缓解具有更佳效果。
[0107]工业实用性
[0108]根据本发明，本发明的间充质干细胞与常规的骨髓衍生的间充质干细胞相比对预防肝纤维化具有优异的效果，且因此其可能提供细胞治疗产品或功能性保健食品，其能够预防和治疗肝纤维化或肝硬化。
[0109]尽管已提及具体特征对本发明进行详细描述，但对本领域的技术人员显而易见的是此描述仅用于优选的实施方案而非限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围会通过所附权利要求和其等同物来进行限定。
【主权项】
1.一种用于预防和/或治疗肝纤维化或肝硬化的组合物，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。2.—种用于缓解和/或预防肝纤维化和肝硬化的功能性保健食品，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。3.一种用于治疗肝纤维化或肝硬化的方法，其包括将源自人胚胎干细胞的间充质干细胞施用至受试者的步骤。
【专利摘要】本发明涉及用于预防和/或治疗肝纤维化或肝硬化的组合物，其包含源自人胚胎干细胞的间充质干细胞作为活性成分。在本发明中，已确认源自人胚胎干细胞的间充质干细胞具有抗肝纤维化的预防性作用。因此，可将源自人胚胎干细胞的间充质干细胞有效用作用于保护肝和预防及治疗肝纤维化或肝硬化的组合物或功能性保健食品中的活性成分。
【IPC分类】A61P1/16, A61K35/28, A61K35/12
【公开号】CN105555282
【申请号】CN201480049710
【发明人】李恩珠, 金孝秀
【申请人】首尔国立大学医院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年7月4日
【公告号】EP3020405A1, US20160151420, WO2015005614A1