专利名称：一种对樱della蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业野生植物基因资源保护利用技术领域，具体涉及对樱DELLA蛋白 PpGAI及其编码基因与应用。
背景技术：
赤霉素(Gibberellins，GAs)作为一类较大的四环双萜类植物激素，在植物的生长发育过程中起着极其重要的作用，并作用于植物整个生命周期，例如种子萌发，茎的伸长，叶片延展，花与果实的发育(Fleet C Μ, SUN T P. A DELLAcate balance :the role of gibberellin in plant morphogenesis. Current Opinion Plant Biology,2005,8 77 85)。目前，GAs的合成与代谢途径已研究得较为清楚，而且代谢关键酶和相应的基因也相继得以克隆，因而现在研究重点集中于对赤霉素信号转导途径的分子机制的探讨(Harberd N P，Belfield E，Yasumura Y. The angiosperm gibberellin-GID I-DELLA growth regulatory mechanism :how an“inhibitor of an inhibitor"enables flexible response to fluctuating environments. Plant Cell，2009，21 :1328 1339)。在已发现的植物GA信号传递组分中，有一类蛋白的N端极其保守，具有共同的DELLA结构域，称之为DELLA家族蛋白，其作为一个关键调控因子，在GA信号传导过程中起负调节作用(Peng J，Carol P，Richards D，et al. Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses. Genes & Development，1997，11 3194 3205)。在没有GA的情况下，DELLA蛋白阻遏植物的生长发育过程；当有GA信号时，DELLA蛋白通过泛素化途径降解，从而解除其阻遏作用。如果GA的信号转导途径受阻，将使植物产生矮化等异常的生理现象(Sun T P. Gibberellin-GIDl-DELLA =A Pivotal Regulatory Module for Plant Growth and Development. Plant Physiology,2010,154 567 570)。20世纪90年代，有研究发现“绿色革命”中导致小麦产生矮化性状的基因 rhtl即为DELLA蛋白的编码基因。该基因突变后导致小麦无法正常响应赤霉素信号，因而形成一个新的矮化品种。由于其早结实、抗倒伏、耐风沙，从而极大地促进了世界粮食作物的增产(Peng J，Richards D Ε, Hartley N M，et al. ‘Green revolution' genes encode mutant gibberellin response modulators· Nature，1999，400 :256 261)。目前，已从拟南芥、水稻、葡萄等物种中克隆得到DELLA蛋白基因，其功能也得以进一步研究。lister等将苹果DELLA蛋白基因MdRGLh转入拟南芥中进行过表达，转基因植株表现出叶片紧缩、茎杆变短、花期延长、对外源GA3敏感度降低等现象，类似于拟南芥gai矮化突变体的表型特征(Foster Τ,Kirk C,Jones W Τ,et al. Characterization of the DELLA subfamily in apple (Malus Xdomestica Borkh.). Tree Genet Genomes，2007，3 :187 197)。在酿酒葡萄11突变体中，DELLA区域突变成了 DELHA，使葡萄蔓藤上本应生长蔓须的部位形成花序， ^^IWMit (Paul K B, Mark R Τ. Association of dwarfism and floral induction with a grape 'green revolution’ mutation. Nature, 2002,416 :847 850)。以上石if究结果暗示了 DELLA蛋白在不同物种之间的功能较为保守，通过干扰GA的信号转导过程可达
3到使植株矮化的目的。甜樱桃(Primus avium L.)果实色泽艳丽，晶莹美观，味美多汁，营养丰富，深受消费者喜爱，被誉为果中珍品，是经济效益最好的栽培果树之一；而甜樱桃的矮密栽培更具有提早结果、方便采摘、提高土地和光能利用效率等优点，成为樱桃产业高效发展的一种良好的栽培模式。传统的密植方式多采用矮化砧木来控制树体大小和高度，然而目前国内成功选育出的甜樱桃矮化砧木品种屈指可数，且应用范围小，生产上大多利用从国外引进的砧木资源，如Gisela系列、Colt。但由于地理环境的差异，这些砧木在我国的实际生产应用上尚存在一定的局限性，例如Gisela系列砧木对土壤肥力要求高，且嫁接接穗品种后普通存在砧木“小脚”现象，而Colt砧木的耐盐碱性较差，易感根癌病。中国樱桃‘对樱’(ft~UnUS pseudocerasus L.)是分布于北京地区的一个半野生小乔木，其抗逆性及抗病虫害能力强， 与甜樱桃品种的嫁接亲和力好，但将其作为甜樱桃的砧木品种，嫁接树生长健壮，树冠较高大，矮化效果不明显。鉴于此，如果通过基因工程的手段，将赤霉素信号转导负向调节因子 DELLA蛋白基因导入中国樱桃砧木品种‘对樱’，培育出性状优良并适于樱桃矮化密植的砧木新品种，将为甜樱桃矮化育种开辟新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对樱DELLA蛋白及其编码基因。本发明的目的还在于提供包含对樱DELLA蛋白编码基因的载体及其工程菌。本发明的目的还在于提供对樱DELLA蛋白编码基因的获得方法。本发明的目的还在于提供对樱DELLA蛋白编码基因及其表达的DELLA蛋白在果树矮化密植方面的用途。一种DELLA蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO=I所示。所述DELLA蛋白的编码基因来源于对樱(Prunus pseudocerasus L.)。包含权利要求1所述DELLA蛋白的编码基因的表达载体。包含权利要求3所述表达载体的工程菌。一种DELLA蛋白，所述DELLA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述 DELLA 蛋白来源于对樱(Prunus pseudocerasus L.)。一种DELLA蛋白的编码基因的获得方法，按照如下步骤进行(1) CTAB法提取对樱叶片总RNA，将其反转录为cDNA ；(2)根据权利要求1所述的DELLA蛋白的编码基因设计引物PpGAI-L和PpGAI-R， 以步骤(1)得到的cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增全长PpGAI基因；所述PpGAI-L的核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示；PpGAI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示。上述DELLA蛋白的编码基因，发明人将其命名为PpGAI，蛋白命名为PpGAI。上述任一 DELLA蛋白的编码基因或DELLA蛋白在果树矮化密植方面的用途。本发明的有益效果本发明第一次从樱桃中克隆得到赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白及其编码基因PpGAIJf PpGAI转化大肠杆菌BL21证明其具有生物活性，能够编码预期分子量大小的蛋白，将PpGAI基因转化野生型拟南芥，证明该基因编码的DELLA蛋白可导致拟南芥出现明显的矮化性状。从而为果树转基因工程提供了一个优良的矮化基因，并为樱桃矮化密植开辟一条新的途径。
图1为从对樱叶片中提取的总RNA电泳图。图2为通过简并引物LT、RT扩增樱桃DELLA蛋白基因的中间片断的电泳检测图；图中，M为DNA Marker II，1为PpGAI基因中间片断的PCR产物。图3为PpGAI基因的3 ‘末端PCR产物电泳检测图；图中，M 为 IOObp plus DNA Ladder, 1 为 PpGAI 基因的 3'末端 PCR 产物。图4为PpGAI基因的5 ‘末端PCR产物电泳检测图；图中，M 为 DNA Marker II，1 为 PpGAI 的 5 ‘末端 PCR 产物。图5为PpGAI基因全长电泳检测图；图中，M为500bp DNA Ladder, 1为PpGAI的开放阅读框全长。图6为利用MEGA软件进行的系统进化树分析。图7为BamH I和sal I双酶切重组质粒鉴定PpGAI基因阳性克隆电泳图；图中，M为DNAMarker III，1、2均为重组质粒的酶切结果。图8为PpGAI蛋白的考马斯亮蓝染色图；图中，M为蛋白Ladder (10_250kD)，1为未经诱导的转化子表达的总蛋白，2 6为分别诱导2、4、6、8、IOh转化子表达的总蛋白，7为未经诱导的pGEX-4T-l空载体表达的总蛋白，8 12为分别诱导2、4、6、8、10h pGEX_4T_l空载体表达的总蛋白。图9为Nco I和Bgl II双酶切重组质粒鉴定PpGAI基因阳性克隆电泳图；图中，M为DNA Marker III，1、2均为重组质粒的酶切结果。图10为PCR检测转PpGAI基因阳性拟南芥植株；图中，M为Marker V，1 9为转基因拟南芥苗，10为野生型拟南芥对照。图11为野生型和转PpGAI基因拟南芥植株表型比较；图左侧为野生型拟南芥植株，图右为PpGAI基因拟南芥植株。图12为野生型和转PpGAI基因拟南芥植株叶片比较；图上一行为野生型拟南芥植株叶片，图下一行为转PpGAI基因拟南芥植株叶片。
具体实施例方式下面以附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例试验所用材料为中国樱桃‘对樱，(Primus pseudocerasus L.)，采自北京市海淀区植物组织培养技术实验室。2009年6月下旬采取嫩叶后，置于冰盒中立即带回实验室，液氮速冻后，存于-80°C冰箱备用。原核表达载体PGEX-4T-1、植物表达载体pCAMBIA1301、大肠杆菌Dffia感受态细胞、根癌农杆菌EHA105菌株、大肠杆菌BL21感受态细胞购自北京天根生化公司。Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture^RNase Inhibitor^RNase-Free DNase I、限制性内切酶BamH I、sal I,Nco I 和 Bgl II、T4 DNA连接酶，购自 TAKARA 公司。Clotech Smarter RACE cDNA Amplication Kit 购自 Clotech 公司，M-MLV 反转录酶购自 Promega 公司；DNA Marker购自中科瑞泰北京生物技术有限公司，蛋白Ladder 10-250KD购自中科瑞泰NEB 公司；氨苄青霉素、硫酸卡钠酶素、利福平购自北京新经科生物技术有限公司，潮霉素购自Sigma公司；离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京汇天东方科技有限公司，离心柱型质粒小量提取试剂盒购自北京博大泰恒生物技术有限公司，SDS-PAGE试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。实施例1、对樱DELLA蛋白PpGAI及其编码基因的获得一、PpGAI基因中间片断的获得以中国樱桃‘对樱’ (Prunus pseudocerasus L.)为试验材料(采自北京市海淀区植物组织培养技术实验室)，CTAB法提取其叶片总RNA。用30 μ 1超滤水(RNA free)溶解所提取的RNA沉淀。取1 2 μ 1溶解的RNA，加入1 μ 1 6 X电泳上样缓冲液后混勻，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA。在凝胶成像系统下观察，电泳结果如图1所示，从图中可以清晰地看到^S rRNA和18S rRNA两条带，且^S rRNA和18S rRNA含量之比大约为1 1-2 1， 无拖尾及弥散现象。紫外分光度测量0D26Q/0D28Q = 1. 95,OD260/OD230 = 2. 00，浓度为1131ng/ μ 1，说明RNA纯度较好，完整性好且浓度较高，达到后续实验要求。以上述提取得到的总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，通过简并引物LT、RT扩增樱桃DELLA蛋白基因的中间片断。引物序列如下
权利要求
1.一种DELLA蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求1所述一种DELLA蛋白的编码基因，其特征在于，所述DELLA蛋白的编码基因来源于对樱(Prunus pseudocerasus L.)。
3.包含权利要求1所述DELLA蛋白的编码基因的表达载体。
4.包含权利要求3所述表达载体的工程菌。
5.一种DELLA蛋白，其特征在于，所述DELLA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
6.根据权利要求1所述一种DELLA蛋白，其特征在于，所述DELLA蛋白来源于对樱 (Prunus pseudocerasus L.) 0
7.—种如权利要求1所述DELLA蛋白的编码基因的获得方法，其特征在于，按照如下步骤进行(1)CTAB法提取对樱叶片总RNA，将其反转录为cDNA；(2)根据权利要求1所述的DELLA蛋白的编码基因设计引物PpGAI-L和PpGAI-R，以步骤(1)得到的cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增全长PpGAI基因；所述PpGAI-L的核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示；PpGAI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示。
8.权利要求1、2、5、6所述任一DELLA蛋白的编码基因或DELLA蛋白在果树矮化密植方面的用途。
全文摘要
本发明公开了属于农业野生植物基因资源保护利用技术领域的一种对樱DELLA蛋白及其编码基因与应用。本发明第一次从樱桃中克隆得到赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白及其编码基因，将其命名为PpGAI，将PpGAI转化大肠杆菌BL21证明其具有生物活性，能够编码预期分子量大小的蛋白，将PpGAI基因转化野生型拟南芥，证明该基因编码的DELLA蛋白可导致拟南芥出现明显的矮化性状。本发明为果树转基因工程提供了一个优良的矮化基因，并为樱桃矮化密植开辟一条新的途径。
文档编号C07K14/415GK102277360SQ20111022436
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者李天红, 沈欣杰, 赵凯, 钟翡 申请人:中国农业大学