一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法与流程

文档序号:12097993阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括PCR反应液,酶混合液,阳性对照,阴性对照和内标;

所述PCR反应液包括:PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针;

所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列为TL-P::

5'-FAM-CGGCTTCGTCGCTCAGGCTGC-BHQ1-3';

所述用于靶多核苷酸检测的引物包括上游引物和下游引物,碱基对序列分别为:

上游引物TL-F:5'-ACCCGAACGCAGGCTATGG-3';

下游引物TL-R:5'-GAGCTGTCGTACTCGAAGTAGAAG-3';

所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。

2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体,所述内标的碱基对的序列为:

5’-ACCCGAACGCAGGCTATGGCAGTTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGGGCAATTCCTTTCTGGTCGACTACGTATCTCTTCTACTTCGAGTACGACAGCTC-3’。

3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针,所述检测内标的探针的碱基对序列为:

IC-P:5'-HEX-TTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGG-BHQ1-3'。

4.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液还包:ROX溶液。

5.根据权利要求1-4所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述酶混合液由1U/μl~5U/μl耐热DNA聚合酶和0.05U/μl~0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶组成。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述PCR缓冲液由浓度为200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为30mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积/体积为0.2%曲拉通溶液和体积/体积为10%甲酰胺溶液组成,其中,所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的pH为7.5。

7.根据权利要求1-4中任意一项述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述阳性对照是浓度为1.00~5.00E+05IU/ml的铜绿假单胞菌病毒的灭活血清。

8.根据权利要求1-4中任意一项所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述核酸释放剂包括:浓度为0.02~0.6mM/L的莎梵婷、浓度为60~220mM/L的氯化钾、浓度为0.02%~3%mM/L十二烷基磺酸钠和体积/体积为0.01%~2%的乙醇。

9.根据权利要求1-4中任意一项所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述阴性对照为不含有铜绿假单胞菌病毒、丙肝病毒、艾滋病毒以及梅毒的灭活阴性血清。

10.一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:

S101:向每个PCR反应管中均加入核酸释放剂4~20μl,并依次加入待测样本,阴性对照,阳性对照;

S102;向每个PCR反应管中均加入PCR混合液35~50μl,2000rpm离心30秒,取上清液,放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试,其中每个PCR反应管中加入PCR混合液为反应液35~45μl,酶混合液1~4μl和内标0.1~1μl。

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