连接酶构建到S2的通用受体载体 中，构建成pLVX-dMAN载体。
[0020] 所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法，其中，所述用于构建dMAN的引物的设 计方法如下：
[0021] S11、获取miRNA成熟序列，并转换成对应的DNA序列；
[0022] S12、在步骤S11所得的DNA序列，5'端第10、第11位之间插入"ATCT"碱基，形成 antisense-MBS序列；并将antisense-MBS序列反向互补形成sense-MBS序列；
[0023]S13、根据步骤S12所得序列，设计4条用于构建dMAN的引物：
[0024]引物 1 :5' -GTATTCTGTGACCAGAATACTTC-antisense-MBS-CTTGACTCTC-3' ；
[0025]引物 2 :5' -GAATATAGGAATCTATATTCGGC-senseMBS-CGGAACTTGA-3' ；
[0026]引物 3 :5' -ACCCGTCTCTCTTC-antisense-MBS-CTTGTATTCTGTGACCAGA-3' ；
[0027]引物4 :5' -GTGCGTCTCATGGC-sense MBS-CGGGAATATAGGAATCTAT-3'〇
[0028] 所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法，其中，miRNA成熟序列为mmu-miR-195、 mmu-miR-497 或mmu-miR-322〇
[0029] 所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法，其中，S3具体包括以下步骤：
[0030] 以H1-U6双启动子序列为模板，利用引物1和引物2序列进行dMAN第一轮扩增； 随后以第一轮扩增产物为模板，利用引物3和引物4进行dMAN第二轮扩增，获得dMAN表达 序列；
[0031] 将dMAN表达序列与通用受体载体混匀置于含有相应限制性内切酶、连接酶、ATP 及限制性内切酶反应缓冲溶液体系中，将反应体系置于循环仪中，限制性内切酶酶切反应 和连接酶连接反应，将dMAN表达序列连接到通用受体载体上，构建pLVX-dMAN载体；
[0032] 转化Stbl3感受态细胞，以氨苄青霉素进行筛选，次日挑选单克隆培养所提质粒 即为pLVX-dMAN载体。
[0033] 一种如上所述的miRNA抑制剂表达载体的应用，其中，将所述miRNA抑制剂表达载 体用于制备治疗因miRNA的异常表达而引起的疾病的药物。
[0034] 所述的miRNA抑制剂表达载体的应用，其中，将所述miRNA抑制剂表达载体包装成 慢病毒。
[0035] 有益效果：本发明提供一种microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建 方法和应用，在构建好的表达载体中含有2个dMAN的表达框架，可以同时转录相同或不相 同的两个MAN，载体利用率更高，病毒颗粒的使用量以及毒性更小。在构建方法上，本发明所 述构建dMAN的方法更加经济，只需要合成2对不超过60个碱基的引物，通过2次PCR及其 酶切和连接技术便可完成一个包含两个MAN结构miRNA抑制载体的一步克隆构建。由于使 用了多重PCR，不需要长片段基因的合成，使构建周期大大缩短至两天，是目前最快速构建 miRNA抑制剂的方法。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明microRNA抑制剂序列结构示意图，包括其转录后RNA形成的二级发 夹结构由通用直链互补序列、2个miRNA结合区序列及通用茎环序列3部分组成。
[0037] 图2为本发明实施例2中pLVX-dMAN-miR-195和pLVX-dMAN-miR-497瞬时转染抑 制293A细胞中miR-195和miR-497检测结果图。
[0038] 图3为本发明实施例3中pLVX-dMAN-miR-322和pLVX-dMAN-miR-497包装成慢病 毒后感染C2C12细胞筛选稳转细胞系，miR-322和miR-497检测结果图。
[0039] 图4为本发明实施例4中pLVX-dMAN-miR-1载体局部注射小鼠抑制活体组织中 miR-1检测结果图。
【具体实施方式】
[0040] 本发明提供一种microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应 用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应 当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0041] 本发明所提供的mi croRNA抑制剂，为双拷贝miRNA粘附分子（doub 1 e miRNA adhesion nucleotide, dMAN)，是基于miRNA海绵体原理进行设计的一类竞争性吸附的 miRNA抑制剂。
[0042] 所述双拷贝miRNA粘附分子由通用直链互补序列、2个miRNA结合区序列（MBS)及 通用茎环序列3部分组成，其序列结构示意图如图1所示。
[0043] 其中，所述通用直链互补序列为18个碱基对（bp);所述miRNA结合区序列与成熟 miRNA序列互补，并在与miRNA5'端第10、第11位互补的碱基之间引入4个不配对的碱基； 所述通用茎环序列其茎为8个碱基对，环为4个碱基。
[0044] 所述miRNA粘附分子（dMAN)由Hl、U6III型RNA聚合酶（PolIII)启动子驱动表 达；根据MAN相同或不同，两个启动子可同时转录出相同或不同的两个miRNA粘附分子。
[0045] 本发明所提供的microRNA抑制剂的优点在于，每个构建好的载体具有4个miRNA 互补序列，更多的miRNA结合序列意味着能更好的屏蔽miRNA与祀基因结合的可能性。 miRNA互补序列中人为插入4个不匹配碱基，这样可以降低Ag〇2介导的内源性核苷酸的切 害J，使得dMAN在机体内更加稳定，同时避免因Ag〇2切割后形成的小分子片段所引起的非特 异基因抑制。
[0046] 本发明中还提供一种用于表达所述microRNA抑制剂的miRNA抑制剂表达载体，包 括（1)背靠背连接的H1-U6双启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示；（2)通用受 体载体pLVX-dMAN，其核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示；（3)双拷贝miRNA粘附分子的DNA序 列。以用于表达dMAN-miR-195的表达载体pLVX-dMAN-miR-195为例，其核苷酸序列如SEQ IDN0. 3 所示。
[0047] 本发明还提供上述用于表达所述microRNA抑制剂的miRNA抑制剂表达载体的构 建方法，包括以下步骤：
[0048] S100、从miRNA数据库miRNAbase(www.miRNAbase.org)中获取miRNA成熟序列， 并转换成对应的DNA序列。
[0049]S200、在步骤S100中所得的DNA序列，5'端第10、第11位之间插入"ATCT"碱基， 形成antisense-MBS序列；并将antisense-MBS序列反向互补形成sense-MBS序列。
[0050] S300、根据上述S200序列，设计4条用于构建dMAN的引物：
[0051] (1)引物 1:5' -GTATTCTGTGACCAGAATACTTC-antisense-MBS-CTTGACTCTC-3'；
[0052] (2)引物 2 :5'-GAATATAGGAATCTATATTCGGC-sense MBS-CGGAACTTGA-3'；
[0053] (3)引物3 :5' -ACCCGTCTCTCTTC-antisense-MBS-CTTGTATTCTGTGACCAGA-3'；
[0054](4)引物4 :5' -GTGCGTCTCATGGC-sense MBS-CGGGAATATAGGAATCTAT-3'〇
[0055] 具体地，以mmu-miR-195为例，获取miRNA成熟序列是mmu-miR-195成熟序列为 5'-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3'（SEQIDN0. 13)。首先将miRNA成熟序列转换成对应的DNA 序列：5'-TAGCAGCACAGAAATAITGGC-3'（SEQIDN0. 14)。在DNA序列 5'端第 10、第 11 位之间 插入"ATCT"碱基，得到antisense-MBS-miR-195序列：5'-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3'（SEQ IDNO. 15)，并将antisense-MBS-miR-195 序列反向互补形成sense-MBS-miR-195 序列： 5'-GCCAATAITTCTGTGCTGCTA-3'（SEQIDN0.16)。根据sense-MBS-miR-195 序列，设计 4 条扩增dMAN-miR-195的引物如下：
[0056]dMAN-miR-195-Pl: 5'-GTATTCTGTGACCAGAATACTTCTAGCAGCACAATCTGAAATATTGGCCT TGACTCTC-3'（SEQID:17);
[0057]dMAN-miR-195-P2:5'-GAATATAGGAATCTATATTCGGCGCCAATATTTCAGATTGTGCTGCTACG GAACTTGA-3'（SEQID:18);
[0058]dMAN-miR-195-P3:5'-ACCGGTCTCTCTTCTAGCAGCACAATCTGAAATATTGGCCTTGTATTCTG TGACCAGA-3'（SEQID:19);
[0059]dMAN-miR-195-P4:5'-GTGGGTCTCATGGCGCCAATATTTCAGATTGTGCTGCTACGGGAATATAG GAATCTAT-3'（SEQID:20)。
[0060] S400、设计两对引物，一对用于扩增HI启动子（SEQIDNO. 8)，Hl-F: 5'-TGTGGTCTCATACAGAACTT-3'（SEQIDN0.4)和Hl-R:5'-CCGACCTTGGGAACGCTGACGTCAT-3 '（SEQIDN0.5);-对用于扩增U6 启动子序列（SEQIDN0.9)，U6-F:5'-GTCAGCGITCCCAAG 对引物分别用于从人和小鼠基因组中分别扩增H...