专利名称：家蚕基因及其在真核细胞中的表达和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是一种家蚕乙酰胆碱酯酶基因核苷酸序列，以该核苷酸序列编码的多肽及其制备方法和应用。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE；Ace；EC3.1.1.7)是神经传导中的一种关键酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。它是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。杀虫剂与酶分子结合后，使酶磷酰化或氨基甲酰化，钝化酶的活性而阻断正常的神经传导，使昆虫致死。
1986年Hall和Spierer从黑腹果蝇中克隆到第一个昆虫的乙酰胆碱酯酶基因，迄今为止已经报道了23种昆虫和螨类的乙酰胆碱酯酶的基因序列。家蚕是重要的经济昆虫，是人类最早驯化的动物之一。也是继果蝇和冈比亚按蚊之后第三个完成基因组测序的昆虫。在长期的驯化过程中与农药的接触相对较少，关于家蚕乙酰胆碱酯酶基因的克隆和序列分析在国内外还未见报道。
杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)是20世纪80年代发展起来的真核表达系统，Smith等人在“Production ofhuman belta interferon in insect cells infected with baculovirus expressionvector”(《Mol Cell Biol》.19833，183-192.)公开的技术，利用AcMNPV，在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf-9细胞中成功地表达了β-干扰素。又有人利用BmNPV在家蚕幼虫体内高水平表达了人的α-干扰素，目前日臻完善，已有数百种外源基因在该系统中进行了表达。Bac to Bac杆状病毒表达系统是利用杆状病毒穿梭载体Bacmid，它含有完整的AcMNPV基因组，既能在大肠杆菌中低拷贝复制和稳定分离，又可以直接转染昆虫细胞，得到病毒粒子。外源基因通过位点特异性转座作用整合到Bacmid中，经过筛选重组Bacmid。直接转染昆虫细胞，得到纯的重组病毒，同时高效表达外源基因，该系统具有快速稳定高效等特点。
发明内容
本发明提供了家蚕两种类型乙酰胆碱酯酶的核苷酸序列及编码的多肽序列及其表达和应用。
一种编码家蚕乙酰胆碱酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一种编码家蚕乙酰胆碱酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。
本发明首次克隆到编码家蚕乙酰胆碱酯酶的两个基因，分别为Bmace1和Bmace2。(具有序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所述的核苷酸序列)。Bmace1基因编码区全长为2052bp，预计编码683个氨基酸残基，Signal P预测到一个17氨基酸残基的信号肽。Bmace2编码区长度为1917bp，编码一个638个残基的蛋白，预测有一个23个氨基酸残基的信号肽。同时将两个基因与电鳐，果蝇等其它昆虫序列联配的结果表明，克隆的两个基因具有保守的催化三联体，6个半胱氨酸残基形成三对二硫键，保守的氧阴离子洞，保守的FGESAG基序。
本发明还提供了所述基因(Bmace1)编码的多肽，该多肽具有序列表中SEQ ID No.3所述的氨基酸序列。
本发明还提供了所述基因(Bmace2)编码的多肽，该多肽具有序列表中SEQ ID No.4所述的氨基酸序列。
本发明还提供了基因(Bmace1)编码的多肽的制备方法，包括如下步骤(a)构建带有目的基因的杆状病毒转移载体；(b)将杆状病毒转移载体转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，提取重组基因；(c)将重组基因转染粉纹夜蛾细胞，培养后收获细胞，分离出多肽。
本发明还提供了基因(Bmace2)编码的多肽的制备方法，包括如下步骤
(a)构建带有目的基因的杆状病毒转移载体；(b)将杆状病毒转移载体转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，提取重组基因；(c)将重组基因转染粉纹夜蛾细胞，培养后收获细胞，分离出多肽。
本发明还提供了基因(Bmace1)和基因(Bmace2)编码的多肽在农药筛选中的应用。
本发明中的“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“家蚕乙酰胆碱酯酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有家蚕乙酰胆碱酯酶蛋白(或多肽)的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与家蚕乙酰胆碱酯酶相同功能的蛋白的序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。
在本发明中，术语“家蚕乙酰胆碱酯酶蛋白多肽”指具有家蚕乙酰胆碱酯酶蛋白活性的多肽。该术语还包括具有与家蚕乙酰蛋白胆碱酯酶蛋白相同功能的序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括家蚕乙酰胆碱酯酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与家蚕乙酰胆碱酯酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白，以及利用抗家蚕乙酰胆碱酯酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞，包括酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞，优选宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、Sf细胞等。
本发明首次克隆得到家蚕的乙酰胆碱酯酶基因，为家蚕乙酰胆碱酯酶的双基因编码提供了直接的证据，且公开家蚕乙酰胆碱酯酶的基因组序列，是鳞翅目昆虫中第一个明确基因结构的昆虫。家蚕是一种驯养了5000多年的模式昆虫，因此家蚕乙酰胆碱酯酶基因具有特别的用途。
本发明在昆虫细胞中表达了鳞翅目的两种类型的乙酰胆碱酯酶，制备了具有生物活性的基因工程鳞翅目乙酰胆碱酯酶，可以直接用于农药的筛选，为针对农业最重要类群的害虫即鳞翅目害虫的杀虫剂设计和新农药离体筛选提供了便捷途径，在新农药筛选前期可省去了培养鳞翅目昆虫的大量费用和时间。
图1为Bmace1基因在Tn细胞里的表达(A)和Western blot分析(B)(A)Marker标准蛋白样品；泳道TnTn细胞对照；泳道Bacmid感染对照病毒Bacmid的Tn细胞；泳道Bmace1感染含Bmace1基因的重组病毒的Tn细胞抽提物，箭头表示表达的Bmace1蛋白条带(B)泳道Bmace1感染含Bmace1基因的重组病毒的Tn细胞抽提物，箭头表示用Bmace1抗体检测出的Bmace1蛋白印迹。
图2为Bmace2基因在Tn细胞中的表达(A)和Western标blot分析(B)(A)Marker标准蛋白样品；泳道TnTn细胞对照；泳道Bacmid感染对照病毒Bacmid的Tn细胞；泳道Bmace2感染含Bmace2基因的重组病毒的Tn细胞抽提物，箭头表示表达的Bmace2蛋白条带。
(B)泳道TnTn细胞对照；泳道Bacmid感染对照病毒Bacmid的Tn细胞；泳道Bmace2感染含Bmace2基因的重组病毒的Tn细胞抽提物，箭头表示用Bmace1抗体检测出的Bmace1蛋白印迹。
具体实施例方式
家蚕乙酰胆碱酯酶的cDNA的克隆和测定以家蚕总RNA反转录得cDNA为模版，用两对寡核苷酸为引物，其中正向引物含有Bgl II酶切位点，反向引物含有Xho I酶切位点。
其中
利用引物BmAce1 Forward5-AGATCTATGCGCGTGGTGTTGGCABmAce1 Reverse5-CTCGAGTTATATGGTGTATTTGAACAGTGC扩增得到1型家蚕乙酰胆碱酯酶基因，编码区全长为2052bp，称为Bmace1基因(SEQ ID No.1)，预计编码683个氨基酸残基，Signal P预测到一个17氨基酸残基的信号肽。
利用引物BmAce2 Forward5’-AGATCTATGATCAACTACGGCAAGBmAce2 Reverse5’-CTCGAGTTACAAAGCAATAGTGATTGCCA扩增得到2型家蚕乙酰胆碱酯酶基因，编码区长度为1917bp，称为Bmace2基因(SEQ ID No.2)，编码一个638个残基的蛋白，预测有一个23个氨基酸残基的信号肽。
通过RT-PCR，分别用两对引物扩增出两条片段。将PCR扩增产物与pGEM-T Easy载体(Promega)连接，转化大肠杆菌TG1用碱法提取质粒，进行测序。
家蚕两种类型乙酰胆碱酯酶基因在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹夜蛾细胞株)中的表达将带有家蚕1型(Bmace1)和2型(Bmace2)乙酰胆碱酯酶基因的质粒pGEM-T-easy载体分别用Bgl II+Xho I进行双酶切，分别回收大小为2052bp和1917bp的片段，并分别与用BamH I+Xho I双酶切的载体pFASTBac1进行连接反应，连接产物转化TG1，经碱法抽取质粒DNA，并通过PCR验证，PCR片段与理论大小相符，说明杆状病毒转移载体构建成功。转移载体分别命名为pFastBac1-Bmace1和pFastBac1-Bmace2。
用重组转移载体pFastBac1-Bmace1和pFastBac1-Bmace2分别转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，挑取发生转座作用生成的白色菌落，提取重组Bacmid DNA，并作PCR分析鉴定，得到了整合位点正确的分别含有Bmace1和Bmace2基因的重组杆状病毒Bacmid载体。
在无血清条件下用Lipofectin介导重组Bacmid DNA转染生长状态良好的粉纹夜蛾细胞，8h后换新鲜培养基(含10％胎牛血清)，72h后取10μL含病毒粒子的培养液继续传代感染。连续4～5次传代感染后，收获细胞，3000r/min离心3min，弃上清，PBS缓冲液洗涤1～2次。1×PBS悬浮细胞，加等体积2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min。同时与被感染Bamid的细胞同时收获进行电泳SDS-PAGE分析。结果表明，感染含有Bmace1的重组病毒的Tn细胞抽提物在71kD左右出现特异性表达条带。进一步对凝胶进行自动扫描分析表明，Bmace1表达量占总蛋白的15.2％(图1)；感染含有Bmace2重组病毒的Tn细胞抽提物在66kD处有特异性的表达带。凝胶进行自动扫描分析表明，Bmace2表达量占总蛋白的13％(图2)。
表达产物的生物活性分析和在农药测定中的利用以0.5mM的碘化硫代乙酰胆碱乙酰胆碱(acetylthiocholine iodide，ATCh)为底物测定了上述表达的Bmace1和Bmace2蛋白的酶的活性。Bmace1酶的活性为28.63nmol/min/mg.pro，Bmace2酶的活性为30.65nmol/min/mg.pro。
同时测定了两种有机磷农药抑制剂即对氧磷和毒扁豆碱对上述表达的Bmace1和Bmace2两种类型的家蚕乙酰胆碱酯酶的抑制作用。与从活体幼虫头部抽提的粗酶液相比，表达产物对两种抑制剂更为敏感。对氧磷农药对粗酶液、Bmace1和Bmace2的抑制中浓度I50分别为9.8×10-7M、2.5×10-7M和0.6×10-7M，Bmace2比Bmace1更为敏感。毒扁豆碱的抑制也表现出同样的趋势，粗酶液、Bmace1和Bmace2的I50分别为4.8×10-7M、0.7×10-7M和0.2×10-7M。同时抑制结果也发现，毒扁豆碱对三种酶的抑制作用高于对氧磷。
结果说明本发明用真核细胞表达的Bmace1和Bmace2基因工程酶对有机磷农药敏感，可以用于筛选有机磷农药。本发明首先表达出具有生物活性的基因工程鳞翅目乙酰胆碱酯酶，为针对农业最重要类群的害虫即鳞翅目害虫的杀虫剂设计和新农药离体筛选提供了便捷途径，在新农药筛选前期可省去了培养鳞翅目昆虫的大量费用和时间。
SEQUENCE LISTING<110>浙江大学<120>家蚕基因及其在真核细胞中的表达和应用<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2240<212>DNA<213>家蚕1型(Bmace1)乙酰胆碱酯酶基因<400>1caggcggtgt ttgtgggtgt aggtgccagc gacggtatgc gcgtggtgtt ggcagcgctg 60acggcgctgg cggcgcgcac ccttgccggt ccgcacgagc accgggcgag gcaccacgcg120cctgcgcctc cgcagcccta ccacggccac ggcgaggccg tccgatacaa ccccgaactc180gataccatcc taccaagact cgaagaccac gaaacttcgt ctaagcgcgc cagtgatgcg240gaaacttcgt ccaagagaac caagtatgag gagagatttt actctaatca cgaacgagcc300gcggagctca tggccgatga gccggtctca gaaaaaggag acgaagagga ccctctagtt360attcgcacta ggaaggggaa ggtgagagga attacgctga cttcagcaac tggaaagaag420gtcgatgcgt ggttcggaat cccttatgca caaaaaccta tgggcgattt gaggttcagg480cacccaagac cagtcgaaga ttggggcgat gaaattctta acacaacaac actgccacat540tcctgcgtcc aaatagttga cacggtattc ggtgactttc ccggagctat gatgtggaat600cccaatacag atatgcagga agattgtctt tatattaaca tagtgacacc tcgaccacgt660ccaaagaatg ctgcggttat gctatgggta tttgggggag gcttttattc cggtacagcc720
actttagatg tttatgaccc aaaaatactt gtttcggaag aaaaagttgt gtatgtgtcc780atgcagtaca gagttgcatc acttggattt ttgtttttcg atacggcaga cgtccctggg840aatgctgggc tatttgatca gctgatggca ttgcaatggg tgaaagataa tattggctat900ttcggaggga atccacataa cataacatta tttggtgaat cagcaggagc tgtgtctgtg960tcgttacatt tgctatctcc cttgtcgagg aacctgttct ctcaagctat catgcagtct 1020ggagccgcca ctgctccatg ggctataatt tcgagagaag aaagtattct gcgtggcata 1080agattagctg aagctgtcca ctgtccacat tcaagatcgg atttggctcc tatgatagaa 1140tgcttgcgaa aaaagaatgc ggatgaattg gttaataatg agtgggggac attgggtata 1200tgtgaatttc cgtttgttcc tatcattgat ggatcgtttc tggacgaaat gccagtaagg 1260tcgttagctc atcaaaactt caagaaaaca aatattctta tgggatccaa taccgaagaa 1320ggatattatt ttatactcta ttacctaact gaattgtttc caaaagagga gaacgttgga 1380attagccggg aacagtttct tcaagcagtg agagaactca atccgtatgt taatgacgta 1440gcaaggcagg ctatcatata cgagtacact gattggttga atcctgaaga tccggtaaag 1500aatcgcaacg ctctcgacaa aatggtcgga gactatcatt tcacttgtgg agtaaacgaa 1560tttgcccatc gttatgcaga aactggtaat aatgtttaca cttattatta caagcatcgt 1620agtaagaata acccttggcc gtcctggact ggtgtgatgc atgctgacga gataaactat 1680gtgttcgggg agcctctcaa tcccgggaaa aattattcgc cggaagaagt cgaattcagc 1740aaacgcttaa tgagatattg ggcaaacttc gctaggtctg gaaatccgtc tctgaatcca 1800aacggcgaaa tgacgaagat acattggccg gttcacacgg cctttggacg ggaatattta 1860tcactggctg tgaactccag ttcagttggt cgtggtctac gcgttaaaca gtgcgctttt 1920tggcagaaac atctccccca gttaatggct gctaccaata aaccagagcc gccgaagaat 1980tgtacgaatt ctgttccttc tttgtggcca tctcgcaata ctctcggctt caacgtcata 2040gcaaccgctg cgcttacagg cacagcactg ttcaaataca ccatataagt aacttgtata 2100gaaaacaatt ttaggaattt tgatagttat ttcgaattta attttagcga ttctcctatt 2160aatatagtgt tatctgatgt tcgttgtttt cgataaaaac acgttttgta tatttttatt 2220tcaataaaaa aaaaaaaaaa 2240<210>2<211>1989<212>DNA
<213>家蚕2型(Bmace2)乙酰胆碱酯酶基因<400>2ctcgcagact acttcagatt gtatttcgat acttctcatt gaatgtgtag tggcaatcag 60aatcacaatg atcaactacg gcaagattgt attcactaag cttcttctat gcgtactcat120atccggtact tttgctcgat cttgggccaa tcaccatgat accacaacat ctacaacaca180aactacacca acgacaagtc cggtaccaaa aaatatccac aacgatccac ttattgtcga240aacaaagagc ggtctcatca aaggatacgc aaaaactgta atgggacgcg aggtacacat300ttttacgggt atcccgtttg cgaaacctcc attaggaccc ctgagattcc gtaagccggt360accaatcgag ccatggcatg gcgtgcttga agcaaactta atgccaaaca gttgttatca420agagcgctac gagtattttc caggatttga aggagaggaa atgtggaatc caaatactaa480tatatcagaa gattgccttt atttgaatat ttgggtacca cagcacttac gagttcgtca540ccatcaagat aaaccgctcg ccgaaagacc taaagtgccg attcttgtgt ggatttacgg600cggtggctac atgagtggca cggctacact tgacctatat aaagcagata taatggcatc660tacaagcgac gtaatagtgg cttctatgca atacagggtt ggtgcatttg gatttttata720tttgaataaa tatttttctc cgggtagtga agaagctcct ggaaatatgg gtttatggga780tcaacaactc gctattcgtt ggataaaaga gaacgctcgt gcttttggag gtgaccctga840actcattacg ctgttcgggg aatctgccgg tggcggtagt gtaagccttc atatgctatc900acctgaaatg aaaggattgt ttaaaagagg tatattgcaa tcaggaacgt tgaatgcacc960ttggagttgg atgactggag aaagagctca agatattgga aaagtattaa ttgatgactg 1020taactgcaac agtagtcttt tagccaagga tcctagtctc gtaatggatt gcatgcgcgg 1080agttgacgct aaaacgattt ctgttcagca atggaattct tatactggaa ttttgggttt 1140tccgtccgca cctacggttg atggtatttt tttgccaaaa gatcctgata ccatgatgaa 1200ggaagggaat ttccataata gtgaagtgct acttggcagt aaccaagacg aagggacata 1260ttttttgctg tacgacttcc tggattattt cgaaaaggat gggcctagtt ttcttcagag 1320ggagaaattt ctcgaaatcg ttgacactat tttcaaggac ttttctaaaa ttaagagaga 1380agccattgtg ttccagtata cagattggga agagatcacc gacggatatt tgaaccagaa 1440gatgatagct gatgtcgtag gagactactt cttcgtatgc cccactaact acttcgccga 1500aatacttgcc gacgctggtg tcgatgttta ctattactat tttactcatc gtaccagcac 1560aagtctctgg ggagaatgga tgggcgtgat gcatggtgac gaaatggaat atgtttttgg 1620
acatcccttg aacatgtccc ttcagtacca ttcccgggag cgtgatttag cagcacacat 1680tatgcagtct ttcacacagt ttgctcttac cggaaaacct cacaagcctg acgagaagtg 1740gcctctgtac tcccggtctt cgcctcatta ctacacatac acggcggtgg gtccaagcgg 1800tccagccgga ccccgcggcc cgcgtgcctc cgcctgcgct ttctggaacg atttcttgaa 1860caaacttaac gagttggagc gtgtaccgtg tgacggcgcc gtgaccggtc cttacagcag 1920tgtcgccggc actgccctcc ctgtaaccct tctcaccact ttggcaatca ctattgcttt 1980gtaaatttt 1989<210>3<211>683<212>PRT<213>家蚕1型(Bmace1)乙酰胆碱酯酶基因编码的多肽<400>3Met Arg Val Val Leu Ala Ala Leu Thr Ala Leu Ala Ala Arg Thr Leu1 5 10 15Ala Gly Pro His Glu His Arg Ala Arg His His Ala Pro Ala Pro Pro20 25 30Gln Pro Tyr His Gly His Gly Glu Ala Val Arg Tyr Asn Pro Glu Leu35 40 45Asp Thr Ile Leu Pro Arg Leu Glu Asp His Glu Thr Ser Ser Lys Arg50 55 60Ala Ser Asp Ala Glu Thr Ser Ser Lys Arg Thr Lys Tyr Glu Glu Arg65 70 75 80Phe Tyr Ser Asn His Glu Arg Ala Ala Glu Leu Met Ala Asp Glu Pro85 90 95Val Ser Glu Lys Gly Asp Glu Glu Asp Pro Leu Val Ile Arg Thr Arg100 105 110Lys Gly Lys Val Arg Gly Ile Thr Leu Thr Ser Ala Thr Gly Lys Lys
115 120 125Val Asp Ala Trp Phe Gly Ile Pro Tyr Ala Gln Lys Pro Met Gly Asp130 135 140Leu Arg Phe Arg His Pro Arg Pro Val Glu Asp Trp Gly Asp Glu Ile145 150 155 160Leu Asn Thr Thr Thr Leu Pro His Ser Cys Val Gln Ile Val Asp Thr165 170 175Val Phe Gly Asp Phe Pro Gly Ala Met Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp180 185 190Met Gln Glu Asp Cys Leu Tyr Ile Asn Ile Val Thr Pro Arg Pro Arg195 200 205Pro Lys Asn Ala Ala Val Met Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Phe Tyr210 215 220Ser Gly Thr Ala Thr Leu Asp Val Tyr Asp Pro Lys Ile Leu Val Ser225 230 235 240Glu Glu Lys Val Val Tyr Val Ser Met Gln Tyr Arg Val Ala Ser Leu245 250 255Gly Phe Leu Phe Phe Asp Thr Ala Asp Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu260 265 270Phe Asp Gln Leu Met Ala Leu Gln Trp Val Lys Asp Asn Ile Gly Tyr275 280 285Phe Gly Gly Asn Pro His Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly290 295 300Ala Val Ser Val Ser Leu His Leu Leu Ser Pro Leu Ser Arg Asn Leu305 310 315 320Phe Ser Gln Ala Ile Met Gln Ser Gly Ala Ala Thr Ala Pro Trp Ala325 330 335Ile Ile Ser Arg Glu Glu Ser Ile Leu Arg Gly Ile Arg Leu Ala Glu340 345 350Ala Val His Cys Pro His Ser Arg Ser Asp Leu Ala Pro Met Ile Glu
355 360 365Cys Leu Arg Lys Lys Asn Ala Asp Glu Leu Val Asn Asn Glu Trp Gly370 375 380Thr Leu Gly Ile Cys Glu Phe Pro Phe Val Pro Ile Ile Asp Gly Ser385 390 395 400Phe Leu Asp Glu Met Pro Val Arg Ser Leu Ala His Gln Asn Phe Lys405 410 415Lys Thr Asn Ile Leu Met Gly Ser Asn Thr Glu Glu Gly Tyr Tyr Phe420 425 430Ile Leu Tyr Tyr Leu Thr Glu Leu Phe Pro Lys Glu Glu Asn Val Gly435 440 445Ile Ser Arg Glu Gln Phe Leu Gln Ala Val Arg Glu Leu Asn Pro Tyr450 455 460Val Asn Asp Val Ala Arg Gln Ala Ile Ile Tyr Glu Tyr Thr Asp Trp465 470 475 480Leu Asn Pro Glu Asp Pro Val Lys Asn Arg Asn Ala Leu Asp Lys Met485 490 495Val Gly Asp Tyr His Phe Thr Cys Gly Val Asn Glu Phe Ala His Arg500 505 510Tyr Ala Glu Thr Gly Asn Asn Val Tyr Thr Tyr Tyr Tyr Lys His Arg515 520 525Ser Lys Asn Asn Pro Trp Pro Ser Trp Thr Gly Val Met His Ala Asp530 535 540Glu Ile Asn Tyr Val Phe Gly Glu Pro Leu Asn Pro Gly Lys Asn Tyr545 550 555 560Ser Pro Glu Glu Val Glu Phe Ser Lys Arg Leu Met Arg Tyr Trp Ala565 570 575Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Ser Leu Asn Pro Asn Gly Glu Met580 585 590Thr Lys Ile His Trp Pro Val His Thr Ala Phe Gly Arg Glu Tyr Leu
595 600 605Ser Leu Ala Val Asn Ser Ser Ser Val Gly Arg Gly Leu Arg Val Lys610 615 620Gln Cys Ala Phe Trp Gln Lys His Leu Pro Gln Leu Met Ala Ala Thr625 630 635 640Asn Lys Pro Glu Pro Pro Lys Asn Cys Thr Asn Ser Val Pro Ser Leu645 650 655Trp Pro Ser Arg Asn Thr Leu Gly Phe Asn Val Ile Ala Thr Ala Ala660 665 670Leu Thr Gly Thr Ala Leu Phe Lys Tyr Thr Ile675 680<210>4<211>638<212>PRT<213>家蚕2型(Bmace2)乙酰胆碱酯酶基因编码的多肽<400>4Met Ile Asn Tyr Gly Lys Ile Val Phe Thr Lys Leu Leu Leu Cys Val1 5 10 15Leu Ile Ser Gly Thr Phe Ala Arg Ser Trp Ala Asn His His Asp Thr20 25 30Thr Thr Ser Thr Thr Gln Thr Thr Pro Thr Thr Ser Pro Val Pro Lys35 40 45Asn Ile His Asn Asp Pro Leu Ile Val Glu Thr Lys Ser Gly Leu Ile50 55 60Lys Gly Tyr Ala Lys Thr Val Met Gly Arg Glu Val His Ile Phe Thr65 70 75 80Gly Ile Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Pro Leu Arg Phe Arg Lys
85 90 95Pro Val Pro Ile Glu Pro Trp His Gly Val Leu Glu Ala Asn Leu Met100 105 110Pro Asn Ser Cys Tyr Gln Glu Arg Tyr Glu Tyr Phe Pro Gly Phe Glu115 120 125Gly Glu Glu Met Trp Asn Pro Asn Thr Asn Ile Ser Glu Asp Cys Leu130 135 140Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln His Leu Arg Val Arg His His Gln145 150 155 160Asp Lys Pro Leu Ala Glu Arg Pro Lys Val Pro Ile Leu Val Trp Ile165 170 175Tyr Gly Gly Gly Tyr Met Ser Gly Thr Ala Thr Leu Asp Leu Tyr Lys180 185 190Ala Asp Ile Met Ala Ser Thr Ser Asp Val Ile Val Ala Ser Met Gln195 200 205Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Tyr Leu Asn Lys Tyr Phe Ser210 215 220Pro Gly Ser Glu Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Trp Asp Gln Gln225 230 235 240Leu Ala Ile Arg Trp Ile Lys Glu Asn Ala Arg Ala Phe Gly Gly Asp245 250 255Pro Glu Leu Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Gly Ser Val260 265 270Ser Leu His Met Leu Ser Pro Glu Met Lys Gly Leu Phe Lys Arg Gly275 280 285Ile Leu Gln Ser Gly Thr Leu Asn Ala Pro Trp Ser Trp Met Thr Gly290 295 300Glu Arg Ala Gln Asp Ile Gly Lys Val Leu Ile Asp Asp Cys Asn Cys305 310 315 320Asn Ser Ser Leu Leu Ala Lys Asp Pro Ser Leu Val Met Asp Cys Met
325 330 335Arg Gly Val Asp Ala Lys Thr Ile Ser Val Gln Gln Trp Asn Ser Tyr340 345 350Thr Gly Ile Leu Gly Phe Pro Ser Ala Pro Thr Val Asp Gly Ile Phe355 360 365Leu Pro Lys Asp Pro Asp Thr Met Met Lys Glu Gly Asn Phe His Asn370 375 380Ser Glu Val Leu Leu Gly Ser Asn Gln Asp Glu Gly Thr Tyr Phe Leu385 390 395 400Leu Tyr Asp Phe Leu Asp Tyr Phe Glu Lys Asp Gly Pro Ser Phe Leu405 410 415Gln Arg Glu Lys Phe Leu Glu Ile Val Asp Thr Ile Phe Lys Asp Phe420 425 430Ser Lys Ile Lys Arg Glu Ala Ile Val Phe Gln Tyr Thr Asp Trp Glu435 440 445Glu Ile Thr Asp Gly Tyr Leu Asn Gln Lys Met Ile Ala Asp Val Val450 455 460Gly Asp Tyr Phe Phe Val Cys Pro Thr Asn Tyr Phe Ala Glu Ile Leu465 470 475 480Ala Asp Ala Gly Val Asp Val Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Thr His Arg Thr485 490 495Ser Thr Ser Leu Trp Gly Glu Trp Met Gly Val Met His Gly Asp Glu500 505 510Met Glu Tyr Val Phe Gly His Pro Leu Asn Met Ser Leu Gln Tyr His515 520 525Ser Arg Glu Arg Asp Leu Ala Ala His Ile Met Gln Ser Phe Thr Gln530 535 540Phe Ala Leu Thr Gly Lys Pro His Lys Pro Asp Glu Lys Trp Pro Leu545 550 555 560Tyr Ser Arg Ser Ser Pro His Tyr Tyr Thr Tyr Thr Ala Val Gly Pro
565 570 575Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Arg Ala Ser Ala Cys Ala Phe580 585 590Trp Asn Asp Phe Leu Asn Lys Leu Asn Glu Leu Glu Arg Val Pro Cys595 600 605Asp Gly Ala Val Thr Gly Pro Tyr Ser Ser Val Ala Gly Thr Ala Leu610 615 620Pro Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu Ala Ile Thr Ile Ala Leu625 630 63权利要求
1.一种编码家蚕乙酰胆碱酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列。
2.一种编码家蚕乙酰胆碱酯酶基因的序列，具有序列表中SEQ IDNo.2所述的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述基因编码的多肽，该多肽具有序列表中SEQ IDNo.3所述的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述基因编码的多肽，该多肽具有序列表中SEQ IDNo.4所述的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(a)构建带有目的基因的杆状病毒转移载体；(b)将杆状病毒转移载体转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，提取重组基因；(c)将重组基因转染粉纹夜蛾细胞，培养后收获细胞，分离出多肽。
6.如权利要求4所述的多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(a)构建带有目的基因的杆状病毒转移载体；(b)将杆状病毒转移载体转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，提取重组基因；(c)将重组基因转染粉纹夜蛾细胞，培养后收获细胞，分离出多肽。
7.如权利要求2或3所述的多肽在农药筛选中的应用。
全文摘要
本发明公开了家蚕乙酰胆碱酯酶基因核苷酸序列，以及该核苷酸序列编码的多肽及其制备方法和应用。本发明在昆虫细胞中表达了鳞翅目的两种类型的乙酰胆碱酯酶，制备了具有生物活性的基因工程鳞翅目乙酰胆碱酯酶，可以直接用于农药的筛选，为针对农业最重要类群的害虫即鳞翅目害虫的杀虫剂设计和新农药离体提供了便捷途径，在新农药筛选前期省去了培养鳞翅目昆虫的大量费用和时间。
文档编号C12N1/21GK101041828SQ20071006741
公开日2007年9月26日 申请日期2007年3月2日 优先权日2007年3月2日
发明者尚金燕, 张传溪, 陈艳霞, 袁刚, 王强, 唐振华 申请人:浙江大学