组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细胞的成骨分化制剂中的应用的制作方法

组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细胞的成骨分化制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细胞的成骨分化制剂中的应用，本发明对于组蛋白去乙酰化酶抑制剂改变间充质干细胞的乙酰化，应用于药物改变细胞表观遗传学治疗牙周炎及种植体周围炎等疾病，促进骨组织再生有十分重要和深远的意义。本发明提供的两种组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够促进牙周炎、骨组织缺损、种植体周围炎患者骨组织的再生，以弥补传统的治疗方法如牙周引导组织再生术(Guide?Tissue?Regeration,GTR)、牙齿根尖周搔刮术、骨替代品应用、牵张成骨术等骨组织再生的不足。
【专利说明】组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细胞的成骨分化 制剂中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于牙科制剂领域，涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细 胞的成骨分化制剂中的应用。

【背景技术】
[0002] 牙周炎是一种常见而且多发的牙周组织慢性感染性疾病，是造成成年人牙齿缺失 的主要原因。虽然对牙周病病因的研究在不断深入，但是牙周炎的发病机制仍未完全解决， 目前认为菌斑微生物和宿主的免疫炎症反应是主要原因。通过机械清除牙菌斑等牙周基础 治疗是目前治疗牙周炎的主要措施，机械治疗可以有效控制牙周炎症，但是单纯应用不能 取得明显组织再生疗效。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC)是具有自我更新， 克隆形成和多向分化潜能的早期未分化细胞。口腔颌面部中存在着大量的间充质干细胞， 如牙龈间充质干细胞、牙髓、根尖牙乳头等干细胞，可多向分化，促进成骨。在牙周炎、种植 体周围炎等炎症微环境下，牙龈组织和牙周膜中是否存在干细胞，其功能是否发生改变，这 些问题都尚不清楚。
[0003] 表观遗传学（印igenetics)是不涉及DNA序列改变的可遗传的基因表达变化的研 究。在其诸多的形式中，以组蛋白的共价修饰占有重要地位，其与基因的表达及调控密切 相关联，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化修饰等。其中组蛋白乙酰化及去乙酰化修饰 是最重要的方式，是基因表达调控最主要的驱动力，此可逆的动态修饰由组蛋白乙酰基转 移酶（histone acetyltransferases，HAT)和组蛋白去乙醜化酶（histone deacetylases, HDAC)共同催化，共同控制染色质各区域中核心组蛋白的乙酰化程度。
[0004] 组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi)具有诱导细胞凋亡、分化和抑制增殖的活性， 目前其研究涉及众多肿瘤领域，包括血液系统肿瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺 癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌等，其并对肿瘤细胞具有高选择性和低毒的优点具有非常广阔的 应用前景。HDACi通过在转录后修饰组蛋白来调节基因转录和染色质装配，从而成为了某些 疾病治疗的新靶点。虽然HDACi介导免疫反应的潜在分子机制有待于进一步探索，但是其 强有力的免疫调节活性为治疗炎症免疫性疾病带来了希望。HDACi也被证明能够诱导细胞 终末分化，体外研究已经证实多种HDACi能够诱导干细胞或前体细胞骨向或神经向分化。
[0005] 因此，本研究通过使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA及LBH589,促进炎症及正常 间充质干细胞向成骨分化，利于组织再生，对牙周炎造成的骨组织缺损以及种植体周围炎 的骨组织修复有一定作用，利于临床应用。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细胞的成 骨分化制剂中的应用，提供的组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够增强间充质干细胞的成骨分化 能力，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂为曲古抑菌素或帕比司他。
[0007] 本发明实现目的的技术方案如下：
[0008] -种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细胞的成骨分化制剂中的应用，所 述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为曲古抑菌素 A或帕比司他。
[0009] 而且，所述牙源性干细胞为牙龈间充质干细胞或根尖牙乳头干细胞。
[0010] 而且，所述曲古抑菌素 A的浓度为ΙΟΟηΜ。
[0011] 而且，所述帕比司他的浓度为20nM、50nM或ΙΟΟηΜ。
[0012] 一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进牙源性干细胞的成骨分化的方法，步骤如下
[0013] 取第三代的正常和炎症牙龈间充质干细胞，以2X 103/cm2的密度接种于6孔板，待 细胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液，加入TSA使终浓度为ΙΟΟηΜ，对照组加入等 量DMS0, 2天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞形态及矿化结节形成情况。
[0014] 一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进牙源性干细胞的成骨分化的方法，步骤如下
[0015] 将生长状况良好的纯化的第三代根尖牙乳头干细胞以2X103/cm2的密度接种于 6孔板，待细胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液，加如梯度浓度为为20nM、50nM或 100nM的帕比司他，2天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞形态及矿化结节形成情况。
[0016] 一种制备促进牙源性干细胞成分分化TSA壳聚糖缓释药物的方法，包括如下步 骤：
[0017] ⑴壳聚糖温敏体系的制备：称取2g壳聚糖粉末溶解在100mL浓度1 %醋酸溶 液中，配制成2%壳聚糖溶液，移取一定体积的2%壳聚糖溶液于试管中，按比例逐滴加入 58% β -甘油磷酸钠溶液，振荡混匀后，以少量NaOH稀溶液调节混合液的pH = 5 ;
[0018] (2)了54的01^0溶液制备：称取了54粉末0.111^溶解于11^01^0中，配制成10(^ 8/ L溶液；
[0019] ⑶TSA壳聚糖缓释系统制备：将100 μ g/L的TSA DMS0溶液溶液加入壳聚糖温敏 体系中，搅拌均匀，最终达到10 μ g/L浓度，常温保存。
[0020] 本发明取得的优点和有益效果是：
[0021] 1、本发明首次发现在培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素 (Trichostatin A, TSA)或帕比司他（Panobinostat，LBH589)能够促进正常或炎症状态下 的间充质干细胞的成骨分化能力。
[0022] 2、本发明提供的两种组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够促进牙周炎、骨组织缺损、 种植体周围炎患者骨组织的再生，以弥补传统的治疗方法如牙周引导组织再生术（Guide Tissue Regeration，GTR)、牙齿根尖周搔刮术、骨替代品应用、牵张成骨术等骨组织再生的 不足。
[0023] 3、本发明从碱磷酶及茜素红染色水平，发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进炎症及 健康状态下的间充质干细胞的成骨分化；从基因水平检测证明，间充质干细胞成骨相关基 因0CN和RUNX2表达增高。表观遗传学中证明，炎症牙周炎患者牙龈间充质干细胞中组蛋 白去乙酰化酶HDAC1、3、6的表达增高，加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂后发现炎症状态下的 HDAC1、3、6表达有所下降，可能与成骨相关基因的表达增加相关，通过建立大鼠实验性牙周 炎动物模型，通过牙龈局部注曲古抑菌素 A (TSA)壳聚糖缓释药物，观测组织学、影像学及 临床指标检测，证实了曲古抑菌素 A壳聚糖药物缓释系统对大鼠实验性牙周炎炎症反应和 牙周骨组织再生的治疗作用，具体实验数据和说明见实施例部分。

【专利附图】

【附图说明】
[0024] 图1为成骨诱导下，正常及炎症状态下的牙龈间充质干细胞在TSA作用下的碱性 磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性检测；图1-1为GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下的碱性磷酸 酶染色，其中图 1-1A、图 1-1B、图 1-1C 为 GMSC-H，图 1-1D、图 1-1E、图 1-1F 为 GMSC-I,图 1-1A与图1-1D为空白组，图1-1B与图1-1E为加入成骨诱导液和DMS0,图1-1C与图1-1F 为加入成骨诱导液和TSA。
[0025] 图1-2为GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下镜下碱性磷酸酶染色，其中图1-2A、图 1- 2B、图 1-2C 为 GMSC-H，图 1-2D、图 1-2E、图 1-2F 为 GMSC-I,图 1-2A 与图 1-2D 为空白组， 图1-2B与图1-2E为加入成骨诱导液和DMS0,图1-2C与图1-2F为加入成骨诱导液和TSA。
[0026] 图1-3GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下碱性磷酸酶活性检测。
[0027] 图2为成骨诱导下，正常及炎症状态下的牙龈间充质干细胞在TSA作用下的茜素 红染色及矿化结节的定量分析；
[0028] 图2-1为GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下茜素红染色，其中图2-1A、图2-1B、图 2- 1C 为 GMSC-H，图 2-1D、图 2-1E、图 2-1F 为 GMSC-I,图 2-1A 与图 2-1D 为空白，图 2-1B 与 图2-1E为加入成骨诱导液和DMS0,图2-1C与图2-1F为加入成骨诱导液和TSA。
[0029] 图2-2为GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下镜下茜素红染色，其中图2-2A、图2-2B、 图 2-2C 为 GMSC-H，图 2-2D、图 2-2E、图 2-2F 为 GMSC-I,图 2-2A 与图 2-2D 为空白，图 2-2B 与图2-2E为加入成骨诱导液和DMS0,图2-2C与图2-2F为加入成骨诱导液和TSA。
[0030] 图2-3为GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下成骨矿化结节的定量分析。
[0031] 图3为正常及炎症状态下的牙龈间充质干细胞在TSA作用下0CN和RUNX2的表达 升1? ;
[0032] 图3-1为RT-PCR检测GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下0CN和RUNX2的表达；
[0033] 图3-2为GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下0CN和RUNX2的相对灰度值分析；
[0034] 图4为成骨诱导下，不同浓度的LBH589对根尖乳头干细胞的碱磷酶染色；
[0035] 图5为成骨诱导下，不同浓度的LBH589对根尖乳头干细胞的茜素红染色及钙离子 浓度分析
[0036] 图5-1为不同浓度的LBH589对根尖乳头干细胞的茜素红染色；
[0037] 图5-2为不同浓度的LBH589对根尖乳头干细胞作用下钙离子浓度分析；
[0038] 上述附图4、5说明附图涉及字母A、B、C、D、E、F的分别表示如下含义：空白组（A)， 加入成骨诱导液（B)、成骨诱导液加入DMSO(C)、成骨诱导液加入LBH589 20nM(D)、成骨诱 导液加入LBH589 50nM(E)、成骨诱导液加入LBH589100nM(F)。
[0039] 图6为大鼠实验性牙周炎动物模型的建立；
[0040] 图7为应用TSA壳聚糖缓释系统后，牙周炎大鼠牙周骨丧失（PBL)的状况及统计 学分析；
[0041] 图7-1为应用TSA壳聚糖缓释系统后，牙周炎大鼠牙周骨丧失（PBL)的状况，其中 从左到右依次为A空白组，B盐水组，C壳聚糖组，DTSA组；
[0042] 图7-2为应用TSA壳聚糖缓释系统后，牙周炎大鼠牙周骨丧失（PBL)的状况的统 计分析；
[0043] 图8为应用TSA壳聚糖缓释系统后，牙周炎大鼠牙周袋深度的状况；
[0044] 图9为应用TSA壳聚糖缓释系统后，各组大鼠上颌骨做MicroCT扫描后，牙周炎大 鼠牙周骨支持率（PBS)的状况；
[0045] 图9-1为牙周骨支持率PBS测量示意图，在X线片上先取各点，A为根尖点，C为牙 尖高点，B为AC连线与牙槽嵴顶线的交点。PBS = AB/ACX 100% ;
[0046] 图9-2为各组大鼠牙槽骨（PBS)MicroCT图像，其中A空白组，B盐水组，C壳聚糖 组，D TSA组；
[0047] 图9-3为各组大鼠牙槽骨PBS值的统计分析，其中A空白组，B盐水组，C壳聚糖 组，D TSA组。
[0048] 上述【专利附图】

【附图说明】附图涉及字母A、B、C、D、E、F的分别表示如下含义：空白组（A)，加 入成骨诱导液（B)、成骨诱导液加入DMSO(C)、成骨诱导液加入LBH58920nM(D)、成骨诱导液 加入 LBH589 50nM(E)、成骨诱导液加入 LBH589 100nM(F)。

【具体实施方式】
[0049] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0050] 本【具体实施方式】中所使用的健康及炎症牙龈间充质干细胞和根尖乳头干细胞，均 来自天津医科大学口腔医院门诊病人的组织所获得，并均获得患者的同意，符合口腔治疗 程序和伦理委员会要求。健康牙龈组织取自20-55岁牙周健康患者，探诊深度（PD) < 3mm， 无附着丧失，无牙龈出血及红肿，无系统性疾病，不吸烟需要拔除第三磨牙或做冠延长手术 者；炎症牙龈组织选择20-55岁慢性牙周炎患者，纳入标准：①探诊深度（PD)> = 5mm，临床 附着水平（CAL)彡5mm，X线片显示牙槽骨吸收至少至根长的1/2;②牙齿松动> = ΙΓ，需 要拔除患牙并需要牙龈修整。排除标准：①药物、妊娠等导致的牙龈增生；②患有糖尿病等 系统性疾病；③吸烟者。根尖牙乳头干细胞来自于根尖未闭合正畸牙的根尖牙乳头，对以上 组织进行分离、培养、纯化获得。通过流式细胞术检测牙龈组织及根尖乳头细胞干细胞标记 物，证明具有干细胞的特性。
[0051] 一、实施健康和炎症牙龈间充质干细胞以及根尖牙乳头干细胞的制备
[0052] 1、细胞培养
[0053] 炎症和健康的牙龈组织以及根尖乳头组织通过上述途径获，并通过以下培养方法 获取干细胞：将患者的牙龈或或拔出的正畸牙放入无菌装有预冷PBS的离心管，4小时内 于无菌超净工作台中将牙龈组织或带有根尖牙乳头组织的牙齿取出，并用无菌刀片切取根 尖牙乳头组织，在含浓度梯度双抗的无菌PBS反复冲洗牙龈组织。于预加不完全培养液的 无菌玻璃培养皿中用眼科剪剪碎牙銀至1. 0_Χ 1. 0_Χ 1. 0mm的小块，收集于无菌离心管 中，加入3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml II型dispase酶各lml (相当于牙銀组织体积的10 倍以上），混合均匀置于37°C恒温水浴箱中消化40?60分钟，每隔5-10分钟摇晃一次，直 至牙龈组织变为散在的絮状，用含有10%优质胎牛血清的培养基终止消化。经l〇〇〇r/min 离心10min，弃掉上清，加入DMEM培养基吹打并且混合均匀，使用70 μ m筛孔内径的细胞筛 过滤，获得单细胞悬液。血球计数板进行细胞计数，以IX l〇5/ml的密度接种于25cm2的培 养瓶中，加入含20% FBS的DMEM完全培养液3ml，在37°C、5% C02、饱和湿度孵箱标准条件 下培养。3天后半量换液，之后每2-3天换液一次，逐日在倒置显微镜下观察细胞的生长状 况，当细胞生长至80%汇合状态下，用0. 25%胰蛋白酶按1:2消化传代。
[0054] 2、组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和LBH589的浓度确定
[0055] 首先，通过MTT方法确定TSA和LBH589的浓度。收集对数期健康的牙龈间充质 干细胞或根尖牙乳头干细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔100 μ 1，8000个/孔。 置37°C、5% C02温箱培养使细胞贴壁，培养12小时。加入浓度为0、20、50、100、200、400ηΜ 的TSA或浓度为0、10、20、50、100、200、500ηΜ的LBH589,继续培养48h，每组设定3个复孔。 小心吸去上清，加入90 μ 1新鲜培养液，再加入lOulMTT溶液，继续培养4h。吸去上清，每 孔加入llOul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪 测量各孔490nm的吸光度值（0D)。我们选取了最佳的浓度TSA(lOOnM)和LBH589(20、50、 100nM)。
[0056] 3、炎症和健康的间充质干细胞在组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA作用下的ALP染色 及碱磷酶活性检测
[0057] 将生长状况良好的纯化的第三代GMSC-H和GMSC-I以2 X 103/cm2的密度接种于6 孔板，待细胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液。实验组加入TSA使终浓度为ΙΟΟηΜ， 对照组加入等量DMS0。2天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞形态及矿化结节形成情 况。7d后行碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性检测，如图1所示，加入了 TSA后，发现健康 和炎症的牙龈间充质干细胞的ALP染色和ALP活性提高，说明其成骨能力增强。
[0058] 4、炎症和健康的间充质干细胞在组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA作用下的茜素红 染色和矿化结节分析
[0059] 将生长状况良好的纯化的第三代GMSC-H和GMSC-I以2 X 103/cm2的密度接种于6 孔板，待细胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液。实验组加入TSA使终浓度为ΙΟΟηΜ， 对照组加入等量DMS0。2天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞形态及矿化结节形成情 况，28天后行茜素红染色并进行定量分析。如图2所示，加入了 TSA后，发现健康和炎症的 牙龈间充质干细胞的茜素红染色及矿化钙结节增多，说明其成骨能力增强。
[0060] 5、RT-PCR检测TSA作用下的牙龈间充质干细胞的成骨相关基因 CON、RUNX2的表 达
[0061] 将生长状况良好的纯化的第三代GMSC-H和GMSC-I以2X 103/cm2的密度接种于6 孔板，待细胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液。实验组加入TSA使终浓度为ΙΟΟηΜ， 对照组加入等量DMS0。2天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞形态及矿化结节形成情 况，21天后裂解细胞进行0CN和RUNX2表达的检测；如图3所示，加入了 TSA后，发现健康 和炎症的牙龈间充质干细胞的成骨基因0CN和RUNX2提高。
[0062] 本研究所用引物：
[0063] GAPDH 上游 5, -GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3，
[0064] 下游 5, -AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3'
[0065] 产物长度413bp
[0066] RUNX-2 上游 5, -ACCAGATGGGACTGTGGTTACT-3'
[0067] 下游 5, -GGATTAAAAGGACTTGGTGCAG-3'
[0068] 产物长度393bp
[0069] 0CN 上游 5, -CATGAGAGCCCTCACA-3'
[0070] 下游 5, -AGAGCGACACCCTAGAC-3'
[0071] 产物长度283bp
[0072] 提取经过TSA药物处理过的健康和炎症的牙龈间充质干细胞总RNA，合成第一链 cDNA。取(λ 5mlPCR管，依次加入下列试剂：
[0073] cDXA 2 μ 1 Forward Primer (10 μ VI) 1 p 1 Reverse Primer (10 μ M) 1 μ 1 2 X TransTaq1'-] li Fi PCR Supcril i x 11 12, 5 μ 1 ddliO to 2δ μ I
[0074] PCR循环反应条件 预变性 94°C δ min 变性 9^0 SOisec 退火 58°C 30 sec 35 cycles
[0075] GAPDH 的扩增： J 延仲 72 °C 1 min 终未延伸 72Γ 10 min r增产物保# 4*C 预变性 94°C 5 min 变性 94 ? 30)sec 退火 56°C 30 fee 35 cycles
[0076] RUNX-2 的扩增： 一 延伸 72°C 1 min 终末延沖 72? 10 min 扩培产物fti# rc
[0077] 0CN的扩增：预变性 94V 5 min
[0078] 变n 9>rc 3(kscc jy火 WTC 30 pc 35 cycles 延伸 72? 1 rain 终未延仲 72Γ 10 min 忙始产物保# ++rc
[0079] 琼脂糖凝胶电泳成像分析，并检测扩增条带的产物含量，并进行统计学分析。如图 3所示，经过组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA药物处理过的健康及炎症牙龈间充质干细胞表 明，成骨相关基因 OCN和RUNX2明显增高，说明TSA可以促进牙龈间充质干细胞的成骨。
[0080] 二、LBH589促进根尖牙乳头干细胞的成骨分化
[0081] 1、LBH589促进根尖牙乳头干细胞的成骨分化。
[0082] 将生长状况良好的纯化的第三代根尖牙乳头干细胞以2X103/cm2的密度接种于 6孔板，待细胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液，设置未加入成骨诱导液的空白组 (A)，加入成骨诱导液DMSO(B)、成骨诱导加入DMSO(C)、成骨诱导加入LBH589 20nM(D)、成 骨诱导加入LBH58950nM(E)、成骨诱导加入LBH589 100nM(F)。2天换液一次，每天倒置显微 镜下观察细胞形态及矿化结节形成情况。7d后行碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性检测， 如图4所示，经不同浓度的LBH589作用后，较未加入药物干细胞成骨，明显增加；28天后进 行茜素红染色并进行定量分析，如图5所示经不同浓度的LBH589作用后，茜素红染色深，促 进成骨分化。
[0083] 2、实验性大鼠牙周炎模型的建立
[0084] 选用8周龄健康雄性SD大鼠，并只采用正畸Φ0. 20mm结扎圆丝结扎上颌第一磨 牙并及给予高糖饮食的方法建立大鼠牙周炎模型。如图6所示，为随机抽取的实验动物，处 死，通过观察可见牙槽骨明显吸收，成功的建立了大鼠牙周炎模型。
[0085] 3、体内牙龈注射曲古抑菌素 A (TSA)-壳聚糖缓释药物，可明显治疗大鼠牙周炎。
[0086] 三、TSA壳聚糖缓释系统制备：
[0087] 壳聚糖温敏体系的制备：称取2g壳聚糖粉末溶解在100mL浓度1 %醋酸溶液中， 配制成2 %壳聚糖溶液，移取一定体积的2 %壳聚糖溶液于试管中，按比例逐滴加入58 % β -甘油磷酸钠溶液，振荡混匀后，以少量NaOH稀溶液调节混合液的pH = 5。
[0088] TSA的DMS0溶液制备：称取TSA粉末0· lmg溶解于1L DMS0中，配制成100 μ g/L 溶液。
[0089] TSA壳聚糖缓释系统制备：将100 μ g/L的TSADMS0溶液溶液加入壳聚糖温敏体系 中，搅拌均匀，最终达到10 μ g/L浓度，常温保存。
[0090] 将32只大鼠分为4组：①空白对照组（blank组），未结扎的8只正常大鼠，以后 实验中不做处理；②盐水组（C0NT组），随机选取24只建模成功的大鼠中的8只，在以后实 验中注射生理盐水；③壳聚糖组（CHIT组），随机选取24只建模成功的大鼠中的8只，以后 实验中注射壳聚糖；④实验组（TSA组），随机选取24只建模成功的大鼠中的8只，实验中 注射曲古抑菌素 A-壳聚糖缓释药物系统。C0NT组、CHIT组、TSA组分别在建模成功后lw、 3w、5w通过口腔局部龈下注射给予不同的实验药物，给药后7w处死4组实验动物。
[0091] 治疗后各组大鼠牙槽骨情况如图7所示，A图为正常大鼠牙槽骨状况，没有牙周骨 丧失；B -D图各有不同程度的骨丧失；其中B、C两图显不骨丧失较明显，而D图显不骨丧失 较B、C明显轻微；统计学分析后显示TSA组与盐水组之间有明显的统计学差异（P < 0. 01)。
[0092] 给药后各组大鼠牙周袋探诊深度及变化情况，如图8所示，注射盐水组和壳聚糖 组与TSA组有明显的统计学差异，TSA可以减小牙周炎大鼠的牙周袋深度。
[0093] 牙周骨支持率（PBS)的检测，如图9-1所示，将各组大鼠上颌骨做MicroCT扫描， 在X线片上先取各点，A为根尖点，C为牙尖高点，B为AC连线与牙槽嵴顶线的交点。PBS =AB/ACX 100%。各组大鼠牙槽骨MicroCT图像显示如图9,表示TSA组与盐水组之间有 明显的统计学差异（P< 0.01)。
[0094] 结果分析
[0095] 1、组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA或LBH589促进间充质干细胞的成骨分化
[0096] 本发明中，利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和LBH589促进正常及炎症间充质干 细胞的成骨分化，增强相关成骨基因〇CN、RUNX2的表达。我们首先利用牙龈间充质干细胞 和根尖牙乳头干细胞，通过MTT细胞增殖及毒性试验摸索在培养基中加入TSA和LBH589的 适宜浓度，并通过碱磷酶染色及碱磷酶活性检测，茜素红染色及矿结节分析，RT-PCR检测相 关成骨基因〇CN、RUNX2的表达，说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和LBH589都能明显的促 进骨分化，利于骨组织再生。我们通过建立实验性大鼠牙周炎动物模型，并体内注射曲古抑 菌素 A (TSA)-壳聚糖缓释系统，发现该药物体内可降低牙周袋深度，增加骨支持率，促进骨 组织再生。
[0097] 本发明方法的优点及应用前景
[0098] 组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi)具有诱导细胞凋亡、分化和抑制增殖的活性， 目前其研究涉及众多肿瘤领域，包括血液系统肿瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺 癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌等，其并对肿瘤细胞具有高选择性和低毒的优点具有非常广阔的 应用前景。除了明确的抗肿瘤活性，HDACi还显示出免疫调节活性，体外实验表明HDACi可 抑制T淋巴细胞的活化、增殖及分泌细胞因子的能力，利用炎症性自身免疫性疾病动物模 型进行的研究也证实了其免疫抑制活性，但其潜在的机制有待进一步探索。HDACi通过在 转录后修饰组蛋白来调节基因转录和染色质装配，从而成为了某些疾病治疗的新靶点。虽 然HDACi介导免疫反应的潜在分子机制有待于进一步探索，但是其强有力的免疫调节活性 为治疗炎症免疫性疾病带来了希望。HDACi也被证明能够诱导细胞终末分化，体外研究已经 证实多种HDACi能够诱导干细胞或前体细胞骨向或神经向分化。
[0099] 组蛋白去乙酰化酶抑制剂主要通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性从而使组蛋白 乙酰化程度升高，进而引起染色质重组DNA转录活化或抑制，细胞周期停滞，细胞分化及细 胞凋亡等一系列生物学效应。局部应用组蛋白去乙酰化抑制剂可能会为牙周炎治疗开辟一 条新途径。HDACi也被证明能够诱导细胞终末分化，体外研究已经证实多种HDACi能够诱导 干细胞或前体细胞骨向或神经向分化。最近研究证明，HDACi通过提高成骨相关蛋白（如骨 桥蛋白、碱性磷酸酶、骨涎蛋白和骨涎蛋白等）的水平从而促进成骨。研究发现，组蛋白去 乙酰化酶抑制剂-VPA可以促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化。组蛋白去乙酰化酶-TSA 能够调节人脂肪干细胞（hASCs)中转录因子RUNX2的乙酰化作用，从而提高其成骨分化。组 蛋白去乙酰化酶抑制剂能用于牙周炎，种植体周围炎等疾病，促进骨组织再生。
【权利要求】
1. 一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备牙源性干细胞的成骨分化制剂中的应用，所述 组蛋白去乙酰化酶抑制剂为曲古抑菌素 A或帕比司他。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牙源性干细胞为牙龈间充质干细胞 或根尖牙乳头干细胞。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述曲古抑菌素 A的浓度为ΙΟΟηΜ。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述帕比司他的浓度为20nM、50nM或 ΙΟΟηΜ。
5. -种组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进牙源性干细胞的成骨分化的方法，其特征在于， 步骤如下 取第三代的正常和炎症牙龈间充质干细胞，以2X103/cm2的密度接种于6孔板，待细 胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液，加入TSA使终浓度为ΙΟΟηΜ，对照组加入等量 DMS0, 2天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞形态及矿化结节形成情况。
6. -种组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进牙源性干细胞的成骨分化的方法，其特征在于， 步骤如下 将生长状况良好的纯化的第三代根尖牙乳头干细胞以2X 103/Cm2的密度接种于6孔 板，待细胞融合达80 %后，更换培养基为成骨诱导液，加如梯度浓度为为20nM、50nM或 ΙΟΟηΜ的帕比司他，2天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞形态及矿化结节形成情况。
7. -种制备促进牙源性干细胞成分分化TSA壳聚糖缓释药物的方法，其特征在于：包 括如下步骤： ⑴壳聚糖温敏体系的制备：称取2g壳聚糖粉末溶解在100mL浓度1 %醋酸溶液中， 配制成2%壳聚糖溶液，移取一定体积的2%壳聚糖溶液于试管中，按比例逐滴加入58% β -甘油磷酸钠溶液，振荡混匀后，以少量NaOH稀溶液调节混合液的pH = 5 ; (2) TSA的DMS0溶液制备：称取TSA粉末0. lmg溶解于1L DMS0中，配制成100 μ g/L溶 液； (3) TSA壳聚糖缓释系统制备：将100 μ g/L的TSA DMS0溶液溶液加入壳聚糖温敏体系 中，搅拌均匀，最终达到10 μ g/L浓度，常温保存。
【文档编号】C12N5/0775GK104152407SQ201410287427
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】刘大勇, 高平, 贾智, 张旭, 肖蕊, 冯春月, 王月君 申请人:天津医科大学口腔医院