用于检测kras突变的引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于检测KRAS基因突变的引物和探针。本发明还提供一种使用本发明的引物和探针检测KRAS基因突变的方法及试剂盒。本发明提供的引物和探针可以抑制KRAS野生型的扩增及其与探针的结合，从而可以检测到1％以下的KRAS突变。
【专利说明】用于检测KRAS突变的引物和探针
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术及诊断研宄领域，涉及一种用于检测KRAS突变的引物和探 针，及利用该引物和探针检测样品中是否含有KRAS突变的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种-H-RAS、KRAS和N-RAS，分别定位在 11、12和1号染色体上。作为原癌基因的RAS基因被激活后就变成有致癌活性的癌基因， RAS基因通过突变而激活。
[0003] KRAS是在多种癌症中经历突变的RAS基因之一。KRAS基因可以是正常状态（称 为野生型）或异常状态（突变型）。正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活生长因子 等信号通路时，野生型的KRAS被活性生长因子等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的 KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后KRAS迅速失活。KRAS激活/失活效应 是受控的。突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无生长因子活化信号刺激下仍处于激活 状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。
[0004] 密码子12和13处的KRAS基因突变参与肿瘤发生，目前已经广泛使用KRAS基因突 变的鉴定作为癌症诊断，例如胰腺、结肠直肠和非小细胞肺癌。但是检测KRAS基因主要有 普通测序法和基于单纯分型探针的PCR，其中普通测序法的灵敏度为10% -30% (突变型/ 野生型Kras)，基于单纯分型探针的PCR灵敏度约为10%，很难检测到10%以下的Kras基 因突变。
【发明内容】
[0005] 本发明针对上述缺点，提供了一种用于检测KRAS基因突变所用的引物和探针，以 达到可以检测到1%以下的KRAS突变的目的。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：
[0007] -种用于检测KRAS基因突变的引物，包括：
[0008] -个正向引物，选自
[0009] Fl :GTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGA(SEQ ID NO :1)，
[0010] F2 ：TTATAAGGCC TGCTGAAAAT GACTG(SEQ ID NO ：2),
[0011] F3 ：GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTA(SEQ ID NO ：3),
[0012] F4 ：GGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTT(SEQ ID NO ：4),
[0013] F5 ：TAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO ：5)
[0014] F：6 ：GAAGTACAGTTCATTACGATACAC(SEQ ID NO ：6),
[0015] F7 ：GTTCATTACGATACACGTCTGC(S EQ ID N 0 ：7)；
[0016] 和一个反向引物，选自
[0017] Rl：CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCA(SEQ ID NO ：8)
[0018] R2 ：GAGAAACCTTTATCTGTATCAAAGAAT(SEQ ID NO ：9)
[0019] R3 ：CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC(SEQ ID NO ：10)
[0020] R4 ：TGTTGGATCATATTCGTCCACAAA(SEQ ID NO ：11)
[0021] R5 ：AAATGGTCAGAGAAACCTTTATCTG(SEQ ID NO ：12)
[0022] R6 ：GTCAGAGAAACCTTTATCTGTATC(SEQ ID NO ：13)
[0023] R7 :CAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAG(SEQ ID NO :14)。
[0024] 本发明还提供一种用于检测KRAS基因突变的探针，至少包括一个探针，
[0025] 选自（A)组或（B)组，其中每组探针包括对应12D、13D、12V、12C、12S、12A、12Rt 种突变的探针；
[0026] (A)
[0027] 12D：01 AGTTGGAGCTGATGGC (SEQ ID NO ：15)
[0028] 或02TTGGAGCTGATGGC(SEQ ID NO :16)，
[0029] 13D ：01 TAGCTGGTGACGTA(SEQ ID NO ：17)
[0030] 或02CTGGTGACGTAGGC(SEQ ID NO :18)，
[0031] 12V ：01 GTTGGAGCTGTTGGC(SEQ ID NO ：19)
[0032] 或02TTGGAGCTGTTGGC(SEQ ID NO :20)，
[0033] 12C：01 TTGGAGCTTGTGGCG(SEQ ID NO ：21)
[0034] 或02TTGGAGCTTGTGGC(SEQ ID NO :22)，
[0035] 12S：01 AGTTGGAGCTAGTGGC (SEQ ID NO ：23)
[0036] 或02TTGGAGCTAGTGGC(SEQ ID NO :24)，
[0037] 12A：01 TGGAGCTGCTGGC (SEQ ID NO ：25)
[0038] 或02TGGAGCTGCTGGCG(SEQ ID NO :26)，
[0039] 12R：01 GTTGGAGCTCGTGGC (SEQ ID NO ：27)
[0040] 或02TTGGAGCTCGTGGC(SEQ ID NO :28)，
[0041] ⑶
[0042] 12D 探针序列为 CCTACGCCATCAGCTCCAA(SEQ ID NO :29)，
[0043] 13D 探针序列为 CCTACGTCACCAGCTCCAA(SEQ ID NO :30)，
[0044] 12V 探针序列为 CCTACGCCAACAGCTCCAA(SEQ ID NO :31)，
[0045] 12R 探针序列为 CCTACGCCACGAGCTCCAA(S EQ ID N 0 :32)，
[0046] 12C 探针序列为 CCTACGCCACAAGCTCCAA(SEQ ID NO :33)，
[0047] 12A 探针序列为 CCTACGCCAGCAGCTCCAA(SEQ ID NO :34)，
[0048] 12S 探针序列为 CCTACGCCACTAGCTCCAA(SEQ ID NO :35);
[0049] 进一步，所述（A)组或（B)组探针的 5'端设有 Fam，Vic，he X，RoX，Texas red， Cy3, Cy5中的一种焚光物质，优选的，为Fam。
[0050] 优选的，所述（A)组探针的3'端设有MGBNFQ，对富含A/T模板区分更理想。
[0051] 优选的，所述（B)组探针的:V端设有BHQl。
[0052] 本发明还提供一种KRAS基因突变的检测方法，使用以下各项进行PCR反应，
[0053] 任意一个前述正向引物；
[0054] 任意一个前述反向引物；
[0055] 至少一个前述的探针，选择前述A组或B组探针中；
[0056] -个 blocker PNA，选自
[0057] PNAOl :GGAGCTGGTGGCGTA G(SEQ ID NO :36)，
[0058] 或 PNA02 :GGAGCTGGTGGCGT(SEQ ID NO :37)。
[0059] 优选的，使用一组探针，选自（A)组或（B)组，由于每组探针包括对应12D、13D、 12V、12C、12S、12A、12R七种突变的探针，因此可以检测待测样品中是否含有任意一种密码 子12或13处突变的突变型。
[0060] 本发明还提供一种检测KRAS基因突变的试剂盒，包括：
[0061] 任意一个前述正向引物；
[0062] 任意一个前述反向引物；
[0063] 至少一个前述的探针，选择前述A组或B组探针中；
[0064] 任意一个前述 blocker PNA。
[0065] 优选的，所述试剂盒包括一组探针，选自（A)组或（B)组。同样的由于每组探针包 括对应12D、13D、12V、12C、12S、12A、12R七种突变的探针，因此可以检测待测样品中是否含 有任意一种密码子12或13处突变的突变型。
[0066] 此外本发明还提供前述引物和探针在制备检测KRAS基因突变的试剂盒中的用 途。
[0067] 本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明提供的用于检测KRAS基因突变的引 物和探针可以有效抑制KRAS野生型的扩增及其与探针的结构从而检测到1 %以下的KRAS 突变型。
【专利附图】
【附图说明】
[0068] 图1是实施例1中八个待测目标基因荧光定量PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0069] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0070] 实施例1
[0071] 使用以下各项进行PCR反应。
[0072] (1)待测目标（即PCR反应中的DNA模板）
[0073] 配制八组待测目标，分别为1% 12DKRAS突变型+99%野生型，1% 13DKRAS突变 型+99%野生型，1%12￥1(狀5突变型+99%野生型，1%120(狀5突变型+99%野生型，1% 12SKRAS突变型+99%野生型，1% 12AKRAS突变型+99%野生型，1% 12RKRAS突变型+99% 野生型，100 %野生型和无模板对照组。
[0074] ⑵引物
[0075] 选择任意一个正向引物，本实施例中选择F1，
[0076] 选择任意一个反向引物，本实施例中选择R3，
[0077] (3)探针
[0078] 任意选择一组探针，本实施例中选择A组探针，其中探针5'端标荧光物质Fam， 3' 端为 M G B NFQ。
[0079] Fam为羧基焚光素，5-Fam，6-Fam均可选用，优选5-Fam。
[0080] MGB即小沟结合，N FQ即非荧光淬灭基团，本实施例的探针:V端探针上还连接有 MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右，从而使得探针可 以更短，节约成本并提高成功率；同时采用非焚光淬灭基团（Non-Fluorescent Quencher)， 本身不产生焚光，大大降低本底信号的强度。
[0081] 本实施例中选择如下探针：12D01，13D01，12V01，12C01，12S01，12A01，12R01。
[0082] (4) blocker PNA
[0083] 任意选择一个blocker PNA，本实施例中选择PNAOl。
[0084] 本实施例中PCR反应体系为50ul，具体的反应体系，如表1所示：
[0085]
【权利要求】
1. 一种用于检测KRAS基因突变的引物，包括 一个正向引物，选自 GTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGA(SEQ ID N0：1), TTATAAGGCC TGCTGAAAAT GACTG(SEQ ID NO ：2), GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTA(SEQ ID NO ：3), GGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTT(SEQ ID NO ：4), TAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO ：5) GAAGTACAGTTCATTACGATACAC(SEQ ID NO ：6), GTTCATTACGATACACGTCTGC(SEQ ID NO ：7)； 和一个反向引物，选自 CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCA(SEQ ID NO ：8) GAGAAACCTTTATCTGTATCAAAGAAT(SEQ ID NO ：9) CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC(SEQ ID NO ：10) TGTTGGATCATATTCGTCCACAAA (SEQ ID NO ：11) AAATGGTCAGAGAAACCTTTATCTG(SEQ ID NO ：12) GTCAGAGAAACCTTTATCTGTATC(SEQ ID NO ：13) CAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAG(SEQ ID N0:14)。
2. -种用于检测KRAS基因突变的探针，其特征在于，至少包括一个探针， 选自（A)组或（B)组，其中每组探针包括对应120、130、12乂、12(：、125、12六、121?七种突 变的探针； (A) 12D 探针序列为 AGITGGAGCTGATGGC(SEQ ID NO :15) 或 ITGGAGCTGATGGC(SEQ ID NO :16)， 13D 探针序列为 TAGCTGGTGACGTA(SEQ ID N0:17) 或 CTGGTGACGTAGGC(SEQ ID NO :18)， 12V 探针序列为 GTTGGAGCTGITGGC(SEQ ID N0:19) 或 ITGGAGCTGITGGC(SEQ ID NO :20)， 12C 探针序列为 ITGGAGCTTGTGGCG(SEQ ID N0:21) 或 ITGGAGCTTGTGGC(SEQ ID NO :22)， 12S 探针序列为 AGITGGAGCTAGTGGC(SEQ ID N0:23) 或 ITGGAGCTAGTGGC(SEQ ID NO :24)， 12A 探针序列为 TGGAGCTGCTGGC(SEQ ID N0:25) 或 TGGAGCTGCTGGCG(SEQ ID NO :26)， 12R 探针序列为 GTTGGAGCTCGTGGC(SEQ ID N0:27) 或 ITGGAGCTCGTGGC(SEQ ID NO :28)， (B) 12D 探针序列为 CCTACGCCATCAGCTCCAA(SEQ ID NO :29)， 13D 探针序列为 CCTACGTCACCAGCTCCAA(SEQ ID NO :30)， 12V 探针序列为 CCTACGCCAACAGCTCCAA(SEQ ID N0:31)， 12R 探针序列为 CCTACGCCACGAGCTCCAA(SEQ ID NO :32)， 12C 探针序列为 CCTACGCCACAAGCTCCAA(SEQ ID N0:33)， 12A 探针序列为 CCTACGCCAGCAGCTCCAA(S EQ ID N 0:34)， 12S 探针序列为 CCTACGCCACTAGCTCCAA(S EQ ID N 0:35)。
3. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述（A)组或（B)组探针的5'端设有 Fam，Vic，hex，Rox，Texas red，Cy3, Cy5 中的一种焚光物质。
4. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述（A)组探针的3'端设有MG B NFQ。
5. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述（B)组探针的3'端设有BHQ1。
6. -种KRAS基因突变的检测方法，其特征在于，使用以下各项进行PCR反应， 一个如权利要求1所述的正向引物； 一个如权利要求1所述反向引物； 至少一个如权利要求2-5任意一项所述的探针； 一个 blocker PNA，选自 GGAGC TGGT GGCGTA G(SEQ ID NO ：36), 或 GGAGCTGGTGGCGT(SEQ ID NO :37)。
7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使用一组探针，选自（A)组或（B)组。
8. -种检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： 一个如权利要求1所述的正向引物； 一个如权利要求1所述反向引物； 至少一个如权利要求2-5任意一项所述的探针； 一个 blocker PNA，选自 GGAGC TGGT GGCGTA G(SEQ ID NO ：36), 或 GGAGCTGGTGGCGT(SEQ ID NO :37)。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一组探针，选自（A)组 或⑶组。
10. 如权利要求1所述的引物或权利要求2所述的探针在制备检测KRAS基因突变的试 剂盒中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104498615SQ201510002856
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】吕宁, 陈一友 申请人:浙江诺辉生物技术有限公司