专利名称：中国明对虾Crustin基因和编码蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及Crustin，具体地说是一种中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)Crustin基因和编码蛋白及其克隆方法。
背景技术：
对虾养殖是一项重要的全球性经济产业，在海水养殖业中占有重要地位。但是由于近年来对虾病害的频频爆发，给对虾产值造成了重大损失。抗生素的使用大大遏制了对虾疾病的流行，提高了对虾产量。但随之引发的抗药性细菌的产生，环境的破坏以及对人类健康的危害日益受到人们的重视，从而寻求新型抗菌药物的要求显得日趋迫切。
与其他甲壳动物一样，对虾没有特异性免疫系统，然而它们拥有几种高效的抵御外来病原体入侵的非特异性免疫方式，包括细胞吞噬、包囊作用、凝集作用以及抗菌活性因子的合成与释放等。抗菌肽或抗菌蛋白作为一类广谱的天然抗菌活性物质，广泛分布于各种生物类群，是生物体非特异免疫的重要组分。对虾抗菌肽的研究开始于1997年，Destoumieux等首先从南美滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内分离到一种抑制革兰氏阳性菌和真菌的多肽，并命名为Penaeidin(Destoumieux D，Bulet P，LoewD，et al.A new family of antimicrobial peptides in the shrimpLitopenaeus vannamei(Decapoda).J Biol Chem，1997，27228398～28406)。另外两种抗菌蛋白Crustin(11.5-kDa的抗菌蛋白)和抗脂多糖因子(ALF，anti-LPS factor)的基因分别从南美滨对虾和斑节对虾(Penaeus monodon)的EST中被发现(Gross PS，Bartlett TC，Browdy CL，et al.Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis ofhemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp，Litopenaeus vannamei，and the Atlantic White Shrimp，L.setiferus.Dev Comp Immunol，2001，25565-577；Supungul P，Klinbunga S，Pichyangkura R，et al.Identification of Immune-Related Genes inHemocytes of Black Tiger Shrimp(Penaeus monodon).Mar Biotechnol(NY).2002，4(5)487-494)。Crustin最早从滨蟹(Carcinus maenas)体内被纯化得到(Relf J M，Chisholm J R S，Kemp G D，et al.Purificationand characterization of a cysteine-rich 11.5-kDa antibacterialprotein from the granular haemocytes of the shore crab，Carcinusmaenas Eur.J.Biochem.1999，264350-357)。这种蛋白有很强的抑制革兰氏阳性菌的活性，自身不易失活，甚至在被煮沸后仍能保持很高活性。Crustin分子中富含半胱氨酸，以及有半胱氨酸组成的分子内二硫键，使其结构非常稳定。对虾的Crustin分子量在12kDa左右，等电点在8.5左右，属阳离子多肽，蛋白结构、氨基酸组成以及抗菌活性等方面与Penaeidin非常类似，而与ALF相差较远。
和其他抗菌肽一样，Crustin的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗药性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新的抗生素的发现极其困难的情况下，Crustin为开发新的抗菌药物开辟了广阔的前景。总之，Crustin以及其他类型抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的应用潜力，因此，它已成为当今生物医药研究的热点之一。
发明内容
本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3’-RACE)以及5’端cDNA快速扩增(5’-RACE)的方法，对中国明对虾Crustin基因进行了研究，首次从中国明对虾中克隆到了一种抗菌活性较强的免疫因子Crustin基因，用于Crustin基因的重组表达和基因转移，并为对虾疾病防治和进一步开发为医药产品奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下中国明对虾Crustin基因具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；其克隆方法(1)从中国明对虾的血细胞中提取总RNA；(2)然后进行cDNA第一链合成；(3)根据中国明对虾EST序列设计引物进行PCR反应，得到对虾Crustin基因片段，正向引物F15’TCGGAGTCATTCTGTTCTGC 3’，反向引物R15’TCTCCCAGACACCTGTCG 3’；(4)又用一条特异性正向引物F25’GGCTGCTTACTGCTGCGAGAC3’，进行cDNA 3’末端快速扩增3’RACE；(5)然后用两条反向引物R15’TCTCCCAGACACCTGTCG 3’和R25’CAGCAGTAAGCAGCCCTC 3’，利用5’RACE进行Crustin cDNA 5’末端快速扩增；(6)最后通过拼接3’RACE和5’RACE所得结果获得全长基因片断。
另外，所述引物还可以为序列列表中SEQ ID No.1碱基序列片断。
本发明有如下优点1.采用本发明能够从中国明对虾血细胞中克隆得到一种Crustin基因(称为中国明对虾Crustin基因)；本发明对对虾Crustin基因的成功克隆和测序，首次搞清了它的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因(所以可以不用以上引物和方法)，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。
2.通过网上相似性和同源性检索，提示对虾Crustin可以抑制革兰氏阳性细菌生长。采用本发明使通过生物工程手段提高对虾抗病能力，阻止由某些病原微生物引起的对虾疾病的大规模爆发成为可能，从而能推动对虾养殖业的健康发展。另外Crustin与病原微生物的作用不会引起抗药性，有很大的药用开发的前景。
3.意义深远。通过本发明可深入了解对虾免疫机制，发现新型免疫marker，为对虾抗病品系选育以及对虾细菌性疾病的防治提供依据(为对虾，甚至人类的抗菌药物的开发提供了理论依据)。由于海洋生物的特殊性，海洋药物的开发已初具规模，对虾抗菌活性物质的研究有望为药物的开发和利用提供新的思路。
具体实施例方式
实施例1.一种克隆的中国明对虾Crustin基因，具有如下序列同系基因一(1)SEQ ID No 1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度487碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)(2)SEQ ID No.2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度130氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽序列描述SEQ ID No.11 A CTG GAG GCG ACC ATG AAG GGT CTC GGA GTC ATT CTG TTC TGC GTC 46Met Lys Gly Leu Gly Val Ile Leu Phe Cys Val 1147 CTG GCG GTG GCA TCG GCT CAG AGT AGG CAC GGC ATT CGA CCC GGA 9112 Leu Ala Val Ala Ser Ala Gln Ser Arg His Gly Ile Arg Pro Gly 2692 GGC TTC CCT GGT GGA TTT CCT GGA GGC TTC CCT AGC ATC ACA GCC 136
27Gly Phe Pro Gly Gly Phe Pro Gly Gly Phe Pro Ser Ile Thr Ala 41137 CCA CCC GCC ACC TGC AGG CGC TGG TGT CGA ACT CCA GAG AGG GCT 18142Pro Pro Ala Thr Cys Arg Arg Trp Cys Arg Thr Pro Glu Arg Ala 56182 GCT TAC TGC TGC GAG ACA AGC TTT GAA CCC GAG GCA CCC GTG GGC 22657Ala Tyr Cys Cys Glu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Pro Val Gly 71227 ACC AAG ATA CTT GAC TGC CCA CGA GTC CGT GAC ACC TGC CCA CCG 27172Thr Lys Ile Leu Asp Cys Pro Arg Val Arg Asp Thr Cys Pro Pro 86272 GTA CGT TTC GGT GGA CTA GCA CCA GTA ACC TGC TCC AGC GAC TAC 31687Val Arg Phe Gly Gly Leu Ala Pro Val Thr Cys Ser Ser Asp Tyr 101317 AAG TGC GGC GGC ATT GAC AAG TGC TGC TTC GAC AGG TGT CTG GGA 361102 Lys Cys Gly Gly Ile Asp Lys Cys Cys Phe Asp Arg Cys Leu Gly 116362 GAA CAC GTG TGC AAG CCG CCT TCC TTC TAT AAC TTT TTT AAC TGA 406117 Glu His Val Cys Lys Pro Pro Ser Phe Tyr Asn Phe Phe Asn407 AAA GGA AAT TTG GAA GTA ATT ACT GAT TCA ATG GAG AAT CCG TGA 451452 CTA ATA AAG TGT TTT CTC AAA AAA AAA AAA AAA AAA 487序列描述SEQ ID No.2MKGLGVILFCVLAVASAQSRHGIRPGGFPGGFPGGFPSITAPPATCRRWCRTPERAAYCCETSFEPEAPVGTKILDCPRVRDTCPPVRFGGLAPVTCSSDYKCGGIDKCCFDRCLGEHVCKPPSFYNFFN实施例2.中国明对虾Crustin基因的克隆方法1.总RNA提取用注射器从中国明对虾第一腹节基部腹窦取血淋巴，并加入等体积抗凝剂(27mM sodium citrate，336mM NaCl，115mM glucose，9mM EDTA，pH7；Rodriguez et al.，1995)。血淋巴在4℃，800g离心10min，收集血细胞用于RNA的提取；总RNA的提取使用上海博星生物公司的Unizol RNA提取试剂，提取方法参照使用说明书。
2.cDNA第一链合成据上海生工生物工程技术服务有限公司cDNA合成试剂盒说明书进行。
3.对虾CrustincDNA片段克隆(1)根据cDNA文库大规模测序所得EST序列设计引物，用于PCR扩增，得到对虾Crustin基因片段；正向引物F15’TCGGAGTCATTCTGTTCTGC 3’，反向引物R15’TCTCCCAGACACCTGTCG3’，
聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件10xTaq DNA聚合酶缓冲液5μl模板cDNA 1μlMgCl24μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP)4μlExTaq DNA聚合酶 0.25μl灭菌水33.75μlPCR反应程序为94℃预变性4min，然后进入下列循环94℃ 40s，56℃ 45s，72℃ 60s，35个循环，最后72℃延伸10min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)反应产物纯化利用德国QIAGEN公司产品(QIAquick GelExtraction Kit)，操作步骤按产品说明书进行。
(3)基因片断的克隆纯化的PCR产物与pMD 18-T载体连接，转化TOP 10菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，以F2、R2为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。
4.Crustin cDNA 3’端快速扩增(3’-RACE)根据得到的Crustin基因片段序列，又设计一条特异性正向引物F25’GGCTGCTTACTGCTGCGAGAC 3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’-RACE试剂盒说明书进行。
取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的配制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F2与3’接头引物AOLP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)16(A/C/G)3’，进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。
5.Crustin cDNA 5’端快速扩增(5’-RACE)(1)第一链cDNA合成以RNA为模板，R1为引物进行反转录得到第一链cDNA。反应体系为20μl无RNase水9μl，1.5μg/μl DNase处理过的总RNA 2μl，10pmol/LR1引物1μl，5×反转录酶buffer 4μl，10pmol/μL dNTPs 2μl 40U/μlRNase inhibitor 1μl，200U/L M-MLV Reverse Transcriptase 1μl。反应条件先将无Rnase的超纯水、RNA和引物加入薄壁管，70℃ 6min使RNA变性，冰上放置5min。然后依次加入反转录buffer、dNTPs、RNase inhibitor和反转录酶，42℃温浴2h，95℃ 5min使反转录酶失活。
(2)加尾反转录产物用ConcertTMRapid PCR Purification System纯化，除去未结合引物及酶。纯化后的cDNA用TdT酶(Promega公司产品)和dATP加尾，连接dA多聚核苷酸，方法参考试剂盒说明书。
(3)第一轮PCR扩增模板用上述加尾cDNA，正向引物为AOLP，逆向引物为R1，其余试剂与上述PCR反应相同；反应条件为94℃4分钟，然后进入下列循环94℃40s，55℃45s，72℃60s，25个循环，最后72℃延伸10min。
(4)嵌套式PCR以20倍稀释的第一轮PCR产物为模板，进行第二轮扩增，正向引物为AP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’，逆向引物为R25’CAGCAGTAAGCAGCCCTC 3’；反应体系同前，反应条件采用Touchdown程序1个循环，94℃，4min；10个循环94℃40s，65℃，30s(每个循环温度降低0.5℃)，72℃60s；25个循环94℃40s，57℃40s，72℃60s；最后72℃延伸10min。
(5)反应产物纯化、克隆和测序同前。
(6)根据3’序列和5’序列的共有部分进行Crustin cDNA全长拼接。
6.Crustin cDNA序列验证根据拼接得到的对虾Crustin cDNA全序列的5’和3’端特异性序列，设计1对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。
通过网上相似性和同源性检索，提示对虾Crustin可以抑制革兰氏阳性细菌生长。Crustin的分子量较小，不会引起人体产生免疫反应，不会引起抗药性，二硫键含量高，分子结构稳定，有很大的药用开发的前景，或者用于对虾病的防治。
另外，所述引物(F1，F2，R1和R2)还可以采用序列列表中SEQ ID No.1碱基序列片断。
Crustin基因SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120>中国明对虾Crustin基因和编码蛋白及其克隆方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>487<212>DNA<213>中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)<220>
<221>CDS<222>(14)..(403)<223>
<400>1actggaggcg acc atg aag ggt ctc gga gtc att ctg ttc tgc gtc ctg49Met Lys Gly Leu Gly Val Ile Leu Phe Cys Val Leu1 5 10gcg gtg gca tcg gct cag agt agg cac ggc att cga ccc gga ggc ttc 97Ala Val Ala Ser Ala Gln Ser Arg His Gly Ile Arg Pro Gly Gly Phe15 20 25cct ggt gga ttt cct gga ggc ttc cct agc atc aca gcc cca ccc gcc 145Pro Gly Gly Phe Pro Gly Gly Phe Pro Ser Ile Thr Ala Pro Pro Ala30 35 40acc tgc agg cgc tgg tgt cga act cca gag agg gct gct tac tgc tgc 193Thr Cys Arg Arg Trp Cys Arg Thr Pro Glu Arg Ala Ala Tyr Cys Cys45 50 55 60gag aca agc ttt gaa ccc gag gca ccc gtg ggc acc aag ata ctt gac 241Glu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Pro Val Gly Thr Lys Ile Leu Asp65 70 75tgc cca cga gtc cgt gac acc tgc cca ccg gta cgt ttc ggt gga cta 289Cys Pro Arg Val Arg Asp Thr Cys Pro Pro Val Arg Phe Gly Gly Leu80 85 90gca cca gta acc tgc tcc agc gac tac aag tgc ggc ggc att gac aag 337Ala Pro Val Thr Cys Ser Ser Asp Tyr Lys Cys Gly Gly Ile Asp Lys95 100 105tgc tgc ttc gac agg tgt ctg gga gaa cac gtg tgc aag ccg cct tcc 385Cys Cys Phe Asp Arg Cys Leu Gly Glu His Val Cys Lys Pro Pro Ser110 115 120ttc tat aac ttt ttt aac tgaaaaggaa atttggaagt aattactgat 433
Crustin基因Phe Tyr Asn Phe Phe Asn125 130tcaatggaga atccgtgact aataaagtgt tttctcaaaa aaaaaaaaaa aaaa 487<210>2<211>130<212>PRT<213>中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)<400>2Met Lys Gly Leu Gly Val Ile Leu Phe Cys Val Leu Ala Val Ala Ser1 5 10 15Ala Gln Ser Arg His Gly Ile Arg Pro Gly Gly Phe Pro Gly Gly Phe20 25 30Pro Gly Gly Phe Pro Ser Ile Thr Ala Pro Pro Ala Thr Cys Arg Arg35 40 45Trp Cys Arg Thr Pro Glu Arg Ala Ala Tyr Cys Cys Glu Thr Ser Phe50 55 60Glu Pro Glu Ala Pro Val Gly Thr Lys Ile Leu Asp Cys Pro Arg Val65 70 75 80Arg Asp Thr Cys Pro Pro Val Arg Phe Gly Gly Leu Ala Pro Val Thr85 90 95Cys Ser Ser Asp Tyr Lys Cys Gly Gly Ile Asp Lys Cys Cys Phe Asp100 105 110Arg Cys Leu Gly Glu His Val Cys Lys Pro Pro Ser Phe Tyr Asn Phe115 120 125Phe Asn130
权利要求
1.一种中国明对虾Crustin基因，其特征在于具有SEQ ID No.1所示的碱基序列。
2.一种权利要求1所述中国明对虾Crustin基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一种权利要求1所述中国明对虾Crustin基因的克隆方法，其特征在于1)从中国明对虾的血细胞中提取总RNA；2)然后进行cDNA第一链合成；3)采用下列引物进行PCR反应，得到对虾Crustin基因片段，正向引物F15’TCGGAGTCATTCTGTTCTGC 3’，反向引物R15’TCTCCCAGACACCTGTCG 3’；(4)又用一条特异性正向引物F25’GGCTGCTTACTGCTGCGAGAC3’，进行cDNA 3’端快速扩增3’RACE；(5)然后用两条反向引物R15’TCTCCCAGACACCTGTCG 3’和R25’CAGCAGTAAGCAGCCCTC 3’，利用5’RACE进行对Crustin cDNA 5’端克隆；(6)最后通过拼接3’RACE和5’RACE所得结果获得全长基因片断。
4.按照权利要求3所述中国明对虾Crustin基因的克隆方法，其特征在于步骤(3)(4)(5)中所述引物为SEQ ID No.1碱基序列片断。
全文摘要
本发明涉及Crustin，具体地说是一种中国明对虾Crustin基因及其克隆方法；它具有序列表中SEQ ID No.1碱基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；克隆方法包括1)从中国明对虾的血细胞中提取总RNA；2)进行cDNA第一链合成；3)利用3’－RACE和5’－RACE克隆得到对虾Crustin基因。本发明首次从中国明对虾血细胞中克隆到了1种Crustin基因，搞清了它的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，使通过生物工程手段阻止由某些病原微生物引起的对虾疾病的大规模爆发成为可能，为对虾，甚至人类的抗菌药物的开发提供了理论依据。
文档编号C07K14/435GK1654656SQ20051004566
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月14日 优先权日2005年1月14日
发明者相建海, 柳峰松, 李富花, 董波 申请人:中国科学院海洋研究所