一个影响山羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及一个影响山羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用。

背景技术：

黑素皮质素受体-4（Melanocortin receptor-4,MC4R）是动物下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质，是黑素皮质素受体家族5个亚型之一，它属于G蛋白偶联受体超级家族，为跨膜神经受体。在哺乳动物中，MC4R具有介导Leptin蛋白的功能，是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子。MC4R通过与其内源性配体黑素皮质素激素或刺鼠色蛋白和agouti相关蛋白相结合，从而在控制食欲和体重稳态中起关键作用。1993年，Gantz等最先克隆出人的MC4R基因，并用荧光标记原位杂交法将其定位于人18号染色体上。1997年，Huszar等首次证明了MC4R在能量平衡中的关键作用，即遗传敲除MC4R基因的小鼠出现遗传性肥胖，表现多食、肥胖、胰岛素分泌过多等症状。

2000年Kim等发现发现猪MC4R基因外显子第892bp处存在1个G→A错义突变，该突变致使TaqⅠ酶切位点发生改变，并导致MC4R蛋白的第298位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺(Asp298Asn),在5个商业品系猪群中，该突变位点与部分品系的生长速度、采食量及背膘厚显著关联，其中AA基因型具有显著提高日增重、采食量和背膘厚的效应。Jokubka等进一步证明了在立陶宛白猪中MC4R基因Asp298Asn变异位点的A等位基因具有显著提高日增重、瘦肉率和降低背膘厚的效应。李星润等研究结果显示MC4R基因Asp298Asn位点确实与某些品种猪的生长性状显著关联,但在不同品种中,该位点的具体效应可能有所不同。L.Fontanesl等分析了意大利长白猪MC4R基因6个SNPs位点与生产性能的关系，结果证实Asp298Asn变异位点与背膘厚和料肉比等性状显著相关。刘桂兰等采用了PCR-RFLP技术分析了MC4R基因部分片段在猪资源家系群体中Asp298Asn位点的多态性分布，结果表明，MC4R基因型频率在不同品种群体中有不同分布，与猪胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、平均背膘、眼肌面积、皮率呈显著相关。

刘洪瑜等通过对西门塔尔牛、日本和牛、皖东黄牛、皖南牛和广丰牛MC4R基因的1069C>G检测，发现该突变位点不同基因型个体的体斜长在西门塔尔牛群体中存在显著差异，体斜长和胸围在皖东黄牛群体中存在显著差异，因此可以把MC4R基因作为肉牛生长发育的辅助选择的分子标记。李天科发现牦牛MC4R基因外显子3处的多态位点437(G/A)与牦牛的体高、体长、体重和胸围显著相关，对牦牛的生长性状有影响。

仇雪梅等发现鸡MC4R基因5’调控区（-524nt）和编码区(61nt、315nt、336nt)上的4个突变位点对鸡的体重、屠体性状有显著影响。霍明东等发现MC4R基因编码区G315T的核苷酸变异影响鸡体重和胸肌生长,陶勇等发现京海黄鸡MC4R基因编码区662处发生G→C突变，第733～734位间插入1个C碱基，检测结果表明2处突变与京海黄鸡的体重、体尺及屠宰等性状均有相关性,对某些性状的影响甚至达到显著或极显著水平。张超运用技术结合基因测序的方法对鸭MC4R基因CDS区进行了多态性检测，发现了197bp处发生了T/A的单碱基突变，并使第66位氨基酸由缬氨酸变成谷氨酸，属错义突变，酶切后产生了TT、TA、AA三个基因型。此突变对鸭肌内脂肪的沉积具有一定的正向调控作用。蒋美山等对兔MC4R基因237bp处A/G突变研究显示此位点显著影响兔体重、全净膛重以及饲料转化率。张轶博等发现比格犬MC4R基因226bp处的C/A变异与体重显著相关。

张菊等成功克隆了绵羊的MC4R基因的cDNA序列，张子军等克隆了安徽白山羊MC4R基因的编码区和部分5’、3’非编码区序列，曲海娥等克隆得到了绒山羊MC4R基因的DNA及cDNA片段。曾献存等发现中国美利奴羊MC4R基因编码区存在G894C点突变（MC4R-3位点），3'侧翼区存在1223G、G1229A、和T1307G3个点突变（MC4R-4位点）。通过不同基因型与绵羊生长性状关联分析表明，3’侧翼区3个突变位点导致的不同基因型对中国美利奴羊腰角宽和体斜长有显著影响（p＜0.05），而对其它性状无显著影响；BB基因型个体体斜长最大，显著高于AB、AC和BC基因型个体（p＜0.05）。王春玲等发现湖羊MC4R基因548处存在C→T错义突变，导致氨基酸由丝氨酸突变为甲硫氨酸，该位点与湖羊2月龄体质量和4月龄体长显著相关，CT基因型2月龄体质量显著高于TT基因型，4月龄体长显著高于CC型，且极显著高于TT基因型。Song等对湖羊MC4R基因多态性进行研究，发现其3'非编码区的4个SNPs(g.1016G/A、1240T/C、1264G/A和1325A/G)均与45d断奶体质量显著相关。张高振发现MC4R基因3'非编码区的2个SNPs（G1229A、A1440T）与湖羊断奶重均表现为极显著相关。已有研究显示波尔山羊MC4R基因的C986T突变其六月龄体质量和六月龄日增质量均极显著相关(p＜0.01)，与其周岁龄体质量和周岁日增质量均显著相关(p＜0.05)，但MC4R基因502位点多态性及其与山羊早期生长的相关性还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服山羊育种中生长性状表型选择准确性低，遗传进展慢的缺陷，提供一种山羊生长性状的MC4R基因分子标记选择方法，用于山羊分子育种，可以提高山羊生长性状选择的准确性，加快山羊新品种培育进程。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个影响山羊早期体重的分子标记，所述分子标记位于山羊MC4R基因502位点，且具有A/G多态性，AA型山羊早期体重高于GG型山羊早期体重。

本发明所述的早期体重指山羊3月龄及之前的体重。

本发明所述的分子标记在山羊分子育种中的应用。

一种用于检测本发明所述的分子标记的引物对，上游引物P1如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物P2如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的引物对在山羊分子育种中的应用。

一种检测本发明所述的分子标记的方法，包含PCR扩增山羊基因组中含有本发明所述的分子标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读山羊MC4R基因502位点的A/G多态性。

一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，包括利用本发明所述的引物对PCR扩增山羊基因组中含有本发明所述的分子标记的一段序列，利用BseJI限制性内切酶对所述的扩增产物进行酶切、电泳分型，获得513bp、245bp两个片段的定义为AA型，获得758bp、513bp、245bp三个片段的定义为AG型，获得758bp片段的定义为GG型。

一种筛选早期快速生长山羊品系的方法，包括检测山羊MC4R基因502位点的多态性，选择AA型个体留种。

本发明所述的方法，优选包括以下步骤：

1）提取山羊基因组DNA；

2）利用权利要求3所述的引物对PCR扩增MC4R基因编码区序列（序列NM_001285591.1），得到758bp扩增产物；

3）利用BseJI限制性内切酶对所述的扩增产物进行酶切、电泳分型，获得513bp、245bp两个片段的定义为AA型，获得758bp、513bp、245bp三个片段的定义为AG型，获得758bp片段的定义为GG型；

4）选择AA型个体留种。

其中，所述PCR扩增的反应总体系优选为20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.4μL，引物P1和P2各6pmol，25mM的MgCl₂ 1.2μL，10×缓冲液2μL，加灭菌双蒸水至20μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54-58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。

所述酶切的反应体系优选为10-16μL，PCR产物3-5μL，10U/μL BseJI酶0.2-0.5μL，10×缓冲液1.0-1.6μL，补充灭菌双蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。

有益效果

山羊生长性状是一个重要的经济性状，属于数量性状，传统的表型选择准确性低，且表型值需要在山羊成年后才能逐步表现出来，周期很长，无法进行超早期选择，遗传进展缓慢。本发明采用PCR-RFLP方法检测MC4R基因502A/G BseJI酶切位点的多态性，并将基因型与波尔山羊的早期体重进行关联分析，发现MC4R基因502A/G位点AA型山羊初生重、一周龄、二周龄、三周龄、一月龄、二月龄、三月龄重均高于GG型山羊；并且在一周龄、二周龄、二月龄、三月龄达到显著水平（p＜0.05）。该多态位点可用于波尔山羊生长的辅助选择，提高选择的准确性，同时可以在波尔山羊出生时就通过检测基因型进行选择，加快育种进程，降低育种成本。不仅对进一步提高波尔山羊生长性状有重要的实际意义，而且对以波尔山羊为素材开展的新品种（系）培育具有重要的实践价值。

附图说明

图1波尔山羊MC4R基因502A/G突变位点测序图

图2波尔山羊MC4R基因502A/G突变位点电泳分型图

如图所示：泳道M为DL2000marker，AA、AG、GG分别表示波尔山羊MC4R基因PCR扩增产物经BseJI酶切后分为AA、AG、GG基因型。

具体实施方式

下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法，内切酶和荧光定量PCR试剂购自大连宝生物有限公司，高纯总RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其余试剂购自南京生兴生物技术有限公司。

实施例1、山羊早期生长的MC4R基因502A/G分子标记选择方法

材料与方法：

（一）羊群

163只波尔山羊样本由江苏省农业科学院六合动物实验基地统一饲养管理，营养以及管理水平保持一致。其体重资料均由江苏省农业科学院六合动物实验基地提供。

（二）方法

1、样品采集

每个个体采集耳组织样，置冰桶中带回实验室，-20℃保存。

2、DNA的提取

采用常规酚、氯仿法提取DNA，采用电泳及测定OD₂₆₀/₂₈₀检测DNA质量。

3、含MC4R基因502位点序列的扩增

根据序列NM_001285591.1，利用Primer Primer 5设计一对特异性引物(序列为P1：AATCCAAGATGAACTCTACCCA（SEQ ID NO.1），P2：CAGGATGGTCAGCGTGAT（SEQ ID NO.2）)，PCR扩增波尔山羊MC4R基因502位点序列。

PCR扩增的反应总体系为20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.4μL，引物P1和P2各6pmol，25mM的MgCl₂ 1.2μL，10×缓冲液2μL，加灭菌双蒸水至20μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54-58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。

4、PCR扩增产物的BseJI酶切分型。酶切的反应体系为10-16μL，PCR产物3-5μL，10U/μLBseJI酶0.2-0.5μL，10×缓冲液1.0-1.6μL，补充灭菌双蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，EB染色，凝胶成像系统拍照。

5、MC4R基因502A/G位点不同基因型波尔山羊早期体重的差异显著性分析，采用SPSS 11.5中的One-way ANOVA方法进行。

（三）结果与分析

1、MC4R基因502A/G位点BseJI酶切多态性

163个样本的PCR扩增产物经BseJI酶切出现3种基因型（图1），获得513bp、245bp两个片段的定义为AA型；获得758bp、513bp、245bp三个片段的定义为AG型，获得758bp片段的定义为GG型。

2、MC4R基因502A/G位点不同基因型波尔山羊早期体重差异显著性分析

采用单因素方差分析比较不同基因型羊群间早期体重的差异发现，AA型山羊初生重、一周龄、二周龄、三周龄、一月龄、二月龄、三月龄重均高于GG型山羊；并且在一周龄、二周龄、二月龄、三月龄达到显著水平（p＜0.05）（表1）。

表1 MC4R基因502位点不同基因型波尔山羊早期体重

注:同行不同大写字母上标表示差异极显著(p＜0.01)，同行不同小写字母上标表示差异显著(p＜0.05)。

综合分析以上结果可以看出，AA型山羊在早期生长方面具有优势，该位点可以作为山羊早期生长性状选择的分子标记，在留种时选择AA型个体。

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一个影响山羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物P1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物P2

<400> 2

caggatggtc agcgtgat 18