-R :5'-GCATAAAGCGTTTGCGGTAC-3' 〇
[0198] IL-Iβ -F :5'-ACGAATCTCCGACCACCA-3' ；
[0199] IL-Iβ -R :5'-GGACCAGACATCACCAAGC-3'。
[0200] 结果如图3中A所示。
[0201] 图3Α中的NTC组均表示的是在之后的步骤中加入上述IL 1- α的NTC组。
[0202] 收集各组细胞的上清液，利用Human IL-I β immunoassay检测试剂盒检测各组细 胞IL-I β的分泌水平。
[0203] 其中，上述的NTC组又分别设如下各组：
[0204] hFLS-No target (NTC+)阴性对照组：hFLS-No target (NTC)阴性对照组在之后的 步骤中加入上述IL l-α。
[0205] hFLS-No target (NTC-)阴性对照组：hFLS-No target (NTC)阴性对照组在之后的 步骤中不加入上述IL l-α。
[0206] 293T-No target (NTC+)阴性对照组：293T-No target (NTC)阴性对照组在之后的 步骤中加入上述IL l-α。
[0207] 293T-No target (NTC-)阴性对照组：293T-No target (NTC)阴性对照组在之后的 步骤中不加入上述IL l-α。
[0208] 结果如图3中B所示。
[0209] 图3A和B表明，分别与NTC或NTC+相比，siRNA-RB-04实验组在293T或hFLS细 胞中均能有效抑制TNF、C0X-2和IL-I β多种炎症因子的基因表达，并抑制IL-I β的分泌， 其中在hFLS细胞中对IL-I β的基因抑制率达到89%。
[0210] 实施例3、同源寡聚核酸对ADAMTS-5基因抑制效果的验证
[0211] 为验证同源比率对siRNA-RB-04抑制ADAMTS-5基因效果的影响，进行以下三组实 验：
[0212] -、第一组实验
[0213] 第一组的 siRNA 反义链均为 "5' -AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3' "，正义链为 ''5' -GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3' " 的同源序列，如表 1 所示。
[0214] 表1反义链组
【主权项】
1. 一种化学修饰的双链SiRNA分子，是由如下A所示的SiRNA分子中至少一条链经过 如下（1)-(13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子： A、一种siRNA分子，为如下1)或2)所不： 1. SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA 分子； 2. SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上同源性 的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1 所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； (1) 磷酸骨架的硫代磷酸修饰； (2) 核糖或脱氧核糖的2' -甲氧基修饰； (3) 核糖或脱氧核糖的2' -氟修饰； (4) 锁核酸修饰； (5) 开环核酸修饰； (6) 吲哚修饰； (7) 碱基的5 -甲基胞嘧啶修饰； (8) 碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰； (9) 单链5'末端胆固醇修饰； (10) 单链3'末端半乳糖修饰； (11) 单链5'末端多肽修饰； (12) 单链5'末端磷酸化修饰； (13) 单链5'末端焚光标记修饰。
2. 根据权利要求1所述的化学修饰的双链siRNA分子，其特征在于：所述化学修饰后 互补而成的双链siRNA分子的正义链和反义链分别具有如下Bl和Cl所示的序列： β1、5'-K-LLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT-3 ' ； CU5' -R-MQLAUGCCCACAUAAAQPPdTdT-3,； 所述K为无修饰或5'末端胆固醇修饰； 所述R为5'末端磷酸化修饰； 所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸； 所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核 糖的2' -甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的胞嘧啶脱氧 核糖核苷酸和核糖的2' -甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸； 或， 所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的鸟 嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的腺嘌呤脱 氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的胞嘧啶脱氧核糖 核苷酸和核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的尿嘧啶核糖核苷酸。
3. -种siRNA分子，为如下⑴或⑵所不： (1) SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA 分子； (2) SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1 所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子。
4. 根据权利要求3所述的siRNA分子，其特征在于：所述与SEQ ID No. 2所示的RNA单 链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的 RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No. 3所示的单链和SEQ ID No. 4所示的单 链互补而成的双链siRNA分子。
5. -种能产生权利要求3所述的siRNA分子的DNA分子。
6. -种化学修饰的双链siRNA分子组合物，该组合物含有如下（1)和（2)所示的双链 siRNA分子： (1) 权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子中至少一种双链siRNA分子； (2) 如下A'或B'所示的双链siRNA分子中至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化 学修饰后互补而成的双链siRNA分子中至少一种双链siRNA分子： A'、SEQ ID No. 7所示的RNA单链和SEQ ID No. 8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA 分子； B'、SEQ ID No. 8所示的RNA单链和与SEQ ID No. 7所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，SEQ ID No. 7所示的RNA单链和与SEQ ID No. 8所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，与SEQ ID No. 7所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 8 所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 1) 磷酸骨架的硫代磷酸修饰； 2) 核糖或脱氧核糖的2' -甲氧基修饰； 3) 核糖或脱氧核糖的2' -氟修饰； 4) 锁核酸修饰； 5) 开环核酸修饰； 6) 吲哚修饰； 7) 碱基的5 -甲基胞嘧啶修饰； 8) 碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰； 9) 单链5'末端胆固醇修饰； 10) 单链3'末端半乳糖修饰； 11) 单链5'末端多肽修饰； 12) 单链5'末端磷酸化修饰； 13)单链5'末端焚光标记修饰。
7. -种siRNA分子组合物，含有如下H所示的siRNA分子中的至少一种分子和如下I 所示的siRNA分子中的至少一种分子： H为权利要求3或4所述的siRNA分子中的至少一种siRNA分子； I为如下⑴和/或⑵所示的siRNA分子中的至少一种siRNA分子： (1) SEQ ID No. 7所示的RNA单链和SEQ ID No. 8所示的RNA单链互补而成的双链siRNA 分子； (2) SEQ ID No. 8所示的RNA单链和与SEQ ID No. 7所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，SEQ ID No. 7所示的RNA单链和与SEQ ID No. 8所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，与SEQ ID No. 7所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 8 所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子。
8. -种能产生权利要求7所述的siRNA分子组合物的DNA分子。
9. 一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子、权 利要求3或4所述的siRNA分子、权利要求5所述的DNA分子、权利要求6所述的化学修饰 的双链siRNA分子组合物、权利要求7所述的siRNA分子组合物和/或权利要求8所述的 DNA分子。
10. 权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子、权利要求3或4所述的siRNA 分子、权利要求5所述的DNA分子、权利要求6所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、 权利要求7所述的siRNA分子组合物、权利要求8所述的DNA分子和/或权利要求9所述 的试剂盒在制备预防和/或治疗炎症的产品中的应用； 所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎； 或， 权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子、权利要求3或4所述的siRNA分 子、权利要求5所述的DNA分子、权利要求6所述的化学修饰的双链siRNA分子组合物、权 利要求7所述的siRNA分子组合物、权利要求8所述的DNA分子和/或权利要求9所述的 试剂盒在制备如下W1-W5任一所示的产品中的应用： W1、抑制关节表面纤维化的产品； W2、抑制软骨侵蚀的产品； W3、预防和/或治疗滑膜炎的产品； M、保护软骨和/或滑膜的产品； W5、预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品。
【专利摘要】本发明公开了一种抑制ADAMTS-5基因的siRNA及其应用。本发明公开一种化学修饰的双链siRNA分子，是由如下A所示的siRNA分子中至少一条链经过如下(1)-(13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子。本发明公开的siRNA可以作为关节炎及相关炎症的治疗药物，可通过骨关节腔局部注射siRNA及其制剂抑制炎症因子表达实现对关节炎症的治疗。
【IPC分类】A61P19-02, C12N15-113, A61K31-713, A61P29-00
【公开号】CN104560999
【申请号】CN201410828587
【发明人】张必良, 米其·托尔托雷, 王喆, 杨秀群, 王秋云
【申请人】广州市锐博生物科技有限公司, 中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月25日