收PCR产物，然后回 收产物与载体pMD18_T(Takara公司）连接，转化至大肠杆菌co/iDH5a (Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB平板培养基（LB平板培养基配方为胰 蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L)中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行 RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒； e. 重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用和AbtI(NewEnglandBiolabs，NEB) 限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在600bp的目的条带，与经同样酶切的 pET28(a)原核表达载体酶切产物连接，转化co/iDH5a，PCR筛选阳性克隆， 经测序鉴定获得编码框正确的表达载体PET28 (a)-BPIN重组质粒； f.重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒（Omega公司）纯化阳性菌株重组质粒pET28 (a)-BPIN，转化到表达宿主BL21 (DE3) (Novagen公司）获得的阳性菌株，将阳性菌株再接 种到卡那霉素浓度为50ug/mL的LB培养液中，37 °C、200r/min振荡培养至菌液0D_的值 为0. 4-0. 6时，加入异丙基--D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)使其终浓度为1mmol/L，37 °〇诱导表达3-6h，收集菌液，经12000r/min离心5min，弃上清液，获得细菌沉淀物； (2)重组蛋白的纯化与复性 a. 蛋白纯化：将100mL细菌沉淀物用10mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，去上清液，用5mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清，再次 12000rpm离心 20min，取上清液；取 1mLNi-NTASefinose?Resin(上海生工，编号： BSP033)上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与上柱的Ni-NTA Sefinose?Resin混合，4°C混匀1h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋白洗涤 液洗涤介质，每次10mL，洗脱10次后；加入1mL变性蛋白洗脱液浸泡10min，收集洗脱 液，重复洗脱5次，收集每次洗脱液合并，取洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋白条带进行 鉴定，获得目的蛋白重组刺参BPIN末端结构域蛋白； b. 蛋白复性：将纯化后的重组刺参BPIN末端结构域蛋白分别用透析液Bufferl、透析 液Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6_18h，最后，4°C12000r/min离心30min，收 集沉淀，即为重组刺参BPI基因工程菌，溶解至所需的浓度，保存于-20 °C备用。
[0012] 上述步骤（2)中， 所述的包涵体洗涤液配方为：2M尿素，20mMTris-HCl，150mMNaCl，lmMEDTA，0. 5%TritonX100,pH=7. 9 ; 所述的包涵体溶解液配方为：8M尿素，20mMTris-HCl，150mMNaCl，0. 1% 0-巯基 乙醇，0.2%TritonX100, 30mM咪唑，pH=7. 9; 所述的杂蛋白洗涤液配方为：6M尿素，1MTris-HCl，2. 5MNaCl，0. 1% 0-巯基乙 醇，0? 1%TritonX100,2M咪唑，pH=7. 9 ; 所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2M尿素，1MTris-HCl，2. 5MNaCl，2M咪唑，pH=4. 5〇
[0013] 所述的透析液Bufferl配方为：1MTris-HCl，2. 5MNaCl，0. 614g还原型谷胱 甘肽，0.0122g氧化型谷胱甘肽，2M咪唑，3M尿素，50mL甘油，50ul吐温-20,定容于1 L，pH=7. 9 ; 所述的透析液Buffer2配方为：1MTris-HCl，2.5MNaCl，0.614g还原型谷胱甘肽， 0. 0122g氧化型谷胱甘肽，2M咪唑，1M尿素，50mL甘油，50ul吐温-20,定容于1L， pH=7. 9 ； 所述的透析液Buffer3配方为：1MTris-HCl，2. 5MNaCl，50mL甘油，定容于1L，pH=7. 9〇
[0014] 6、一种重组刺参BPI基因工程菌的应用，其表达的重组杀菌通透性增强蛋白具有 制备抑制副溶血弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌抗生素药物方面的用途。
[0015] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首先公开了刺参BPI基因、编码蛋白 及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法，其利用基因工程技术，通过3'端cDNA快速扩增（3' -RACE)以及5'端cDNA快速扩增（5' -RACE)的方法，首次从刺参中克隆得到 了BPI基因cDNA序列，同时对刺参BPIN端蛋白质进行重组质粒的构建和表达，获得了一 株具有杀菌活性的重组杀菌通透性增强蛋白基因工程菌（pET28a( + ) -BPIN)，表达产物经 体外活性检测，发现重组刺参杀菌通透性增强蛋白具有高效的杀灭水产致病菌弧菌属副溶 血弧菌，哈维氏弧菌，以及阳性致病菌藤黄微球菌的作用，对研制新型高效抗生素替代药物 具有重要价值，可以作为绿色疾病制剂在刺参病害防治中发挥作用。
【附图说明】
[0016]图1为刺参重组杀菌通透性增强蛋白的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标 准，1为未诱导重组蛋白包涵体，2为诱导3h重组蛋白包涵体，3为诱导6h重组蛋白包涵 体，4为纯化后重组蛋白； 图2为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对副溶血弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重 组蛋白质量浓度20ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1(无菌培养基)，5、6为阴性对照组2(透 析液）； 图3为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对副溶血弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重 组蛋白质量浓度40ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1(无菌培养基)，5、6为阴性对照组2(透 析液）； 图4为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对哈维氏弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重 组蛋白质量浓度20ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1(无菌培养基)，5、6为阴性对照组2(透 析液）； 图5为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对哈维氏弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重 组蛋白质量浓度40ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1(无菌培养基)，5、6为阴性对照组2(透 析液）； 图6为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对藤黄微球菌的抑制作用效果图，图中1-3为重 组蛋白质量浓度20ug/牛津杯，4-6为阴性对照组1 (无菌培养基）； 图7 1-3为重组蛋白质量浓度20ug/牛津杯的阴性对照组2 (透析液)，4-6为重组蛋 白质量浓度40ug/牛津杯的阴性对照组2 (透析液）； 图8为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对藤黄微球菌的抑制作用效果图，图中1-3为重 组蛋白质量浓度40ug/牛津杯，4-6为阴性对照组1 (无菌培养基)。
【具体实施方式】
[0017] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0018] 具体实施例一 BPI基因克隆与序列分析 (1)通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱 分析，发现了多条编码BPI基因的EST序列（PengjuanZhang,ChenghuaLi,LinZhu, XiurongSu，YeLi,ChunhuaJin，TaiwuLi.DeNovoassemblyoftheseacucumber ApostichopusjaponicushemocytestranscriptometoidentifymiRNAtargets associatedwithskinulcerationsyndrome.PlosONE2013. 8(9):e73506.)，选取编 码刺参BPI部分片段的EST克隆； (2) RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢 式引物：3'上游特异性引物1 :TTCAAAGCACAAAACAACCCGTC，3'上游特异性引物2 : TGGGTGTCATCTTITGAAGGTGT;5' 下游特异性引物 1 :GCACTGTTGATGAGGTAGTCGCT， 5'下游特异性引物2 :GTGTCCGCAGTAAGGAGTAATCT，扩增3'接头引物Adaptor3 : TACCGTCGITCCACTAGTGAITT，扩增 5' 接头引物Adaptor5:CATGGCTACATGCTGACAGCCTA; (3) RACE扩增获取BPI基因全长序列，具体步骤如下： a. 总RNA提取：取刺参体腔液1. 0mL，800g离心5min，收集体腔细胞，加入Trizol 试剂(购于Takara公司）1.0mL，震荡混勾，室温放置5min，再加入0. 2mL氯仿，震荡混勾， 室温静置10min，4 °C，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的 异丙醇，混勾，室温静置5min，4 °C，12000rpm，离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百 分浓度为75%的乙醇1mL，4°C，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20 yL无RNA酶水，得到RNA提取液； b. 3'-RACE扩增：将上述RNA提取液用 3'_FullRACECoreSetwithPrimeScript? RTase试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增3'的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操 作，以此为模板，使用3'上游特异性引物1和扩增3'接头引物Adaptor3进行PCR扩增，取 PCR产物1ul作为模板，再用3'上游特异性引物2和扩增3'接头引物Adaptor3进行PCR 得到3'端目的条带； c. 5' -RACE扩增：将上述RNA提取液用5'-FullRACEKit试剂盒（Takara公司）逆 转录合成扩增5'的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5'下游特 异性引物1和扩增5'接头引物Adaptor5进行PCR扩增，取PCR产物1ul作为模板，再用 5'下游特异性引物2和扩增5'接头引物Adaptor5进行PCR得到5'端目的条带； d. 将上述扩增产物用凝胶回收试剂盒(百泰克)回收，回收产物与载体pMD18_T(Takara 公司）连接，转化至大肠杆菌focAericAiaco/iDH5a(Takara公司）后，在含有氨节浓度 为50ug/mL的LB(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L)平板培养基中培养 8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结 果经DNAMAN软件分析拼接得到全长序列； 其中，RACE扩增反应体系及反应条件：模板