1.0yL，10XPCR缓冲液(不含Mg2+) 2. 5yL，浓度25mM的MgCl2 2. 0yL，浓度2. 5mM的dNTP2. 0yL，浓度10yM的特异性引 物1.〇1^，浓度1〇1^的4〇^如1'1.〇1^，浓度5"1^的0嫩聚合酶0.21^，超纯水： 15.3yL;扩增条件：94°C3min、94°C30s、60°C30s、72°C1min，共35个循环，最 后 72°C延伸 10min; 最终得到的刺参BPI基因cDNA序列如SEQIDNO. 1所示，该序列全长2208bp，包括1455bp的开放阅读框，编码484个氨基酸，5'非编码区长395bp，3'非编码区长358bp，有多 聚腺苷酸信号，mRNA末端不稳定信号以及序列末端含有典型的polyA尾；刺参BPI基因编 码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示，该蛋白分子量为54. 323KDa，等电点为5. 58,其 中编码序列的1-21位为信号肽序列，编码序列的29-242位为N端结构域(氨基酸序列如 SEQIDNO. 3所示)，编码序列的257-462位为C端结构域，含有两个半胱氨酸（Cys)，形成1 个分子内二硫键。
[0019]具体实施例二 重组刺参BPI基因工程菌的构建方法 1、BPI蛋白质N端结构域克隆及重组蛋白的构建与表达 a、 总RNA提取：取刺参体腔液1. 0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入Trizol试 剂(购于Takara公司）1.0mL，震荡混勾，室温放置5min，再加入0. 2mL氯仿，震荡混勾， 室温静置10min，4 °C，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的 异丙醇，混勾，室温静置5min，4 °C，12000rpm，离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百 分浓度为75%的乙醇1mL，4°C，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20 yL无RNA酶水，得到RNA提取液； b、cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara)逆转录合成cDNA，具体 合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有I位点 和I位点的引物扩增刺参编码BPI蛋白N端结构域的基因序列(氨基酸序列如SEQID N0. 3所示)，即如下所示： 含BmHI位点BPI上游扩增引物：CGGGATCCCGAATCACTCCCAACGGATTTCG 含NotI位点BPI下游扩增引物：TTGCGGCCGCATGGCCAGTTGCATAAACCTCCC 。、卩0?扩增：〇0嫩1.〇1^，10\卩0?缓冲液(不含]\%2+)2.5 1^，浓度25 1111的]\%(：122.0 yL，浓度2.5mM的dNTP2.0 yL，浓度10yM的下游引物1.0 yL，浓度5U/yL的 DNA聚合酶0.2 yL，超纯水：15.3 yL;扩增条件：94 °C 3 min、94 °C 30s、60°C 30s、 72 °C 1 min，共35个循环，最后72 °C延伸10 min; d、PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒(百泰克）回收PCR产物，然后回收 产物与载体pMD18_T(Takara公司)连接，转化至大肠杆菌co/iDH5a(Takara 公司)后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10 g/L)平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的 阳性克隆质粒； e、 重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用你I和Afot I(New England Biolabs，NEB)限制 性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在600bp的目的条带，与经同样酶切的pET28 (a)原核表达载体酶切产物连接，转化fccAericAia coBDH5a，PCR筛选阳性克隆，经测 序鉴定获得编码框正确的表达载体PET28 (a) -BPIN重组质粒； f、 重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒（Omega公司）纯化阳性菌株重组质粒pET28 (a)-BPIN，转化到表达宿主BL21 (DE3) (Novagen公司），获得的阳性菌株，将阳性菌株再 接种到卡那霉素浓度为50ug/mL的LB培养液中，37 °C、200r/min振荡培养至菌液0D_的 值为0. 4-0. 6时，加入异丙基--D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)使其终浓度为1mmol/L，37 °〇诱导表达3-6h，收集菌液，经12000r/min离心5min，弃上清液，获得细菌沉淀物； 2、 重组蛋白的纯化与复性 a、蛋白纯化：将每100mL细菌沉淀物用10mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000rpm离心10 min，去上清液，用5mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清， 再次12000rpm离心20 min，取上清液；取1mLNi-NTA Sef inose? Resin(上海生工，编 号：BSP033)上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与之前上柱的 Ni-NTASefin〇seTMResin混合，4 °C混匀1h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋 白洗涤液洗涤介质，每次10mL，洗脱10次后；加入1mL变性蛋白洗脱液浸泡10min，收 集洗脱液，重复洗脱5次，收集每次洗脱液合并，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋 白条带进行鉴定，获得重组刺参BPIN末端结构域蛋白（图1，箭头所示即为目的蛋白）； b、蛋白复性：纯化后的重组刺参BPIN末端结构域蛋白分别用透析液Bufferl、透析液 Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6_18h，最后，4°C12000r/min离心30min，收集 沉淀，即为重组刺参BPI基因工程菌，溶解至所需的浓度用于抑菌活性分析。
[0020] 上述包涵体洗涤液配方为：2M尿素，20mMTris-HCl，150mMNaCl，lmMEDTA， 0.5%TritonX100,pH=7. 9 ； 上述包涵体溶解液配方为：8M尿素，20mMTris-HCl，150mMNaCl，0. 1% 0-巯基乙 醇，0.2%TritonX100,30mM咪唑，pH=7.9; 上述杂蛋白洗涤液配方为：6M尿素，1MTris-HCl，2. 5MNaCl，0. 1% 0-巯基乙醇， 0? 1%TritonX100,2M咪唑，pH=7. 9 ; 所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2M尿素，1MTris-HCl，2. 5MNaCl，2M咪唑，pH=4. 5〇
[0021] 上述透析液Bufferl配方为：1MTris-HCl，2. 5MNaCl，0. 614g还原型谷胱甘 肽，0.0122g氧化型谷胱甘肽，2M咪唑，3M尿素，50mL甘油，50ul吐温-20,定容于1L， pH=7. 9 ； 上述透析液Buffer2配方为：1MTris-HCl，2. 5MNaCl，0. 614g还原型谷胱甘肽， 0. 0122g氧化型谷胱甘肽，2M咪唑，1M尿素，50mL甘油，50ul吐温-20,定容于1L， pH=7. 9 ； 上述透析液Buffer3配方为：1MTris-HCl，2. 5MNaCl，50mL甘油，定容于1L，pH=7. 9〇
[0022] 具体实施例三 刺参重组蛋白的抑菌活性分析 (1) 将4种受试阴性菌副溶血弧菌（Kz'Ario 心哈维氏弧菌（Kz'Ario 灿烂弧菌（m_rio 溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus)接种于 2216E液体培养基(胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，pH=7. 6)于28 °C，150r/min培养至OD600=l. 0,取100ul菌液涂平板(琼月旨12g/mL); (2)将受试阳性菌藤黄微球菌（i/ZcrococcysA/teys)接种于营养琼脂液体培养基(胰 蛋白胨 10g/L，牛肉膏 3g/L，NaCl5g/L，pH=7.3±0.1)于 35 °C，150r/min培养，将菌液 与营养琼脂固体培养基(琼脂15g/L)混合倒平板，菌液浓度lX107cfu/mL; (3) 采用改良琼脂平板扩散法(牛津杯）测定重组杀菌通透性增强蛋白抑菌活性，每种 受试菌设置阴性对照组1 (无菌培养基)、阴性对照组2 (透析液)和重组蛋白实验组，在上述 所述平板中放置无菌牛津杯(直径0.8cm)，依次向每个牛津杯中加入不同质量浓度20ug/ 牛津杯、40ug/牛津杯具体实施例三构建所得的重组刺参BPI基因工程菌以及相等体积阴 性对照组1 (无菌培养基)、阴性对照组2 (透析液)，藤黄微球菌实验组于35 °C培养12h， 其他受试菌实验组于28 °C培养12h，结果显示，具体实施例三构建所得的重组刺参BPI基 因工程菌对2株水产病原菌副溶血弧菌（图2和3,重组蛋白质量浓度为20yg/牛津杯对 副溶血弧菌的抑菌直径为2. 21 ± 0. 11cm，重组蛋白质量浓度为40yg/牛津杯对副溶 血弧菌的抑菌直径为2.55 ± 0.15cm)和哈维氏弧菌（图4和5,重组蛋白质量浓度为20 Ug/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为1.63 ± 0.12cm，重组蛋白质量浓度为40yg/ 牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为2.14 ± 0.32cm)以及阳性菌藤黄微球菌（图6-8,重组 蛋白质量浓度为20yg/牛津杯对藤黄微球菌的抑菌直径为0.93 ± 0.02cm，重组蛋白质 量浓度为40yg/牛津杯对藤黄微球菌的抑菌直径为1.21 ± 0.02cm)具有较为明显的 抑制作用。
[0023]上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护 范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种刺参BPI基因，其特征在于该基因具有SEQID NO. 1所示的cDNA序列。
2. -种权利要求1所述的刺参BPI基因的克隆方法，其特征在于步骤如下：根据与BPI 基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长。
3. 根据权利要求2所述的一种刺参BPI基因的克隆方法，其特征在于具体步骤如下： (1) 通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分 析，发现了多条编码BPI基因的EST序列，选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆； (2) RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢 式引物：3'上游特异性引物I :TTCAAAGCACA