AAACAACCCGTC，3'上游特异性引物2 : TGGGTGTCATCTTITGAAGGTGT ;5' 下游特异性引物 I :GCACTGTTGATGAGGTAGTCGCT， 5'下游特异性引物2 :GTGTCCGCAGTAAGGAGTAATCT，扩增3'接头引物Adaptor3 : TACCGTCGITCCACTAGTGAITT，扩增 5' 接头引物 Adaptor5 :CATGGCTACATGCTGACAGCCTA ; (3) RACE扩增获取刺参BPI基因全长序列，具体步骤如下： a. 总RNA提取：通过刺参体腔液收集体腔细胞制备RNA提取液； b. 3'-RACE扩增：将RNA提取液用 3'-Full RACE Core Set with PrimeScript? RTase 试剂盒逆转录合成扩增3'的模板，以此为模板使用3'上游特异性引物I和扩增3'接头引 物进行PCR扩增，取PCR产物I ul作为模板，再用3'上游特异性引物2和扩增3'接头引 物进行PCR扩增得到3'端目的条带； c. 5' -RACE扩增：将RNA提取液用5' -Full RACE Kit试剂盒逆转录合成扩增5'的 模板，以此为模板使用5'下游特异性引物1和扩增5'接头引物进行PCR扩增，取PCR产 物I ul作为模板，再用5'下游特异性引物2和扩增5'接头引物进行PCR扩增得到5'端 目的条带； d. 将扩增产物3'端目的条带和5'端目的条带用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载 体pMD18_T连接，转化至大肠杆菌AscAericAia co/iDH5a后，在含有氨节浓度为50 ug/ mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物 工程有限公司测序，所得结果经DNAMN软件分析拼接得到刺参BPI基因全长序列，其基因 序列如SEQIDN0. 1所示。
4. 根据权利要求3所述的一种刺参BPI基因的克隆方法，其特征在于上述RACE扩增反 应体系及反应条件：模板1.0 UL，10 X PCR缓冲液(不含Mg2+)2. 5 yL，浓度25 mM的MgCl2 2.0 yL，浓度2. 5 mM的dNTP 2.0 yL，浓度10 yM的特异性引物LO yL，浓度10 yM 的接头引物1.0 UL，浓度5U/yL的DNA聚合酶0.2 yL，超纯水：15. 3 yL ;扩增条件：94 °C 3 min、94 °C 30 s、60 °C 30 s、72 °C I min，共 35 个循环，最后 72 °C延伸 10 min。
5. -种权利要求1所述的刺参BPI基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
6. -种权利要求5所述的刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质，其特征在于该蛋白质 具有SEQID NO. 3所示的氨基酸序列。
7. -种利用权利要求6所述的刺参BPI基因编码蛋白的N端结构域编码基因构建重组 刺参BPI基因工程菌的方法，其特征在于步骤如下： 设计PCR引物，用分别含有及?# I位点和#〇( I位点的引物扩增刺参BPI蛋白的N端 结构域，即权利要求6所述的刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质； 将克隆得到的目的基因插入pET28a ( + )载体，获得重组质粒pET28a ( + )-BPIN ; 对重组质粒pET28a ( + )-BPIN进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。
8. -种根据权利要求7所述的重组刺参BPI基因工程菌的构建方法，其特征在于：具 体步骤如下： BPI蛋白质N末端结构域克隆及重组蛋白的构建与表达 a. 总RNA提取：取刺参体腔液制备得到RNA提取液； b. cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的 cDNA为模板，用分别含有及_7 I位点和#〇( I位点的引物扩增刺参编码BPI蛋白N端结构 域的基因序列SEQIDNO. 3所示，其中 含没h/7 I 位点 BPI 上游扩增引物：CGGGATCCCGAATCACTCCCAACGGATTTCG 含 I 位点 BPI 下游扩增引物：TTGCGGCCGCATGGCCAGTTGCATAAACCTCCC 。.？0?扩增：〇0嫩1.〇1^，10\?0?缓冲液(不含]\%2+)2.5 1^，浓度25 1111的]\%(：12 2. O y L，浓度2. 5 mM的dNTP 2. O y L，浓度10 y M的上游引物含没I位点BPI上游扩 增引物1.0 UL，浓度10 yM的下游引物含Not I位点BPI下游扩增引物1.0 yL，浓度 5。/1^的0嫩聚合酶0.2 1^，超纯水15.3 1^;扩增条件：94°〇3 1^11、94 1：30 8、60 °C 30 s、72 °C I min，共 35 个循环，最后 72 °C 延伸 10 min; d. PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载 体pMD18_T连接，转化至大肠杆菌AscAericAia co/iDH5a后，在含有氨节浓度为50 ug/ mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正 确的PCR阳性克隆质粒； e. 重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用湯7 I和I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝 胶电泳回收分子量在600bp的目的条带，与经同样酶切的pET28 (a)原核表达载体酶切产 物连接，转化co/i DH5 a，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的 表达载体PET28 (a) -BPIN重组质粒； f. 重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒PET28 (a)-BPIN，转 化到表达宿主BL21 (DE3)获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 ug/ mL的LB培养液中，37 °C、200r/min振荡培养至菌液OD6tltl的值为0. 4-0. 6时，加入异丙 基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为I mmol/L，37 °C诱导表达3-6 h，收集菌液，经 12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物； (2)重组蛋白的纯化与复性 a. 蛋白纯化：将100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000 rpm离心10 min，去上清液，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清，再次 12000 rpm离心20 min，取上清液；取I mL Ni-NTA Sefinose? Resin上柱，用无菌水洗两 次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与上柱的Ni-NTA Sefinose? Resin混合，4 °C混 匀I h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10 mL，洗脱 10次后；加入I mL变性蛋白洗脱液浸泡10 min，收集洗脱液，重复洗脱5次，收集每次洗 脱液合并，取洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋白条带进行鉴定，获得目的蛋白重组刺参 BPIN末端结构域蛋白； b. 蛋白复性：将纯化后的重组刺参BPIN末端结构域蛋白分别用透析液Bufferl、透析 液Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6_18h，最后，4 °C 12000r/min离心30 min，收 集沉淀，即为重组刺参BPI基因工程菌，溶解至所需的浓度，保存于-20 °C备用。
9. 根据权利要求8所述的一种重组刺参BPI基因工程菌的构建方法，其特征在于上述 步骤（2)中，所述的包涵体洗涤液配方：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，lmM EDTA， 0.5%1'1'行〇11\100，？11=7.9;所述的包涵体溶解液配方为 ：8 11尿素，20 11111^8-11(：1，150 mM NaCl，0. 1% (6-巯基乙醇，0. 2% TritonX100,30 mM咪唑，pH=7. 9 ;所述的杂蛋白洗涤液 配方为：6 M 尿素，I M Tris-HCl，2. 5 M NaCl，0. 1% 0-巯基乙醇，0? 1% TritonX100,2 M 咪唑，pH=7. 9 ;所述的变性蛋白洗脱液配方为：1. 2 M尿素，I M Tris-HCl，2. 5 M NaCl，2 M 咪唑，pH=4. 5 ;所述的透析液Bufferl配方为：1 M Tris-HCl，2. 5 M NaCl，0. 614 g还原型 谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，3 M尿素，50 mL甘油，50 ul吐温-20,定容 于 I L，pH=7.9;所述的透析液 Buffer2 配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g 还原 型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，I M尿素，50 mL甘油，50 ul吐温-20， 定容于 I L，pH=7. 9;所述的透析液 Buffer3 配方为：1 M Tris-HCl，2. 5 M NaCl，50 mL 甘 油，定容于I L，pH=7.9。
10. -种重组刺参BPI基因工程菌的应用，其特征在于：其表达的重组杀菌通透性增强 蛋白具有制备抑制副溶血弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌抗生素药物方面的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法，特点是刺参BPI基因序列如SEQIDNO.1所示；其克隆方法为根据与BPI基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长；刺参BPI蛋白序列如SEQIDNO.2所示，其N端蛋白结构域序列如SEQID NO.3所示；用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参BPI蛋白的N端结构域；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是对副溶血弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌具有明显的杀菌作用。
【IPC分类】C07K14-435, C12N15-12, A61P31-04, A61K38-17, C12N15-10, C12N15-70
【公开号】CN104745595
【申请号】CN201510136343
【发明人】李成华, 邵铱娜, 张卫卫, 车钟杰, 张鹏娟, 金春华, 李晔, 欧昌荣
【申请人】宁波大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月27日