1培养基）加入96孔细胞培养板，在37°C、5% CO2细胞培养箱中贴壁培养过夜，加入不同浓度待测化合物的新鲜培养基（100 μ 1)，DMSO的 最终浓度为〇. 25 %，将细胞培养板在37°C，5 %的CO2条件下温育72h，去除培养液，然后加 入4°C预冷的TCA溶液（10%，w / V)，静置5min移入4°C冰箱中固定lh，取出用去离子水 冲洗5遍，室温晚干。待96孔板室温下晚干后，每孔加入0.4% (w / V)的SRB染液（1% 的乙酸配制）50 μ L，染色30min后倒掉染液，用1% (V / V)乙酸冲洗4次，去除未结合的 染料，室温晾干。
[0190] 用100 μ L非缓冲Tris-base碱液（10mM，pH=10. 5)溶解与细胞蛋白结合的染料， 水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值，采用GraphPad Prism5分析数 据，求IC50,结果如表3所示。
[0191] 表3 :本发明化合物对EGFRT790M耐药NCI-H1975细胞的增殖抑制作用
[0192]
[0193]
[0194] 注：阳性对照药物：N-[4_[(3-氯-4-氟苯基）氨基]-7-[[(3S)_四氢-3-呋喃 基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基）-2- 丁烯酰胺。
[0195] 从上述实验结果中可以看到，本发明化合物具有较强的生物学活性，许多化合物 在nM就能有效抑制蛋白酪氨酸激酶的活性和EGFRT790M耐药NCI-H1975细胞的增殖。
[0196] C)体内药效评价
[0197] BALB / c裸小鼠，雌性，4~6周龄，体重20±2g(购自北京维通利华实验动物技 术有限公司，SPF级环境饲养）。
[0198] 将体外培养的NCI-H1975细胞（EGFR可逆抑制剂耐药突变T-790M，购自上海细胞 所）接种于裸鼠右侧腋窝皮下，每只约接种5X10 6个细胞，成瘤后体内传代两次。无菌条 件下，取生长旺盛的瘤组织修剪成2. Omm3左右的瘤块，接种于裸小鼠右侧腋窝下。用游标 卡尺测量瘤径，待肿瘤生长至100-300mm 3后将动物随机分组。阳性对照单次给药剂量为 30mg / kg，化合物1、3、5、6、7的单次给药剂量分别为15、15、20、10、20mg / kg，灌胃给药， 每天一次，连续14天（dl4)，阴性对照组给等量溶剂（含4%聚氧乙烯氢化蓖麻油：无水乙 醇=1 :1(体积比）的注射用水溶液）。给药期及恢复期间，每周测量小鼠体重和瘤径2~3 次。根据测量数据计算肿瘤体积和相对肿瘤体积，肿瘤体积（tumor volume，TV)的计算公 式为：TV=I / 2XaXb2,其中a、b分别表示肿瘤长径和短径。据测量的结果计算出相对肿 瘤体积（relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV=Vt / V0。其中VO为试验开始时 的肿瘤体积，Vt为每一次测量的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T / C(%)，计算公式如下：T / C(%)=TKTv / CKTvX100%，TKTv为治疗组RTV5Cktv为阴性对照组 RTV，相对肿瘤生长抑制率=(1-T / C)X100%。结果如表4所示。
[0199] 表4 :本发明化合物对Η1975裸小鼠移植瘤的治疗作用（, n=6 )
[0200]
[0201] 注：
[0202] (1)与阴性对照组相比，* P〈0. 05, * * P〈0. 01 ;与阳性对照组相比，#P〈0. 05， ##P<0.0 lo
[0203] ⑵dx :肿瘤出现最大抑制率时间；d18 :末次药后第4天。
[0204] (3)阳性对照药物：N-[4-[(3-氯-4-氟苯基）氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃 基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基）-2- 丁烯酰胺。
[0205] 结果显示：化合物1、5、6、7的最大抑瘤率分别为87. 1%、85. 7%、96. 7%、92. 6%， 好于阳性对照药72. 9% ;化合物1、5、6、7给药组全部出现肿瘤消退，阳性对照组2只出现 肿瘤消退。
[0206] 末次给药后第4天（d18)，化合物的抑瘤率出现不同程度的下降，化合物1、5、6、7的 抑瘤率分别为71. 2%、75. 6%、87. 8%、88. 9%，活性好于阳性对照56. 6%。
[0207] 化合物3的体内抗肿瘤活性略差于阳性药物。
[0208] 以上体内实验结果显示，本发明化合物对EGFR-T790M耐药的肿瘤具有较好的抑 瘤效果。
[0209] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 式I所示的化合物或其药学上可接受的盐；其中， Ri，R2独立地选自氧、卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基； 馬选自烷基、卤代烷基、环烷基和卤代环烷基； R4选自卤代烷基、四氢呋喃-3-基、（S)-四氢呋喃-3-基和（R)-四氢呋喃-3-基。2. 根据权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，其满足如下的1)至5) 项中的任意一项或者多项： 1) 所述炔基为C2-C1(l炔基、C2-C6炔基或C2-C4炔基； 2) 所述烷基为Q-Q烷基、Q-Q烷基、Q-Q烷基、Ci-Q烷基或C3-C6烷基； 3)所述卤代烷基为Ci-Q卤代烷基、Q-C；卤代烷基、Q-C；卤代烷基、卤代烷基或C3_C6卤代烷基； 4) 所述环烷基为C3-C6环烷基或C3-C4环烷基； 5) 所述卤代环烷基为C3-C6卤代环烷基或C3-C4卤代环烷基。3. 根据权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐， 其中， &，R2独立地选自氢、卤素、C2-C4炔基； R3选自C3-C4直链或支链烷基、C3-C4环烷基、C3-C4卤代环烷基； R4选自Ci-Q烷基、被一个或多个卤素取代的Ci-Q烷基、四氢呋喃-3-基、（S)-四氢呋 喃-3-基和（R)-四氢呋喃-3-基。4. 根据权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐， 其中， &，R2独立地选自氢、卤素、乙炔基和丙炔基； R3选自正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、卤代环丙基和卤代环 丁基； r4选自甲基、乙基、正丙基或异丙基；被一个或多个卤素取代的甲基、乙基、正丙基或异 丙基；四氢呋喃_3_基、（S)-四氢呋喃-3-基和（R)-四氢呋喃-3-基。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，其满足如 下的（1)-(5)项中的任意一项或者多项： (1) 所述卤素选自氟、氯和溴； (2) 所述卤代为被一个或多个相同或不同的卤素（例如2、3、4或5个或5个以上）取 代，并且所述卤素选自氟、氯和溴； (3) R"R2分别位于苯环上的间位和对位； (4) 当&，R2中的一个为炔基时，另一个为氢；可选地，炔基位于苯环上的间位； (5) 所述药学上可接受的盐为式I化合物的盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、富 马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐或其混合物。6. 根据权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述式I化合物选 自如下化合物： (S，E) -N- (4- (3-氯-4-氟苯胺基）-7-(四氢呋喃-3-基氧基）喹唑啉-6-基）-4-(环 丙基胺基）_2_ 丁烯酰胺； (R，E) -N- (4- (3-氯-4-氟苯胺基）-7-(四氢呋喃-3-基氧基）喹唑啉-6-基）-4-(环 丙基胺基）_2_ 丁烯酰胺； (E) -N- (4- (3-氯-4-氟苯胺基）-7-甲氧基喹唑啉-6-基）-4- (3，3-二氟环丁基胺 基）-2-丁烯酰胺； (E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基）-7-(二氟甲氧基）喹唑啉-6-基）-4-(环丙基胺 基）_2_ 丁烯酰胺； (E) -N- (4- (3-乙炔基苯胺基）-7-甲氧基喹唑啉-6-基）-4-(环丙基胺基）-2- 丁烯酰 胺； (E) -N- (4- (3-乙炔基苯胺基）-7-乙氧基喹唑啉-6-基）-4-(环丙基胺基）-2- 丁烯酰 胺； (S，E)-N-(4-(3-乙炔基苯胺基）-7-(四氢呋喃-3-基氧基）喹唑啉-6-基）-4-(环 丙基胺基）_2_ 丁烯酰胺； (E) -N- (4- (3-氯-4-氟苯胺基）-7- (2, 2, 2-三氟乙氧基喹唑啉-6-基）-4-(环丙基胺 基）-2-丁烯酰胺； (S，E) -N- (4- (3-氯-4-氟苯胺基）-7-(四氢呋喃-3-基氧基）喹唑啉-6-基）-4-(异 丙基胺基）_2_ 丁烯酰胺；和 (S，E)-N-(4-(3-乙炔基苯胺基）-7-(四氢呋喃-3-基氧基）喹唑啉-6-基）-4-(异 丙基胺基）_2_ 丁烯酰胺。7. -种制备权利要求1至6中任一项所述的式I化合物的方法，其包括下述步骤： (1) 由6-硝基-7-氟-4-羟基喹唑啉合成相应的中间体II;(2) 中间体II在适宜碱存在下，反应生成中间体III;中间体III与适宜的还原剂反应 得中间体IV;(3)中间体IV与相应的4-溴巴豆酰氯反应生成化合物V，再与相应胺反应生成式I化 合物；其中，中间体IV也可以通过以下步骤制备： (A) 由6-硝基-7-氟-4-羟基喹唑啉在适宜的碱存在下合成相应的中间体II;(B) 中间体II经氯代后再与相应胺反应生成中间体III;(C) 中间体III与适宜的还原剂反应得中间体IV;其中&、R2、R3、R4具有权利要求1至6中任一项中所述的含义。8. -种药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的式I化合物或其药学上可 接受的盐，以及任选的药学上可接受的辅料。9. 权利要求1至6中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求8 所述的药物组合物在制备抑制蛋白酪氨酸激酶的药物或试剂中的用途；具体地，所述抑制 为可逆抑制或者不可逆抑制；具体地，所述蛋白酪氨酸激酶为受体酪氨酸激酶；更具体地， 为EGFR酪氨酸激酶和/或Her2酪氨酸激酶。10. 权利要求1至6中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求 8所述的药物组合物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗受体酪氨酸激酶介导的肿瘤的 药物中的用途；具体地，所述肿瘤为白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤，或者如下部位的癌症： 胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、胃、头和颈、肝、肺、神经元、食道、卵巢、胰 腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫或外阴。11. 权利要求1至6中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求 8所述的药物组合物在制备抑制受体酪氨酸激酶介导的肿瘤细胞的药物或者试剂中的用 途；具体地，所述肿瘤细胞为白血病细胞、多发性骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞，或者如下部位的 癌症的细胞：胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、胃、头和颈、肝、肺、神经元、 食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫或外阴。12. -种在体内或体外抑制蛋白酪氨酸激酶的方法，包括使用有效量的权利要求1至6 中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求8所述的药物组合物的步 骤；具体地，所述抑制为可逆抑制或者不可逆抑制；具体地，所述蛋白酪氨酸激酶为受体酪 氨酸激酶；更具体地，为EGFR酪氨酸激酶和/或Her2酪氨酸激酶。
【专利摘要】本发明属于医药化工领域，具体涉及一类新的具有抗肿瘤活性的式I喹唑啉类化合物及其制备方法。所述式I化合物具有有效的蛋白酪氨酸激酶不可逆抑制作用和／或具有良好的体内药物动力学行为，是有效的蛋白酪氨酸激酶不可逆抑制剂。
【IPC分类】A61K31/517, A61P35/00, A61P35/02, C07D405/12, C07D239/94
【公开号】CN104910140
【申请号】CN201410093565
【发明人】张龙, 范传文, 杨莹莹, 郑庆梅, 周豪杰, 赵树雍, 李玉浩, 邢昭彬, 李成龙
【申请人】齐鲁制药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月14日