的中间载体pCZmAA和pTUbiMs70cs_LD，胶回收后连接得到多控不育载体PMCS0702，经酶切和测序验证正确。载体pMCS0702的专利保藏号为CGMCC N0.10446，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，100101 ;生物保藏的分类命名:大肠埃希氏菌coif);保藏日期:2015年I月27日。
多控不育载体PMCS0702包含4个表达盒，如图6所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，雄性育性恢复基因Ms7的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。pMCS0702载体图谱如图7所示。
3.构建含有5个表达盒的多控不育载体pMCS0703
用HindIII酶切pMCS0702载体，并进行去磷酸化处理。载体pMD18_Dam含有Dam表达盒，将该载体用HindIII酶切后得到Dam表达盒片段。将以上pMCS0702载体酶切片段和Dam表达盒片段分别胶回收后进行连接，获得的重组载体命名为PMCS0703，分别经酶切和测序验证正确。载体pMCS0703的专利保藏号为CGMCC N0.10447，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，100101 ;生物保藏的分类命名:大肠埃希氏菌(fccAericAia coW);保藏日期:2015年I月27日。
多控不育载体PMCS0703包含5个表达盒，如图9所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒和Dam表达盒，雄性育性恢复基因Ms7的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。pMCS0703载体图谱如图10所示。
实施例2:玉米多控不育载体pMCS0701、pMCS0702和pMCS0703的应用
1.玉米多控不育载体转化农杆菌
参照AN(Methods in Enzymology (1987) 153:292-305)方法，将本发明所构建的多控不育载体 pMCS0701、pMCS0702 和 pMCS0703 转化到农杆菌 EHA105(Hood et al.，TransgenicRes(1993)2:208-218)中。
取1~2 Ug质粒，加到100 ul于冰上溶化的农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴30 min。置于液氮中迅速冷冻I分钟，移入37°C水浴中5 min;迅速冰浴2 min后将加入1000 ulYEB液体培养基，于28°C，转速为200 rpm条件下培养2~4 hr，涂于含50 mg/L的利福平(Rifampicin)和100 mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的固体YEB平板上培养2~3天。长出单菌落后，挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28 °C振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒。将以上质粒转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，得到单菌落后接种LB培养基培养，然后提取质粒。用限制性内切酶酶切质粒验证，如图4、7和图11所示，酶切结果表明玉米多控不育载体PMCS0701、pMCS0702和pMCS0703都正常转化进入农杆菌中。
2.多控不育载体的玉米转化流程和植株的再生
将突变体(as7??7)纯合的雄性不育植株与来自玉米Hi II植株的花粉杂交、回交数代之后，该ms7等位基因渐渐渗入易于转化的Hi II玉米种质。 按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的上述具有玉米綠合等位基因的玉米Hi II的幼胚与本实施例所述的农杆菌共培养，将实施例1构建的多控不育载体PMCS0701中的T-DNA(包含5个表达盒)、pMCS0702中的T-DNA(包含4个表达盒)或pMCS0703中的T-DNA (包含5个表达盒)转入到玉米基因组中，获得了转基因玉米植株。
农杆菌侵染玉米幼胚转化流程如下:
取授粉后9~11天的玉米幼穗，剥去苞叶，表面消毒后剥取幼胚，从玉米中分离幼胚(见图12-1)，用农杆菌悬浮液侵染幼胚(见图12-2)，其中农杆菌能够将所述介导植物雄性育性的构建体传递至幼胚细胞(步骤1:侵染步骤)。在此步骤中，幼胚浸入农杆菌悬浮液(OD660=0.4-0.6，侵染培养基(N6盐2g/L、N6维生素、L-脯氨酸0.115g/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L，pH5.2))中以启动接种。幼胚在侵染步骤后在固体培养基(N6盐2g/L、N6维生素、L-脯氨酸0.115g/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、琼脂7g/L，pH5.8)上与农杆菌共培养(见图12-3) 3天(步骤2:共培养步骤)。在此共培养阶段后，有一个选择性的“恢复”步骤(步骤3:恢复步骤)。在该步骤中，恢复培养基(N6盐2g/L、N6维生素、L-脯氨酸0.115g/L、鹿糖 20g/L、葡萄糖 10g/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、琼脂 7g/L，pH5.8)中含有抑制农杆菌生长的抗生素(羧苄青霉素500mg/L)，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，幼胚在有选择剂(2.5mg/L双丙氨膦)的筛选固体培养基(N6盐4g/L、N6维生素、L-脯氨酸1.38g、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、琼脂7g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长(步骤4:选择步骤)(见图12-4)。然后，抗性愈伤组织转到再生培养基I (N6盐4g/L、N6维生素、L-脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、6_苄基腺嘌呤2mg/L、琼脂7g/L，双丙氨膦1.5mg/L，pH5.8)，25°C暗培养2-3周。在此阶段出现胚芽鞘(见图12-5)。在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物(步骤5:再生步骤)(见图12-6)。
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维生素、麦芽糖20g/L、葡萄糖10g/L、天冬酰胺0.15g/L、肌醇100mg/L、琼脂7g/L，pH5.8)上，25°C下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维生素、蔗糖20g/L、萘乙酸0.5mg/L、琼脂7g/L，pH5.8)上，25°C下培养至约1cm高，移至温室培养至结实(见图12-7和12-8)。在温室中，每天于28°C下光照培养16小时，再于20°C下黑暗培养8小时。
3.转基因玉米植株的PCR阳性鉴定
取温室培养的转化阳性候选玉米植株的叶片，用PlantGen DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用质粒载体特异引物Bar基因引物进行PCR鉴定，同时以非转基因玉米DNA作为阴性对照，以多控不育载体质粒作为阳性对照。
Bar基因引物序列如下:
01igol7 (Bar-F): 5’ - ctcgagtctaccatgagcccagaac
01igol8 (Bar-R): 5’ - ctcgagtcaaatctcggtgacgggca
图13为部分转基因植株的PCR鉴定。从图13可以看出，在检测的转多控不育载体的21株转基因候选株中，有13株是转化阳性植株。
4.转基因植株在RNA水平的鉴定随机挑取8株温室培养的转化多控不育载体的阳性候选植株分别提取DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA。用上述Bar基因引物对DNA和cDNA分别进行PCR扩增。玉米actin基因作为内标参照基因，引物序列如下:
01igl9 (Actin-F): 5’ - AAATGACGCAGATTATGTTTGA01igo20 (Actin-R): 5’ - GCTCGTAGTGAGGGAGTACC
图14-A和14-B表明随机检测的8株植株，其基因组DNA和RNA水平上的阳性结果一致，表明在DNA水平检测阳性的植株都有除草剂抗性基因的表达。
5.Real time PCR验证转基因玉米植株
取上述DNA水平和RNA水平检测为阳性的转基因玉米植株Ms7(T。)的叶片约10mg作为样品，用PlantGen DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Bar基因和IVR基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
检测BAR基因和IVR基因拷贝数的具体方法如下:
取转基因玉米植株Ms7 (TO)和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
使用PlantGen DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其广品说明书；
用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定上述样品的基因组DNA浓度；
调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/ μ I ;采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是:
以下引物和探针用来检测BAR基因序列:
01igo21:5’ - TCACTCGGGATGACGATGG ；
01igo22:5’ - TGCCACCAGACAGTGTCCG ；
Probel:5’ - ccgagccgcaggaaccgcaggag (焚光基团 5’ 6-FAM;萍灭基团 3’ TAMRA)； 以下引物和探针用来检测IVR基因序列:
01igo23:5’ - TGGCGGACGACGACTTGT ；
01igo24:5’ - AAAGTTTGGAGGCTGCCGT ；
Probe2:5，- CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC (荧光基团 5’ CY5;淬灭基团 3，BHQ-2)；PCR 反应体系为:25 μ I 2 XGoldStar TaqMan Mixture (With ROX) ；1 μ I ForwardPrimer, 10 μΜ (终浓度 0.2 μ Μ) ； I μ I Reverse Primer, 10 μΜ (终浓度 0.2 μ Μ) ； I μ IProbe，10 μΜ ；2 μ I Template D