转座子Tn7左右臂盒子，多克隆位点以及Τη7转座酶TnsAB⑶片段的转座整合质粒，命名为ρΝΚΤΝ701。
[0045]9、克隆Ρ43启动子，amyQ信号肽和木聚糖酶基因并插入pNKTN701:以含有amyQ信号肽的菌株，如南宁新科健生物技术有限责任公司保藏的菌株 Bacillus amyloliquefaciens 为模板，用引物 Bglll-amyQSPFOR:gAAgATCTATGATTCAAAAACGAAAGCGGAC，和引物 Sall-amyQSPRE:TACGCGTCGACTACGGCTGATGTTTTTGTAATCG，PCR扩增amyQ信号肽片段，将PCR产物跑胶，回收约10bP的片段；用BglII和SalI酶切PCR产物，纯化；与含有P43启动子的pHY-P43质粒5.1kb BglI1-SalI片段连接，转化到大肠杆菌E.coli DH5alpha ;用BglII和SalI双酶切验证转化子，选择得到5.1kb和0.1kb两条带的转化子，即构建得到含有P43启动子和amyQ信号肽大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHY-P43amyQSP ;从南宁新科健生物技术有限责任公司保藏的质粒pNKxyl上用SalI和BamHI双酶切回收Ikb木聚糖酶基因，与pHY_P43amyQSP质粒5.2kb Sal1-BamHI片段连接，转化到大肠杆菌E.coli DH5alpha ;用Sail和BamHI双酶切验证转化子，选择得到5.2kb和Ikb两条带的转化子，即构建得到含有P43启动子-amyQ信号肽-木聚糖酶基因的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHY-P43amyQSPxyl ;将pHY_P43amyQSPxyl用BglI1-BamHI双酶切并用Klenow填平两端，之后回收P43启动子-amyQ信号肽-木聚糖酶基因片段；将整合质粒PNKTN701进行Sma I单酶切和去磷酸化，连接到P43启动子-amyQ信号肽-木聚糖酶基因片段；连接产物转化到E.coli DH5alpha，经快检验证得到正确连接产物；
[0046]10、将步骤9的连接产物转化到枯草芽孢杆菌宿主WB800，在28°C的含氯霉素LB平板上培养过夜，获得氯霉素抗性菌株，将该菌株在不含氯霉素、含有0.1%阿拉伯糖的LB液体培养基中28°C培养过夜，诱导P43启动子-sacB信号肽-β -葡聚糖酶基因片段定点转座整合到枯草芽孢杆菌glms基因下游3’端的attTn7位点。
[0047]11、将步骤10的过夜培养物稀释涂布在不含氯霉素，含有0.1 %葡萄糖的LB平板，转到35 °C培养至长出单菌落。
[0048]12、挑取步骤11的重组枯草芽孢杆菌单菌落，接种到不含氯霉素的LB液体培养基中，37°C，220r/min培养36小时，10000r/min离心5分钟，取上清液测定木聚糖酶活力。木聚糖酶活力的测定按以下方法进行:吸取1.0ml经过适当稀释的酶液(用蒸馏水作适当稀释，经85°C平衡)，加入到刻度试管中，再加入3.0ml木聚糖(3%，经85°C平衡)及6.0mlTris缓冲液(0.lmol/L, pH8.0)，电磁振荡3s，85°C保温反应lOmin，置冰水浴2min终止反应，混匀，吸取1.0ml溶液至1ml具塞试管，加入1.0ml DNS试剂(甲液:称取6.9g结晶酚溶于15.2ml 10%的NaOH溶液，用蒸馏水稀释至69ml，再加入6.9g亚硫酸氢钠；乙液:称取255g酒石酸钾钠溶于300ml 10 %的NaOH溶液，再加入880ml I %的3，5- 二硝基水杨酸溶液；甲液和乙液混合得黄色试剂贮于棕色瓶内，室温下避光放置7天后作标准曲线(每次配制后要重新作标准曲线))，电磁振荡3s，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至10.0ml,电磁振荡3s。以灭活后的样品溶液代替样品溶液为空白对照，在540nm处测定吸光度。木聚糖酶活力的定义为:在85°C，pH值8.0条件下，每分钟水解3%木聚糖生成Iymol木糖的酶量为一个酶活力单位(U)。该批次测到木聚糖酶活力为3.2-18.0U/ml的菌落即为获得的转座整合重组枯草芽孢杆菌表达菌株。
【主权项】
1.一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于:是通过构建一种用于在枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌，通过诱导产生Τη7转座酶TnsABCD，将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点；通过变温培养，将培养温度从26-30°C提高到33-37°C，使转整合表达质粒上的温度敏感复制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7转座酶的转座整合质粒的重组枯草芽孢杆菌；将菌落转到不含抗生素的液体营养培养基上培养，能表达出活性蛋白质的菌株即为所需的转座整合表达外源蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌，所述的营养培养基是常规的发酵营养培养基，包括蛋白胨或水解蛋白I?50g/L，酵母提取物I?25g/L，氯化钠I?15g/L。2.根据权利要求1所述的一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于:利用Τη7转座元件将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌，该方法的步骤为:构建一种用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌，通过诱导产生Τη7转座酶TnsABCD，将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点；所述Tn7转座酶TnsABCD是用来识别和剪切Τη7转座片段、识别attTn7转座位点和促使Tn7转座片段插入到该位点。上述的Τη7转座酶TnsABCD可以用阿拉伯糖操纵子，包括抑制子araC和启动子Pbad来诱导表达，或用乳糖操纵子，包括阻遏基因lacl，操纵基因IacO和启动子IacP来诱导表达； 所述用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，包含有下列组分:能在大肠杆菌中复制质粒的复制子和能在枯草芽孢杆菌中复制质粒的温敏复制子，含有抗生素抗性基因、转座子Tn7左右臂盒子、多克隆位点、Τη7转座酶TnsAB⑶片段及其诱导表达元件； 所述能在大肠杆菌中复制质粒的复制子是pBR322ori，或colElori ;所述可用于枯草芽孢杆菌中复制质粒的温敏复制子是pWV01ori/ts，其特点是在28°C左右可以行使复制功能，但在35°C左右时失去复制能力； 所述可在枯草芽孢杆菌中使用的抗生素抗性基因是氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因，该抗生素抗性基因克隆于Tn7左臂和右臂之外，在转座重组时不会被转座整合到枯草芽孢杆菌染色体上； 所述的用于枯草芽孢杆菌转座整合表达的外源蛋白基因，是酶、抗菌肽活性蛋白质基因；所述的外源蛋白基因的表达元件，包括以下组分:能在枯草芽孢杆菌中高效转录的启动子如Ρ43启动子，或Pamy启动子；高效分泌的信号肽片段如sacB信号肽片段，或amyQ信号肽片段；所述的外源蛋白基因及其表达元件克隆于Tn7左臂和右臂之间的多克隆位点；所述的用于转座整合的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌168衍生菌株如1Α751，WB600, WB800。
【专利摘要】本发明公开了一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，具体是构建含有抗生素抗性基因、转座子Tn7左右臂盒子、多克隆位点以及Tn7转座酶TnsABCD片段，以及含有大肠杆菌复制子pBR322？ori和枯草芽孢杆菌温敏复制子的转座整合表达质粒；将枯草芽孢杆菌启动子、信号肽、外源蛋白基因等表达元件插入该转座整合表达质粒，转化到枯草芽孢杆菌宿主，使外源蛋白基因整合到枯草芽孢杆菌glms基因下游3’端的attTn7位点进行表达；并通过变温培养使质粒上的温度敏感复制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7转座酶的整合质粒的重组枯草芽孢杆菌。本发明的优点是获得稳定的外源基因转座整合，并且重组菌不含抗生素抗性基因，达到食品安全要求。
【IPC分类】C12N15/75
【公开号】CN105063078
【申请号】CN201510467499
【发明人】周礼芹, 蒙健宗, 徐月梅, 成春燕
【申请人】南宁市新科健生物技术有限责任公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月3日