入到LB液体培养基中37°C摇菌14-16h，通过茵液PCR检测所挑菌落是否为 阳性，将阳性菌液送去测序；
[0040] S13、选择测序结果正确的菌液提取质粒，通过Kpnl和Smal双酶切回MRF4片段；
[0041] S14、通过Kpnl和Smal双酶切置换CMV。
[0042] 步骤S2具体包括如下步骤：
[0043] S21、根据肌肉特异性启动子MRF4序列设计引物，并在MRF4序列两端添加EcoRI 和BamHI酶切位点及保护碱基；
[0044] S22、通过PCR.扩增得到MRF4片断，
[0045] S23、将所得的MRF4片断进行测序，得片断大小为1027bp ;
[0046] S24、通过EcoRI和BamHI酶切所得的MRF4片断，置换U6 ;
[0047] 所述步骤S3具体包括如下步骤：
[0048] S31、根据本实验室设计的FAD3人源化片段序列设计引物，并在FAD3人源化片段 两端添加Smal和Notl酶切位点及保护碱；
[0049] S32、通过PCR技术从构建的重组载体上获得FAD3片断；
[0050] S33、将所得FAD3片断进行测序，得片断大小1342bp ;
[0051] S34、将所得的FAD3片断经Smal和Notl酶切，置换FSTN ;
[0052] 所述步骤S4具体包括如下步骤：
[0053] S41、设计IRES的特异性引物（Anti-sense Notl、MIuI两个酶切位点，以便下游连 接）；
[0054] S42、通过PCR技术从构建的重组载体上获得IRES片断；
[0055] S43、将得到IRES片断进行测序，得IRES片断的大小为608bp ;
[0056] S44、将IRES片断与FAD3的下游无缝连接；
[0057] 所述步骤S5具体包括如下步骤：
[0058] S51、根据DsRed序列设计引物，并在DsRed两端添加Notl和MIuI酶切位点及保 护碱基；
[0059] S52、通过PCR技术从重组载体上获得DsRed片断；
[0060] S53、将所得的DsRed片断进行测序，得片断大小为691bp ;
[0061] S54、将所得的DsRed片断经Notl和MIuI酶切，连入IRES的下游，得质粒载体pM AR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed〇
[0062] 所述步骤S6具体包括如下步骤：
[0063] S61、对鉴定正确的 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed 载体在含有卡那霉 素的液体LB培养基中培养并提质粒；
[0064] S62、通过 Xho I 和 AfIII 对质粒载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed 进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-sh RNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40 polyA。
[0065] 本发明具有以下有益效果：
[0066] 首次把RNA干扰技术与肌肉特异过表达FAD3、DsRed结合，实现了敲减与反向过表 达相关基因同时进行，为安全高效地改善多基因控制的性状如肌肉、疾病相关性状等提供 新的思路和途径。
【附图说明】
[0067] 图1为本发明实施例一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-M RF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA的结构示意图。
[0068] 图2是本实验室构建的初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN结构示意图。
[0069] 图 3 是载体 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN 结构示意图。
[0070] 图4是载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN质粒结构示意图。
[0071] 图 5 是载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-结构示意图。
[0072] 图 6 是载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES 结构示意图。
[0073] 图 7 是载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed 结构示意图。
[0074] 图8是MRF4置换CMV后对pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN载体的酶切鉴定。
[0075] 图9是MRF4置换U6后对pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN载体的酶切鉴定。
[0076] 图 10 是 FAD3 置换 FSTN 后对 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3 载体的酶切鉴定。
[0077] 图 11 是 IRES 连入 FAD3 后对 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES 载体的菌落 PCR 鉴定。
[0078] 图 12 是 IRES 连入 FAD3 后对 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES 载体的测序鉴定。
[0079] 图 13 是 DsRed 连入 IRES 之后对 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed 载体 的酶切鉴定。
[0080] 图 14 是 pMAR-MRF4-shRNA-MRF4-FAD3-IRES-DsRed 质粒用 Xhol、Aflll 进行双酶 切回收即获得三顺反子表达盒三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体酶切电泳图。
[0081] 图15是Real-time PCR检测实验组与对照组中MSTN表达情况，结果显示MSTN基 因在肌肉卫星细胞中表达量下调，下调率为61 %。
[0082] 图16是FAD3基因在牛胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞中的表达具有显著性差 异，在肌肉卫星细胞中的表达量是在成纤维细胞中的4. 9倍。
[0083] 图17是肌卫星细胞DsRed表达图片。
[0084] 图18是成纤维细胞DsRed表达图片。
[0085] 图19是DsRed基因在1 :肌肉卫星细胞；2 :成纤维细胞；3 :水对照中RT-PCR电泳 图。
【具体实施方式】
[0086] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0087] 本发明实施例提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的基因序列 为：SEQ ID N0 :13,如图1所示，所述基因转移体从Y端起到Y端止包括MARs牛核基质 结合区、以牛肌肉抑素（MSTN)第三号外显子（926-947位点）为靶点的小发夹RNA(shRNA)、 MRF4、MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部 核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因、SV40polyA为终止信号区。该独立基因转移体 无原核主干载体序列。
[0088] 所述置换CMV的肌肉特异性启动子MRF4的序列为SEQ ID N0 :9 ;根据"肌肉特组 织特异性启动子生物信息学设计路线"最终优化的MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶 切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
[0089] 所述置换U6的MRF4的序列为SEQ ID N0 :9 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0090] MRF4-F 正义链，5，到 3' ：SEQ ID N0 :1 ;
[0091] MRF4-R 反义链，5，到 3' ：SEQ ID NO :2。
[0092] 所述FAD3的序列为SEQIDNO:10 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0093] FAD3-F 正义链，5，到 3' ：SEQ ID N0 :3 ;
[0094] FAD3-R 反义链，5，到 3' ：SEQ ID NO :4。
[0095] 所述IRES的序列为SEQ ID NO :11 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0096] IRES-F 正义链，5'到 3' ：SEQ ID N0 :5 ;
[0097] IRES-R 反义链，5'到 3' ：SEQ ID NO :6。
[0098] 所述DsRed基因为SEQ ID NO : 12 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0099] DsRed-F 正义链，5'到 3' ：SEQ ID N0 :7 ;
[0100] DsRed-R 反义链，5'到 3' ：SEQ ID NO :8。
[0101] 本发明实施例还提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方 法，包括如下步骤：
[0102] S1、人工合成MRF4置换初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN中的CMV，获得 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN，具体的：
[0103] S11、根据"肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线"最终优化的MRF4序 列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合 成。
[0104] S12、质粒提取具体步骤如下：
[0105] a、收集菌液于1.5ml EP管中，12000rpm离心lmin，弃上清，进行多次，直至收集完 毕。
[0106] b、加入250 y 1重悬液，吹吸，将沉淀混匀。
[0107] c、加入250 y 1裂解液，轻轻颠倒4-6次。
[0108] d、加入350 y 1中和液，反复颠倒4-6次；14000rpm离心5min。
[0109] e、将上清移至吸附柱中，静置lmin，使其充分吸附，14000rpm离心lmin。f、弃废 液，加入500 y 1洗涤液，14000rpm离心30_60s。
[0110] g、重复步骤f。
[0111] h、弃废液，空转lmin。
[0112] i、将柱子转移到新的EP管中，加入30-5-ul无菌水，静置2min，离心2min。
[0113] j、测 0D 值。
[0114] S13、M