RF4片段通过Kpnl和Smal双酶切回收，酶切体系如下：
[0115]
[0116] 胶回收步骤如下：
[0117] a、将目的条带切下来放入1. 5mL离心管中，加入350 y L的膜结合液，65°C融化胶 10-20min〇
[0118] b、室温冷却将液体转移到柱子上，静置2min。14000rpm离心2min。
[0119] c、弃废液，加入700 y L膜洗脱液，14000rpm离心lmin。
[0120] d、弃废液，加入500 y L膜洗脱液，14000rpm离心5min。
[0121] e、弃废液，空转lmin。
[0122] f、将柱子转入心离心管，加30-50 yL无酶水，静置2min，离心lmin。
[0123] g、测 0D值。
[0124] S14、pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN 载体的构建，通过 Kpnl 和 Smal 双酶切置换 CMV。
[0125] 将本实验室已构建的鉴定正确的双顺反子pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN载体（作为 初始载体，如图2所示）的菌液在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养，并提取质粒。将 含人工合成MRF4的19T-MRF4茵液在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，并提取质 粒。初始载体和19T-MRF4两种质粒分别用Kpnl、Smal进行双酶切、胶回收、连接、转化、挑 菌、摇菌、提质粒、酶切验证（如图8所示）正确，获得pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN载体。如 图3所示。
[0126] S2、用克隆的 MRF4 置换 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN 中的 U6，得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN，具体包括如下步骤：
[0127] S21、引物的设计
[0128] 根据肌肉特异性启动子MRF4序列设计引物，两端添加EcoRI和BamHI酶切位点及 保护碱基，通过如下引物进行PCR获得：
[0129] MRF4-F 正义链，5，到 3' ：SEQ ID N0 :1 ;
[0130] MRF4-R 反义链，5，到 3' ：SEQ ID NO :2。
[0131] PCR反应体系
[0132]
[0133] S22、PCR 反应条件
[0134]
[0135] 通过这个反应可得到MRF4片断，
[0136] S23、测序
[0137] 胶回收该片段，连接到PMD19T-vector上（Solution I 5 y 1+目的片段 4yl+PMD19T-vector lyl 16°C过夜连接），转化E. coli DH5 a感受态细胞，涂平板过夜， 挑菌并摇菌，菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，将阳性茵液一部分送测序，一部分保菌待 用。经测序片断大小l〇27bp。
[0138] S24、选择测序结果正确的菌液进行提质粒。对所提质粒进行两种质粒 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN和19T-MRF4分别用EcoRI、BamHI进行双酶切、胶回收、连接、转 化、挑菌、摇菌、提质粒、并进行酶切鉴定，以确保外源基因正确置入，鉴定结果如图9所示， 并获得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN 载体，如图 4 所示。
[0139] S3、pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3 载体的构建，具体步骤如下：
[0140] FAD3基因的克隆与测序，通过PCR技术从本实验室构建的重组载体上获得。
[0141] (1)引物的设计
[0142] 根据本实验室设计的FAD3人源化片段序列设计引物，两端添加Smal和Notl酶切 位点及保护碱基，通过如下引物进行PCR获得：
[0143] FAD3-F 正义链，5，到 3，：SEQ ID N0 :3 ;
[0144] FAD3-R 反义链，5，到 3' :SEQ ID NO :4。
[0145] (2) PCR反应体系
[0146]
[0147] (3)PCR反应条件
[0148]
[0149] 通过这个反应可得到FAD3片断。
[0150] (4)测序
[0151] 胶回收该片段，连接到PMD19T-vector上（Solution I 5 y 1+目的片段 4yl+PMD19T-vector lyl 16°C过夜连接），转化E. coli DH5 a感受态细胞，涂平板过夜， 挑菌并摇菌，菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，将阳性菌液一部分送测序，一部分保菌待 用。经测序片断大小为1342bp。
[0152] (5)选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提两种质粒 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN 和 19T-MRF4 分别用 SmaI、NotI 进行双酶切、胶回 收、连接、转化、挑菌、摇菌、提质粒，酶切验证，结果正确，如图10所示。并获得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3 载体，如图 4 所示。
[0153] S4、IRES 的克隆与 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES 载体构建。具体步骤是： IRES序列的克隆和测序，通过PCR技术从本实验室构建的重组载体上获得。
[0154] (1)引物设计
[0155] 根据TAKARA无缝拼接试剂盒（丨n-fusion? HD Cloning Kit)引物设计原则： 克隆引物包括目的片段特异性引物序列和重叠序列，设计引物。
[0156]IRES-F正义链，5'到 3，：SEQIDNO:5 ;
[0157]IRES-R反义链，5'到 3'：SEQIDNO:6。
[0158] (2)PCR反应体系
[0159]
[0160] (3)PCR的反应条件
[0161]
[0162] 通过这个反应可得到IRES片断。
[0163] (4)PCR克隆并胶回收的IRES质粒利用TAKARA无缝拼接试剂盒（丨n-fusi〇n? HD Cloning Kit)通过同源重组的方式进行连接、转化、挑取单克隆菌落、摇菌、送测序，测 序结果片断大小608bp。测序正确即获得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES载体。如图6 所示。PCR鉴定如图11所示。测序鉴定如图12所示.
[0164]S5、DsRed基因的克隆和测序与pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed的构 建，具体步骤是：
[0165] 通过PCR技术从本实验室构建的重组载体上获得。
[0166] (1)引物的设计
[0167] 根据DsRed序列设计引物，两端添加Notl和MIuI酶切位点及保护碱基，
[0168]IRES-F正义链，5'到 3，：SEQIDN0 :7 ;
[0169] IRES-R 反义链，5'到 3' ：SEQ ID NO :8。
[0170] (2)PCR反应体系
[0171]
[0172] (3)PCR反应条件
[0173]
[0174] 通过这个反应可得到DsRed片断；测序片断大小为691bp。
[0175] (4)将PCR克隆并测序正确的19T-DsRed菌液在含有氨苄青霉素的液体LB培养基 中培养，并提取质粒。将两种质粒pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES和19T-DsRed分别用 Notl、MIuI进行双酶切、胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌、提质粒，酶切验证正确，如图13所 示。并获得三顺反子 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed。如图 7 所示。
[0176] S6、如图 7 所示的质粒载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed 构建完毕 后，用XhoII、AfIII双酶切，通过双酶切的方法获得如图1所示的MAR-shRNA-MRF4-MRF4-F AD3-IRES-DsRed-SV40polyA三顺反子共表达基因转移体。具体步骤是：
[0177] (1)对鉴定正确的如图 7 所示的 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40p olyA载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒；
[0178] (2)用XhoI和AfIII对质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed进行 双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收获得如图1所示的MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA三顺反子共表达基因转移体，全序列见SEQIDN0:13.
[0179] 本发明MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA三顺反子肌肉特异 双向共表达基因转移体，其在细胞水平表达功能鉴定过程如下：
[0180] 牛胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞的冻存复苏与培养
[0181] 从液氮中取出冻存管，迅速在37°C水浴中将其融化，用移液器将细胞悬液移入到 15mL离心管中（提前加入5ml的新鲜培养液），室温下1500rpm/min离心5min，弃上清。 加入新鲜的培养液（牛胎儿成纤维细胞培养液为DMEM+10% FBS、肌肉卫星细胞培养液为 DMEM+10% FBS+10% HS)，将细胞吹打均匀，接种到合适的培养皿或细胞培养板中，于培养 箱（37°C，5% C02及饱和湿度）中培养。
[0182] 待牛胎儿成纤维细胞传代长满后，培养液去掉，用PBS洗两遍，加入适量的0. 05% 的胰蛋白酶，放入细胞培养箱中消化处理2-3min，于显微镜下观察细胞已经变圆后立即 加入两倍体积的细胞培养液终止消化。使细胞悬浮均匀后转移到离心管中，1500rpm/ min的条件下离心4min，此时细胞集中于离心管底部，小心将液体去除，加入适量冻存液 (DMEM : FBS : DMS0为7 : 2 : 1)，吹匀后移入冻存管。冻存管放入细胞程序冷冻盒，-80°C 过夜后转移到液氮罐中保存。三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体转染牛胎儿成纤维 细胞、肌肉卫星细胞
[0183] 通过电穿孔转染法将双酶切分离获得的三顺反子肌肉特异双向